• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    無綠藻PCR ITS1-ITS2基因分型法的建立及應用

    2018-03-30 03:18:18趙悅朱巍巍劉錦燕孟玲寧王玨婷李文靜項明潔
    中國真菌學雜志 2018年1期
    關鍵詞:綠藻分型基因組

    趙悅 朱巍巍 劉錦燕 孟玲寧 王玨婷 李文靜 項明潔

    (1.上海交通大學醫(yī)學院附屬瑞金醫(yī)院檢驗科,上海 200025;2.上海交通大學醫(yī)學院附屬瑞金醫(yī)院盧灣分院放免檢驗科,上海 200020)

    無綠藻 (Prototheca)作為一種3~30 μm的單細胞條件致病菌,通常情況下,定植于人體的指甲、皮膚、呼吸道和消化系統(tǒng)[1]。目前,生物學將無綠藻歸為:綠色植物界、綠藻門、Trebouxlophyceae綱、綠藻目、綠藻科、無綠藻屬。該屬包含6個種[2]:Protothecastagnora、Protothecaulmea、Protothecablashkeae[3-4]、Protothecawickerhamii、Protothecacutis[5]、Protothecazopfii[6],后4種對人和動物具有致病性。

    近年來,由于臨床免疫抑制治療,廣譜抗生素、皮質類固醇激素的大量使用和濫用以及艾滋病、接受器官移植[7]、干細胞移植[8]、白血病[9]、多發(fā)性骨髓瘤[10]、惡性腫瘤和糖尿病[2]患者的增多,無綠藻的感染率也逐年上升。因此,深入細致地研究無綠藻的分型方法,對研究無綠藻的致病性和流行病學特征具有十分重要的意義。

    ITS序列為內源轉錄間隔區(qū) (internal transcribed spacer region, ITS),位于真菌18S、5.8S和28S rRNA基因之間,分別為ITS 1和ITS 2,即18S rRNA-ITS1-5.8S rRNA-ITS2-28 S rRNA。在真菌中,5.8S、18S和28S rRNA基因具有較高的保守性,而ITS由于承受較小的自然選擇壓力,因而在絕大多數(shù)真核生物中表現(xiàn)出極為廣泛的序列多態(tài)性。同時,ITS的保守型表現(xiàn)為種內相對一致,種間差異明顯,可以將菌株鑒定至種、亞種。此外,由于ITS序列片段較小,易于分析,目前已被廣泛用于真菌不同種屬的系統(tǒng)發(fā)育分析。

    本實驗應用PCR ITS1-ITS2基因分型方法建立無綠藻菌株的ITS基因分型方法,并通過MEGA6.0軟件建立系統(tǒng)發(fā)育樹,比較不同菌株間的基因親緣性。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    實驗菌株共5株,其中1號菌株采自中國醫(yī)學科學院皮膚病醫(yī)院 (研究所)患者,2號菌株采自山東省皮膚病醫(yī)院,3號菌株來自華山醫(yī)院,4、5號菌株采自中山醫(yī)科大學附屬二院。

    本實驗涉及的測序引物見表1 (上海生工生物工程有限公司合成)。

    1.2 方法

    無綠藻菌株分離、純化及基因組DNA的抽提 將菌株接種于YPD固體培養(yǎng)基,有氧條件下于37℃培養(yǎng)48~72 h。待菌落出現(xiàn)后,分離純化。取適量菌落懸浮于500 mL蒸餾水中,按照改良版的堿裂解法抽提無綠藻基因組DNA。

    SSU rDNA PCR 反應體系總體積為50 μL,包括0.25 μL rTaq聚合酶 (5 U/μL, R001A, Japan, TaKaRa),5 μL 10×PCR緩沖液,4 μL 2.5 mmol/L dNTPs,0.2 μL引物 (50 μmol/L),及1 μL無綠藻基因組DNA。

    30個PCR反應條件為:94℃變性1 min,59℃退火1 min,72℃延伸2 min。PCR產物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠檢測,以DNA Marker為相對分子質量標記,電泳結果在紫外燈下觀察并照相記錄。

