葉酸-聚乙烯亞胺復(fù)合碳點(diǎn)的跨膜機(jī)制和胞內(nèi)分布

劉　杰，布文奐，趙　歡，李　杏，孟　琳，董　悅，孫宏晨

(1.吉林省口腔科學(xué)與技術(shù)納米工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林 長春 130021;2.吉林大學(xué)口腔醫(yī)院口腔病理科，吉林長春 130021;3.佳木斯大學(xué)口腔醫(yī)院正畸科，黑龍江 佳木斯 154007)

碳點(diǎn)(carbon dots, CDs)是一種新型的納米材料，具有尺寸較小、比表面積較大、表面活性良好和生物毒性較低等優(yōu)點(diǎn)，被越來越廣泛地應(yīng)用到生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。許多碳點(diǎn)具有光致發(fā)光的特點(diǎn)，可被用于生物傳感和生物成像中[1]。在轉(zhuǎn)基因治療領(lǐng)域，碳點(diǎn)作為一種非病毒載體，不易與染色體整合，免疫反應(yīng)少，易于制備，還具有細(xì)胞成像的功能，與病毒載體相比具有諸多優(yōu)勢[2]。目前針對納米材料跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)和胞內(nèi)分布的研究[3-4]較多，但是對碳點(diǎn)跨成骨細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)的機(jī)制和胞內(nèi)分布的研究尚未見報(bào)道，這可能是碳點(diǎn)作為一種基因載體在骨缺損治療中應(yīng)用的難點(diǎn)[5]。本實(shí)驗(yàn)以葉酸和聚乙烯亞胺(polyethelenimice,PEI)為原料，通過一步完成的水熱法合成熒光碳點(diǎn)，闡明碳點(diǎn)進(jìn)入小鼠前成骨細(xì)胞系MC3T3-E1的方式以及在細(xì)胞內(nèi)的分布，為碳點(diǎn)作為一種非病毒載體在轉(zhuǎn)基因治療中的應(yīng)用提供實(shí)踐基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1細(xì)胞系、主要試劑和儀器小鼠前成骨細(xì)胞系MC3T3-E1(Gibco公司，美國)。高糖DMEM培養(yǎng)基粉、胎牛血清(FBS)和青霉素-鏈霉素溶液(Gibco公司，美國)，4-羥乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)、胰蛋白酶粉劑、MTT粉劑、活性氧(ROS)染劑、葉酸和PEI(相對分子質(zhì)量為1 800)(Sigma-Aldrich公司，美國)，細(xì)胞器染劑和細(xì)胞凋亡試劑盒(Invitrogen公司，美國)，細(xì)胞周期試劑盒(七海生物公司，中國)。倒置熒光顯微鏡及照相系統(tǒng)(Olympus公司，日本)，酶標(biāo)儀(RT-6000，深圳雷杜生命科學(xué)技術(shù)有限公司)。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)MC3T3-E1細(xì)胞系培養(yǎng)在含有10%胎牛血清、100 U·mL-1青霉素和100 mg·L-1鏈霉素的高糖DMEM培養(yǎng)基中，在溫度為37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)，每2～3 d培養(yǎng)基換液。

1.3碳點(diǎn)制備稱取2 g葉酸溶于20 mL去離子水中，滴加1 mol·L-1的NaOH助溶，隨后向澄清的黃色溶液中加入3 mL的PEI(相對分子質(zhì)量為1 800)，于200℃無氧條件下反應(yīng)5 h，冷卻至室溫后3 000 r·min-1離心30 min，去上清，用0.22 μm的濾器抽濾去除較大的顆粒，隨后滲析3 d，每12～24 h換水，凍干后即可獲得粉末狀的葉酸-PEI復(fù)合碳點(diǎn)。