    表1 本實驗涉及的所有PCR引物

    ITS1-ITS2 PCR 反應體系總體積為50 μL,包括:1 μL KOD-plus聚合酶 (1 U/μL,Lot.32570h3, Japan, TOYOBO),5 μL 10×PCR緩沖液,5 μL 2 mmol/L dNTPs,1.5 μL引物 (10 μmol/L),3 μL MgSO4(25 mmol/L),2.5 μL 100%二甲亞砜 (dimethyl sulfoxide, DMSO)[13]及無綠藻基因組DNA (≤200 ng, ≥1 μL)。

    PCR反應條件為:98℃預變性10 min,冰浴5 min后加入1 μL KOD-plus聚合酶。之后進行30個PCR反應循環(huán):98℃變性10 s,55℃退火30 s,68℃延伸30 min。PCR產物觀察方法同上。

    DNA 堿基序列測定 ITS1、ITS2、SSU rDNA區(qū)域的PCR擴增產物進行純化及DNA堿基序列測定 (上海生工生物工程有限公司)。

    BLAST序列比對 通過BLAST X在線檢索工具將測定的SSU rDNA、ITS1、ITS2區(qū)域的DNA堿基序列與Genbank中的數(shù)據(jù)庫進行比對,找出與之相似的序列記錄,菌株的鑒定以最高分的菌種決定。

    系統(tǒng)發(fā)育樹繪制 利用MEGA 6.0軟件,采用相鄰連接法 (Neighbour-joining, NJ)構建系統(tǒng)發(fā)育樹,并對構建的樹進行自檢 (Bootstrap),重復次數(shù)設定為1 000次。由于無綠藻SSU rDNA的測序方法相對成熟,當ITS1、ITS2序列建立的系統(tǒng)發(fā)育樹與之相同時,證明ITS基因分型方法建立成功。

    2 結 果

    2.1 ITS1-ITS2 PCR

    以基因組DNA為模板,通過PCR反應,對ITS1和ITS2區(qū)擴增產物純化、測序后,得到相應大小的片段。電泳結果顯示,無綠藻ITS擴增片段的大小呈現(xiàn)一種菌種特異性,P.wickerhamii菌株的ITS1及ITS2區(qū)擴增片段均明顯大于P.zopfii(見圖1)。

    2.2 BLAST序列比對

    將測序得到的SSU rDNA、ITS1、ITS2序列與Genbank/EMBL/DDBJ數(shù)據(jù)庫中的已知菌株進行BLAST搜索比對。

    SSU rDNA序列比對結果顯示:1、2號菌株鑒定為P.zopfiiportoricensis(genotype 1),3號菌株鑒定為P.zopfiihydrocarbonea(genotype 2),4、5號菌株鑒定為P.wickerhamii。

    ITS1、ITS2序列比對與之相同,但由于目前無綠藻ITS基因分型方法尚未建立,缺乏有關P.zopfiiportoricensis的ITS基因序列,因而1、2號菌株暫無比對結果。

    但兩種方法中,P.zopfiiportoricensis(genotype 1)和P.zopfiihydrocarbonea(genotype 2)菌株的比對可靠性都較高,均大于90%,而P.wickerhamii菌株的比對差異較大[11],這一點與此前文獻的研究結果相符,可能由于P.wickerhamii菌株內部的變異性較大導致。

    2.3 系統(tǒng)發(fā)育樹

    在NCBI數(shù)據(jù)庫中,搜索已報道的無綠藻標準菌株的ITS1、ITS2、SSU rDNA序列,進行系統(tǒng)發(fā)育樹構建 (見圖2~4)。

    3 討 論

    近年來,隨著各種原因導致的免疫缺陷患者人數(shù)的增加,無綠藻的感染在全球有上升趨勢。截至2012年,全球已報告無綠藻病160例[14]。Chun-Ting Yeh等[2]通過對近3年教學醫(yī)院的16例無綠藻患者跟蹤研究發(fā)現(xiàn),該菌引起免疫低下患者的死亡率高達62.5%,且一般預后較差。此外,中型無綠藻基因2型可導致奶牛患乳腺炎,免疫抑制的小鼠、山羊和貓[13]、犬[15-16]的感染。