1.4MTT法檢測細(xì)胞增殖率將處于對數(shù)生長期的MC3T3-E1細(xì)胞系在胰酶消化后離心重懸，以每孔4 000個(gè)細(xì)胞的密度接種到96孔板內(nèi)，在37℃、5%CO2孵箱內(nèi)孵育24 h。然后換液使培養(yǎng)基中碳點(diǎn)的濃度為0、50、100、150、200、250、300、350、400和450 mg·L-1，每個(gè)劑量設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)置調(diào)零孔以減少誤差。分別培養(yǎng)24和48 h后在各孔加入20 μL的MTT液(5 000 mg·L-1)，37℃孵育4 h后棄去培養(yǎng)基，每孔加入150 μL二甲基亞砜(DMSO)并在搖床上混勻，酶標(biāo)儀在490 nm波長處檢測吸光度(A)值，并按照公式計(jì)算細(xì)胞增殖率。細(xì)胞增殖率=實(shí)驗(yàn)組A值/空白對照組A值×100%。

1.5流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期將處于對數(shù)生長期的MC3T3-E1細(xì)胞系在胰酶消化后離心重懸，以每孔8×104個(gè)細(xì)胞的密度接種至6孔板內(nèi)，在37℃、5%CO2孵箱內(nèi)孵育24 h。換液使碳點(diǎn)組碳點(diǎn)的濃度為100 mg·L-1，實(shí)驗(yàn)組和空白對照組各有3個(gè)復(fù)孔。24 h后胰酶消化并離心，PBS沖洗2次后用70%乙醇在4℃固定2 h以上，用含碘化丙啶和RNase A的染液37℃避光染色30 min，流式細(xì)胞儀檢測(激發(fā)波長488 nm，檢測紅色熒光)，以處于各周期細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)的百分比來表示結(jié)果。

1.6流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡將處于對數(shù)生長期的MC3T3-E1細(xì)胞系在胰酶消化后離心重懸，以每孔8×104個(gè)細(xì)胞的密度接種至6孔板內(nèi)，在37℃、5%CO2孵箱內(nèi)孵育24 h。將MC3T3-E1細(xì)胞系分為空白對照組、葉酸組和碳點(diǎn)組。換液使碳點(diǎn)組碳點(diǎn)的濃度為100 mg·L-1，實(shí)驗(yàn)組和空白對照組各有3個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)置3個(gè)其他的孔來幫助流式設(shè)門。24 h后胰酶消化并離心(使用原來含血清的培養(yǎng)基終止胰酶消化以保留培養(yǎng)基中未貼壁的細(xì)胞)，PBS沖洗后使用碘化丙啶和Annexin Ⅴ-FITC對細(xì)胞進(jìn)行染色，30 min內(nèi)流式細(xì)胞儀檢測，Annexin Ⅴ-FITC為綠色熒光，碘化丙啶為紅色熒光。以正常細(xì)胞、壞死細(xì)胞、早期凋亡和晚期凋亡細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)的百分構(gòu)成比來表示。

1.7流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞ROS水平將處于對數(shù)生長期的MC3T3-E1細(xì)胞系在胰酶消化后離心重懸，以每孔8×104個(gè)細(xì)胞的密度接種至6孔板內(nèi)，在37℃、5%CO2的孵箱內(nèi)孵育24 h。換液使葉酸組和碳點(diǎn)組濃度均為100 mg·L-1，各組均設(shè)有3個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)置1個(gè)未染色的孔來消除細(xì)胞背底熒光的干擾，染色后上流式細(xì)胞儀通過FITC通道來檢測熒光強(qiáng)度。以葉酸組和碳點(diǎn)組熒光強(qiáng)度與空白對照組熒光強(qiáng)度的比值來表示細(xì)胞ROS水平。

1.8顯微細(xì)胞成像將處于對數(shù)生長期的MC3T3-E1細(xì)胞系在胰酶消化后離心重懸，以每孔8×104個(gè)細(xì)胞的密度接種至放置有蓋玻片的6孔板內(nèi)，在37℃、5%CO2的孵箱內(nèi)孵育24 h。換液使碳點(diǎn)的終濃度為100 mg·L-1，在37℃、5%CO2的孵箱里再繼續(xù)孵育4 h， PBS沖洗后用4%甲醛37℃固定15 min，應(yīng)用倒置熒光顯微鏡使用紫外光激發(fā)進(jìn)行觀察和拍照。統(tǒng)一碳點(diǎn)的濃度為80 mg·L-1，各組分別共孵育0、15、30、60、120和240 min后用PBS沖洗，并用4%甲醛37℃固定15 min，應(yīng)用倒置熒光顯微鏡觀察和拍照。

1.9檢測碳點(diǎn)內(nèi)吞的途徑將處于對數(shù)生長期的MC3T3-E1細(xì)胞系在胰酶消化后離心重懸，以每孔8×104個(gè)細(xì)胞的密度接種到放置有蓋玻片的6孔板內(nèi)，在37℃、5%CO2孵箱內(nèi)孵育24 h。設(shè)置陰性對照組(無碳點(diǎn))和空白對照組(100 mg·L-1的碳點(diǎn))，每組3個(gè)復(fù)孔，同時(shí)利用制霉菌素抑制胞膜窖途徑[6]和諾考達(dá)唑抑制巨胞飲作用[7]，4℃孵育來抑制能量依賴性的內(nèi)吞作用，無血清條件下預(yù)處理45 min后加入碳點(diǎn)和血清使碳點(diǎn)終濃度為100 mg·L-1，再孵育1 h后胰酶消化、離心重懸并上流式細(xì)胞儀檢測藍(lán)色熒光強(qiáng)度。以碳點(diǎn)加各種抑制劑組碳點(diǎn)的細(xì)胞攝取率與空白對照組碳點(diǎn)的細(xì)胞攝取率的比值來表示結(jié)果。

1.10檢測碳點(diǎn)在細(xì)胞內(nèi)的定位將處于對數(shù)生長期的MC3T3-E1細(xì)胞系在胰酶消化后離心重懸，以每孔8×104個(gè)細(xì)胞的密度接種到放置有蓋玻片的6孔板內(nèi)，在37℃、5%CO2孵箱內(nèi)孵育24 h。換液使碳點(diǎn)終濃度為100 mg·L-1，共孵育1 h后換液，然后對各細(xì)胞器進(jìn)行染色。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)在37℃染色30 min后在37℃、4%甲醛中固定2 min；線粒體在37℃染色30 min后在37℃、4%甲醛中固定15 min；溶酶體在37℃染色60 min后在37℃固定15 min；高爾基體在37℃、5%CO2孵箱孵育過夜染色(≥16 h)后于室溫用4%甲醛固定30 min。PBS沖洗后上熒光倒置顯微鏡觀察拍照，藍(lán)色熒光的是碳點(diǎn)，紅色熒光表示各細(xì)胞器，紫色熒光表示碳點(diǎn)分布至相應(yīng)細(xì)胞器上。

2　結(jié)　果

2.1碳點(diǎn)的細(xì)胞毒性和細(xì)胞增殖率在MTT實(shí)驗(yàn)中，與空白對照組比較，不同濃度碳點(diǎn)組在24 h時(shí)未表現(xiàn)出細(xì)胞毒性，100～450 mg·L-1碳點(diǎn)組細(xì)胞增殖率差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；當(dāng)碳點(diǎn)濃度達(dá)到450 mg·L-1時(shí)，細(xì)胞增殖率仍高于空白對照組(P<0.05)；在48 h時(shí)間點(diǎn)時(shí)，隨著碳點(diǎn)濃度的增加，細(xì)胞增殖率先增高后降低，當(dāng)碳點(diǎn)濃度達(dá)到350 mg·L-1時(shí)，細(xì)胞增殖率僅有空白對照組的68.4%(P<0.05)，表現(xiàn)出明顯的細(xì)胞毒性。細(xì)胞周期檢測結(jié)果顯示：與空白對照組比較，100 mg·L-1碳點(diǎn)組細(xì)胞共孵育后24 h細(xì)胞從G0期和G1期向S期轉(zhuǎn)變增加，并且G2期和M期細(xì)胞比例也升高。見表1和2。

表1各組MC3T3-E1細(xì)胞增殖率

GroupProliferationrate(t/h)　2448Blankcontrol100．00±9．28100．00±7．36CDs(mg·L-1)　50107．16±3．56117．84±0．75?　100123．78±2．09?171．37±4．81?　150134．10±9．31?146．86±9．19?　200149．86±13．89?146．08±6．53?　250163．61±17．74?112．94±9．04　300143．27±12．24?92．16±10．44　350126．65±6．91?68．63±12．64?　400120．63±4．71?68．14±23．84?　450122．92±2．87?67．55±4．20?