    由于無綠藻病的臨床癥狀缺乏特異性,加之又缺乏足夠的認識和有效的鑒別手段,因而該病的診斷率遠低于發(fā)病率。目前無綠藻常見的鑒定方法有:形態(tài)學及生化反應鑒定、genotype-special PCR、限制性片段長度多態(tài)性分析、SSU rDNA測序、LSU rDNA測序,質譜分析。然而,形態(tài)學及生化反應鑒定常因為各種因素而產生模棱兩可的結果,給無綠藻的鑒定帶來困難。genotype-special PCR和RFLP操作較為簡便,但只能鑒定P.zopfiigenotype1,P.zopfiigenotype2和P.blashkeae。此外,SSU rDNA測序、LSU rDNA的鑒別力明顯低于ITS鑒定。

    圖1ITS區(qū)PCR產物電泳結果:a.ITS1區(qū)域PCR產物;b.ITS2區(qū)域PCR產物 (1-4.1-4號菌株電泳結果,1-4a.1-4號菌株重復PCR結果,M.5000 bp Marker圖2基于ITS1序列的系統(tǒng)發(fā)育樹圖3基于ITS2序列的系統(tǒng)發(fā)育樹圖4基于SSU rDNA序列的系統(tǒng)發(fā)育樹

    Fig.1Electrophoretic patterns of the ITS region PCR products:a.The PCR products of ITS1 region;b.The PCR products of ITS2 region (1-4.electrophoresis results of strains 1-4,1-4a.repeated electrophoresis results of strains 1-4,M.5000 bp Marker)Fig.2Phylogenetic tree showing the molecular taxonomy of the ITS1 fragmentsFig.3Phylogenetic tree showing the molecular taxonomy of the ITS2 fragmentsFig.4Phylogenetic tree showing the molecular taxonomy of the SSU rDNA fragments

    本文利用PCR SSU rDNA、ITS1、ITS2基因分型方法對6株臨床無綠藻分離株進行基因分型,共分為3類,其中,1、2號菌株鑒定為P.zopfiiportoricensis(P.zopfiigenotype1),3號菌株鑒定為P.zopfiihydrocarbonea(genotype 2),4、5號菌株鑒定為P.wickerhamii。雖然由于數(shù)據(jù)庫中缺乏P.zopfiiportoricensis菌株ITS序列導致1、2號菌株不能被鑒定,但ITS區(qū)系統(tǒng)發(fā)育樹中這兩株菌株仍被歸為P.zopfii中獨立的一簇,與SSU rDNA系統(tǒng)發(fā)育樹相近,證明此分型方法無誤。此外,ITS1、ITS2區(qū)域的PCR結果顯示,擴增片段的大小呈現(xiàn)一種菌種特異性,P.wickerhamii菌株的ITS1及ITS2區(qū)擴增片段大于P.zopfii。

    由于無綠藻DNA的ITS片段富含GC堿基比,因而在PCR擴增該片段時十分困難。為克服這一問題,我們對此前的研究方法進行了修改[11],通過在反應體系中添加5% DMSO和在98℃預變性10 min后冰浴5 min,以確保所有的DNA均變性為單鏈,保證該方法的可靠性和重復性。

    本文采用PCR擴增無綠藻臨床菌株的ITS1、ITS2目的基因,并根據(jù)堿基序列的差異得出了基因分型的結果。由于PCR ITS1、ITS2基因分型法具有準確、簡便快捷等特點,在無綠藻多態(tài)性分析和流行病學調查中顯示出巨大潛力。但由于該方法剛開始應用于研究無綠藻基因型研究,其優(yōu)、缺點尚待大量流行病學調查數(shù)據(jù)的積累和更為詳盡的分析。

    [1] Kovalyshyn I, Brankov N, Fernandez AP. Erythematous and edematous plaques on the bilateral extremities in an immunocompromised patient[J]. Int J Dermatol, 2016, 55(2): e59-61.

    [2] Yeh CT, Li MC, Chuang YC, et al. Prototheca algaemia: a rare but fatal opportunistic infection among immunocompromised individuals[J]. Jpn J Infect Dis, 2013, 66(6):523-525.

    [3] Ricchi M, De Cicco C, Buzzn P, et al. First outbreak of bovine mastitis caused byProtothecablashkeae[J]. Vet Microbiol, 2013,162(2-4):997-999.

    [4] Takano M, Hoshi S, Nagai K, et al. The first case of human protothecosis caused byProtothecazopfiiin Japan[J]. J Infect Chemother, 2014, 20(10):647-649.

    [5] Kazuo S, Kenji O, Hirotoshi N, et al.Protothecacutissp.nov., a newly discovered pathogen of protothecosis isolated from inflamed human skin[J].Int J Syst Evol Microbiol,2010, 60(pt 5):1236-1240.

    [6] Takano M, Hoshi S, Nagai K, et al. The first case of human protothecosis caused byProtothecazopfiiin Japan[J]. J Infect Chemother, 2014, 20(10):647-649.

    [7] Bandaranayake TD, Paniz Mondolfi A, Peaper DR, et al.Protothecawickerhamiialgaemia: an emerging infection in solid organ transplant recipients[J]. Transpl Infect Dis, 2015, 17(4):599-604.

    [8] Macesic N, Fleming S, Kidd S, et al. Protothecosis: a lethal infection due to an achlorophylous algae[J]. Clin Infect Dis, 2014, 59(12): iv.

    [9] Macesic N, Fleming S, Kidd S, et al. Protothecosis in hematopoietic stem cell transplantation: case report and review of previous cases[J]. Transpl Infect Dis, 2014, 16(3):490-495.

    [10] Figueroa CJ, Camp BJ, Varghese GI, et al. A case of protothecosis in a patient with multiple myeloma[J]. J Cutan Patho, 2014, 41(5):409-413.

    [11] Hirose N, Nishimura K, Inoue-Sakamoto M, et al. Ribosomal internal transcribed spacer ofProtothecawickerhamiihas characteristic structure useful for identification and genotyping[J]. PLoS One, 2013,8(11):e81223.

    [12] Roesler U, Scholz H, Hensel A. Emended phenotypic characterization ofProtothetazopfii: a proposal for three biotypes and standards for their identification[J].Int J Syst Evol Microbiol, 2003, 53(4): 1195-1199.

    [13] Huth N, Wenkel RF, Roschanski N, et al. Prototheca zopfii genotype 2-induced nasal dermatitis in a cat[J]. J Comp Pathol, 2015, 152(4):287-290.

    [14] Todd JR, King JW, Oberle A, et al. Protothecosis: report of a case with 20-year follow-up and review of previously published cases[J]. Med Mycol,2012,50(7): 673-689.

    [15] Font C, Mascort J, Márquez M, et al. Paraparesis as initial manifestation of aProtothecazopfiiinfection in a dog[J]. J Small Anim Pract, 2014, 55(5):283-286.

    [16] Manino PM, Oliveira F, Ficken M, et al. Disseminated protothecosis associated with diskospondylitis in a dog[J]. J Am Anim Hosp Assoc, 2014, 50(6):429-435.