*P<0.05 compared with blank control group.

表2各組MC3T3-E1細(xì)胞在不同細(xì)胞周期的百分比

GroupPercentageofcellsG0andG1phaseSphaseG2andMphaseBlankcontrol44．25±0．6039．62±0．5114．60±0．35CDs41．82±1．40?41．07±0．45?15．54±1．10

*P<0.05 compared with blank control group.

2.2熒光碳點(diǎn)的顯微細(xì)胞成像碳點(diǎn)被紫外光激發(fā)可以發(fā)射藍(lán)色熒光，因此可被用于細(xì)胞成像，并且在相同的曝光時(shí)間內(nèi)藍(lán)色熒光的熒光強(qiáng)度越高，表示有越多的碳點(diǎn)被細(xì)胞攝取。碳點(diǎn)被細(xì)胞攝取后主要分布在細(xì)胞質(zhì)中，能夠較好地顯示細(xì)胞的形態(tài)。見圖1(插頁四)。

2.3細(xì)胞攝取碳點(diǎn)的途徑抑制劑實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：陰性對照組無碳點(diǎn)，因此幾乎檢測不到熒光，攝取率幾乎為0；空白對照組有碳點(diǎn)但未應(yīng)用抑制劑，相對攝取率為100%；當(dāng)采用胞膜窖的抑制劑制霉菌素作用于細(xì)胞時(shí)，與空白對照組比較，制霉菌素組細(xì)胞攝取碳點(diǎn)量減少(P<0.05)；當(dāng)用巨胞飲的抑制劑諾考達(dá)唑抑制巨胞飲途徑時(shí)，細(xì)胞攝取碳點(diǎn)的量也減少，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；當(dāng)將細(xì)胞置于4℃以抑制能量依賴性的內(nèi)吞途徑時(shí)，與空白對照組比較，細(xì)胞攝取碳點(diǎn)量明顯減少(P<0.05)，但尚有碳點(diǎn)能夠被細(xì)胞攝取。各組MC3T3-E1細(xì)胞攝取碳點(diǎn)的定量分析結(jié)果見圖2。

圖2　各組MC3T3-E1細(xì)胞攝取碳點(diǎn)的定量分析

Fig.2Quantitative analysis of CDs uptaken in MC3T3-E1 cells in various groups

2.4碳點(diǎn)在細(xì)胞內(nèi)的分布碳點(diǎn)被紫外光激發(fā)可以發(fā)射藍(lán)色熒光，各細(xì)胞器的染色劑在綠光激發(fā)下可以發(fā)射紅色熒光，當(dāng)藍(lán)色熒光與紅色熒光重疊產(chǎn)生紫色熒光時(shí)，可以說明碳點(diǎn)在細(xì)胞器上分布的情況[8-10]。倒置熒光顯微鏡下觀察：碳點(diǎn)的藍(lán)色熒光與線粒體的紅色熒光較好重疊，提示碳點(diǎn)能夠在線粒體上較多地分布；碳點(diǎn)的藍(lán)色熒光與溶酶體的紅色熒光較好重疊，提示碳點(diǎn)能夠在溶酶體上較多地分布；碳點(diǎn)的藍(lán)色熒光與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的紅色熒光不完全重疊，提示碳點(diǎn)能夠在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上分布；碳點(diǎn)的藍(lán)色熒光與高爾基體的紅色熒光重疊得較差，提示碳點(diǎn)在高爾基體上分布較少或者細(xì)胞內(nèi)高爾基體的數(shù)量較少。見圖3(插頁四)。

2.5各組MC3T3-E1細(xì)胞凋亡率空白對照組細(xì)胞構(gòu)成比：正常細(xì)胞98.45%，早期凋亡細(xì)胞0.53%，晚期凋亡細(xì)胞0.37%，壞死細(xì)胞0.65%；葉酸組細(xì)胞構(gòu)成比：正常細(xì)胞98.07%，早期凋亡細(xì)胞0.73%，晚期凋亡細(xì)胞0.41%，壞死細(xì)胞0.79%；碳點(diǎn)組細(xì)胞構(gòu)成比：正常細(xì)胞98.52%，早期凋亡細(xì)胞0.37%，晚期凋亡細(xì)胞0.33%，壞死細(xì)胞0.77%。與空白對照組比較， 葉酸組和碳點(diǎn)組MC3T3-E1細(xì)胞凋亡構(gòu)成比無明顯變化。見圖4。

A：Control group; B: Folic acid group; C: CDs group.

2.6各組細(xì)胞中ROS水平與空白對照組(100%)比較，葉酸組和碳點(diǎn)組細(xì)胞中ROS水平明顯降低(P<0.05)。葉酸組細(xì)胞中ROS水平下降到空白對照組的60.05%，碳點(diǎn)組細(xì)胞中ROS水平下降到空白對照組的42.78%。

3　討　論

創(chuàng)傷、感染、腫瘤、骨髓炎手術(shù)清創(chuàng)以及各種先天性疾病導(dǎo)致的骨缺損是臨床上常見的問題[11]，傳統(tǒng)療法存在諸多不足，因此尋找一種新型有效的治療方法非常必要[12]。轉(zhuǎn)基因方法治療骨缺損是當(dāng)前研究熱點(diǎn)，其中miRNAs對細(xì)胞增生、分化、凋亡和代謝均具有顯著影響[13-14]。單純基因不穩(wěn)定，極易被細(xì)胞內(nèi)酶降解，因此需要良好的基因載體保護(hù)基因到達(dá)相應(yīng)位置來發(fā)揮其功能。病毒作為傳統(tǒng)的基因載體，在多種細(xì)胞中顯示了較高轉(zhuǎn)染效率。然而，病毒存在的毒性和免疫原性等問題限制了其在轉(zhuǎn)基因治療中的應(yīng)用。碳點(diǎn)作為一種非病毒載體，表面具有多種功能基團(tuán)，易于修飾，可以通過不同的功能化改變其表面電荷，使其帶有正電，有利于結(jié)合帶負(fù)電的基因，保護(hù)基因不被降解，同時(shí)也有助于與帶負(fù)電的細(xì)胞膜表面結(jié)合，促進(jìn)治療基因進(jìn)入細(xì)胞[15]。碳點(diǎn)攜帶促成骨基因用于骨損傷治療，可以保護(hù)基因不被生物系統(tǒng)中的酶降解、避免病毒引起的免疫原性，增強(qiáng)治療效果。

作為一種基因載體，碳點(diǎn)跨細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)的途徑和胞內(nèi)分布對基因在細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)歸有著十分重要的意義[10]。目前關(guān)于納米粒子跨膜機(jī)制和胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)的研究較多。細(xì)胞攝取納米粒子的途徑較多，但都是基于細(xì)胞膜內(nèi)陷形成的細(xì)胞內(nèi)囊泡而實(shí)現(xiàn)的。細(xì)胞通過形成的囊泡來包繞納米粒子，進(jìn)而將其轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞內(nèi)，這種能量依賴性的內(nèi)吞途徑主要包括吞噬作用、網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的胞飲作用、小窩蛋白介導(dǎo)的胞飲作用(胞膜窖)和巨胞飲作用[16-17]。細(xì)胞內(nèi)常見的細(xì)胞器有內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體、溶酶體和高爾基體，不同的細(xì)胞器在細(xì)胞的代謝以及發(fā)揮生物功能中發(fā)揮著不同的作用。因此，明確碳點(diǎn)內(nèi)吞的途徑以及其在細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)方式，對了解碳點(diǎn)作為一種基因載體在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮的作用具有重要的意義。但是碳點(diǎn)作為一種新型的納米粒子，目前少有這方面內(nèi)容的報(bào)道。

本研究以葉酸和PEI為原料，通過水熱法合成的碳點(diǎn)能夠在紫外光激發(fā)下發(fā)射藍(lán)色熒光，并能進(jìn)入細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞成像。碳點(diǎn)對細(xì)胞的毒性較小，在低濃度時(shí)具有一定的促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用，濃度較高時(shí)則能抑制細(xì)胞的增殖。此外碳點(diǎn)對細(xì)胞的凋亡無影響，還能顯著降低細(xì)胞中ROS水平。碳點(diǎn)能夠通過胞膜窖途徑和非能量依賴性途徑內(nèi)吞進(jìn)入細(xì)胞，然后分布到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體、溶酶體和線粒體這些細(xì)胞器上去。