    猜你喜歡
    綠藻分型基因組
    牛參考基因組中發(fā)現(xiàn)被忽視基因
    失眠可調養(yǎng),食補需分型
    香榧綠藻的生物學特性及物種鑒定
    便秘有多種 治療須分型
    無綠藻的微生物學特性和菌種鑒定
    全球近10年無綠藻病例報道文獻的回顧
    以成長為主題解讀《窗燈》
    基于分型線驅動的分型面設計研究
    頸椎病中醫(yī)辨證分型與影像探討
    基因組DNA甲基化及組蛋白甲基化
    遺傳(2014年3期)2014-02-28 20:58:49
    国语自产精品视频在线第100页| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 夜夜爽天天搞| 乱人视频在线观看| 亚洲av一区综合| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 我要看日韩黄色一级片| 高清日韩中文字幕在线| av天堂在线播放| 小说图片视频综合网站| 99久久99久久久精品蜜桃| 国产又黄又爽又无遮挡在线| 国产高潮美女av| 男人舔女人下体高潮全视频| 国产精品一区二区三区四区免费观看 | 亚洲内射少妇av| 人人妻人人澡欧美一区二区| 亚洲国产精品合色在线| 看免费av毛片| 亚洲av成人av| 在线a可以看的网站| 免费人成在线观看视频色| 给我免费播放毛片高清在线观看| 国产黄a三级三级三级人| 午夜福利欧美成人| 欧美日韩综合久久久久久 | 成人性生交大片免费视频hd| a级毛片免费高清观看在线播放| 久久国产乱子免费精品| 亚洲av五月六月丁香网| 精品一区二区三区av网在线观看| 成人性生交大片免费视频hd| 丰满的人妻完整版| 亚洲无线观看免费| 久久精品国产亚洲av天美| 亚洲精品影视一区二区三区av| 99国产极品粉嫩在线观看| 亚洲人成网站在线播| 最后的刺客免费高清国语| 51午夜福利影视在线观看| a级毛片免费高清观看在线播放| 人人妻人人澡欧美一区二区| 国产av在哪里看| 亚洲精品成人久久久久久| 久久国产精品影院| 国产毛片a区久久久久| 黄色丝袜av网址大全| 日韩有码中文字幕| 欧美一区二区亚洲| 中文字幕熟女人妻在线| 99久久精品热视频| 精品人妻偷拍中文字幕| 中文亚洲av片在线观看爽| 国产亚洲精品综合一区在线观看| 国产大屁股一区二区在线视频| 两个人视频免费观看高清| 最近视频中文字幕2019在线8| 乱人视频在线观看| 免费人成视频x8x8入口观看| 97热精品久久久久久| 一本一本综合久久| 国产中年淑女户外野战色| 免费看日本二区| 日本在线视频免费播放| 欧美最黄视频在线播放免费| 久久久久久久久久成人| 人妻制服诱惑在线中文字幕| 国产伦一二天堂av在线观看| 亚洲色图av天堂| 亚洲在线自拍视频| 99久久成人亚洲精品观看| 欧美成人免费av一区二区三区| 精品熟女少妇八av免费久了| 成人无遮挡网站| 亚洲国产欧美人成| 最新中文字幕久久久久| 国产精品综合久久久久久久免费| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 成熟少妇高潮喷水视频| 中出人妻视频一区二区| 成人鲁丝片一二三区免费| 男人狂女人下面高潮的视频| 男女那种视频在线观看| 啦啦啦韩国在线观看视频| 精品午夜福利视频在线观看一区| 色av中文字幕| 午夜福利成人在线免费观看| 高清在线国产一区| 乱码一卡2卡4卡精品| 十八禁国产超污无遮挡网站| 国内精品久久久久精免费| 精品乱码久久久久久99久播| 中文资源天堂在线| aaaaa片日本免费| 久久精品国产亚洲av天美| 欧美日本视频| 一进一出抽搐gif免费好疼| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 丰满乱子伦码专区| 两个人视频免费观看高清| 日韩亚洲欧美综合| 性色avwww在线观看| 日韩有码中文字幕| 国产综合懂色| 欧美激情久久久久久爽电影| 久久精品国产亚洲av天美| 精品久久久久久久久av| 18禁在线播放成人免费| or卡值多少钱| 日本一二三区视频观看| 国产v大片淫在线免费观看| 国产色爽女视频免费观看| 在线国产一区二区在线| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 国产三级在线视频| 国产91精品成人一区二区三区| 91麻豆精品激情在线观看国产| www.999成人在线观看| 久久中文看片网| 久久人人爽人人爽人人片va | av在线天堂中文字幕| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 日韩国内少妇激情av| 欧美在线黄色| 久久久国产成人免费| 