綜上所述，本研究中的碳點(diǎn)生物相容性較好，不良反應(yīng)少，能通過多種途徑有效地進(jìn)入細(xì)胞，并能分布至各個(gè)細(xì)胞器上，為所載基因在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮生物學(xué)功能提供了理論基礎(chǔ)。碳點(diǎn)有潛力成為一種性能優(yōu)良的基因載體來應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因治療。

[參考文獻(xiàn)]

[1] Zhu S, Meng Q, Wang L, et al. Highly photoluminescent carbon dots for multicolor patterning, sensors, and bioimaging[J]. Angew Chem Int Ed Engl, 2013,52(14):3953-3957.

[2] Liu C, Zhang P, Zhai X, et al. Nano-carrier for gene delivery and bioimaging based on carbon dots with PEI-passivation enhanced fluorescence[J]. Biomaterials, 2012, 33(13): 3604-3613.

[3] Zhao F, Zhao Y, Liu Y, et al. Cellular uptake, intracellular trafficking, and cytotoxicity of nanomaterials[J]. Small, 2011, 7(10): 1322-1337.

[4] Liu P, Sun Y, Wang Q, et al. Intracellular trafficking and cellular uptake mechanism of mPEG-PLGA-PLL and mPEG-PLGA-PLL-Gal nanoparticles for targeted delivery to hepatomas[J]. Biomaterials, 2014, 35(2): 760-770.

[5] 董悅, 鄭嶸, 布文奐, 等. 碳點(diǎn)在成骨細(xì)胞系內(nèi)跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制的研究[J]. 北京口腔醫(yī)學(xué), 2017, 25(2): 71-75.

[6] Iversen TG, Skotland T, Sandvig K. Endocytosis and intracellular transport of nanoparticles: present knowledge and need for future studies[J]. Nano Today, 2011, 6(2): 176-185.

[7] Gao H, Yang Z, Zhang S, et al. Ligand modified nanoparticles increases cell uptake, alters endocytosis and elevates glioma distribution and internalization[J]. Sci Rep, 2013, 3: 2534.

[8] Zhang Z, Zhou L, Zhou Y, et al. Mitophagy induced by nanoparticle-peptide conjugates enabling an alternative intracellular trafficking route[J]. Biomaterials, 2015, 65: 56-65.

[9] Walker WA, Tarannum M, Vivero-Escoto JL. Cellular endocytosis and trafficking of cholera toxin B-modified mesoporous silica nanoparticles[J]. J Mater Chem B, 2016, 4(7): 1254-1262.

[10]Zhou N, Zhu S, Maharjan S, et al. Elucidating the endocytosis, intracellular trafficking, and exocytosis of carbon dots in neural cells[J]. RSC Adv, 2014, 4(107): 62086-62095.

[11]Dahlin C, Linde A, Gottlow J, et al. Healing of bone defects by guided tissue regeneration[J]. Plast Reconstr Surg, 1988, 81(5): 672-676.

[12]Desiderio V, Tirino V, Papaccio G, et al. Bone defects: Molecular and cellular therapeutic targets[J]. Int J Biochem Cell Biol, 2014, 51: 75-78.

[13]Doherty GJ, McMahon HT. Mechanisms of endocytosis[J]. Annu Rev Biochem, 2009, 78: 857-902.

[14]Pucadyil TJ, Schmid SL. Conserved functions of membrane active GTPases in coated vesicle formation[J]. Science, 2009, 325(5945): 1217-1220.

[15]布文奐, 唐琪, 辛穎, 等. 熒光碳點(diǎn)在疾病診治中的應(yīng)用[J]. 生命的化學(xué), 2015, 35(5): 609-614.

[16]Zhao F, Zhao Y, Liu Y, et al. Cellular uptake, intracellular trafficking, and cytotoxicity of nanomaterials[J]. Small, 2011, 7(10): 1322-1337.

[17]Iversen TG, Skotland T, Sandvig K. Endocytosis and intracellular transport of nanoparticles: present knowledge and need for future studies[J]. Nano Today, 2011, 6(2): 176-185.