中文字幕av在线有码专区| av在线观看视频网站免费| 男女之事视频高清在线观看| 乱码一卡2卡4卡精品| 两个人的视频大全免费| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 亚洲欧美精品综合久久99| 亚洲成av人片在线播放无| 免费一级毛片在线播放高清视频| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 色哟哟·www| 三级国产精品欧美在线观看| 亚洲精品亚洲一区二区| 精品国产三级普通话版| 露出奶头的视频| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 在线观看美女被高潮喷水网站 | 色av中文字幕| 在线观看舔阴道视频| 搡老岳熟女国产| 午夜福利在线观看吧| 看免费av毛片| 男人舔女人下体高潮全视频| 国产精品美女特级片免费视频播放器| 特级一级黄色大片| www.色视频.com| 男人和女人高潮做爰伦理| 波多野结衣巨乳人妻| 亚洲欧美日韩无卡精品| 日韩亚洲欧美综合| 亚洲av五月六月丁香网| a级毛片a级免费在线| 最新在线观看一区二区三区| 欧美最新免费一区二区三区 | 内地一区二区视频在线| 91字幕亚洲| 在线观看美女被高潮喷水网站 | 一级a爱片免费观看的视频| 天天躁日日操中文字幕| 色综合婷婷激情| 少妇丰满av| 亚洲av熟女| a在线观看视频网站| 全区人妻精品视频| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看| 欧美午夜高清在线| 精品久久久久久久末码| 日韩欧美国产在线观看| 亚洲精品在线美女| 亚洲,欧美精品.| 国产精华一区二区三区| 亚洲人成网站高清观看| 伦理电影大哥的女人| av中文乱码字幕在线| 黄色视频,在线免费观看| x7x7x7水蜜桃| 亚洲av成人精品一区久久| 日本成人三级电影网站| 久久99热这里只有精品18| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 国产精品亚洲av一区麻豆| 能在线免费观看的黄片| 亚洲欧美精品综合久久99| 亚洲午夜理论影院| 欧美日本亚洲视频在线播放| 欧美性感艳星| 一本久久中文字幕| 人妻久久中文字幕网| 91狼人影院| 亚洲成人久久性| 宅男免费午夜| 夜夜爽天天搞| 又爽又黄无遮挡网站| 成人精品一区二区免费| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 国产精品一及| 婷婷丁香在线五月| 好男人电影高清在线观看| 夜夜爽天天搞| 国产成+人综合+亚洲专区| 亚洲美女黄片视频| 观看美女的网站| 99热这里只有是精品在线观看 | 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 欧美黄色片欧美黄色片| 免费大片18禁| 久久精品国产99精品国产亚洲性色| 国产高清三级在线| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 免费在线观看影片大全网站| 日韩成人在线观看一区二区三区| 观看美女的网站| 久久久久九九精品影院| 午夜久久久久精精品| 亚洲最大成人中文| 亚洲片人在线观看| 男插女下体视频免费在线播放| 国产在线精品亚洲第一网站| 国产极品精品免费视频能看的| 丁香欧美五月| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 久久精品国产亚洲av天美| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 亚洲美女黄片视频| 亚洲无线在线观看| 午夜激情福利司机影院| 国产亚洲精品综合一区在线观看| 97碰自拍视频| 国产黄色小视频在线观看| 特大巨黑吊av在线直播| 欧美+日韩+精品| 国产男靠女视频免费网站| 90打野战视频偷拍视频| xxxwww97欧美| 久久伊人香网站| 亚洲美女搞黄在线观看 | 男女下面进入的视频免费午夜| 一区二区三区四区激情视频 | 成年女人毛片免费观看观看9| 国产极品精品免费视频能看的| 狠狠狠狠99中文字幕| 国产精品野战在线观看| 亚洲美女视频黄频| 又爽又黄无遮挡网站| 麻豆久久精品国产亚洲av| 在线观看美女被高潮喷水网站 | 成年女人看的毛片在线观看| a级毛片免费高清观看在线播放| 亚洲人成网站在线播| 神马国产精品三级电影在线观看| 亚洲精品久久国产高清桃花| 婷婷丁香在线五月| 精品人妻偷拍中文字幕| 精品久久久久久久末码| 亚洲av成人精品一区久久| 中文字幕av成人在线电影| 最后的刺客免费高清国语| 久久久久久久久久成人| 我要看日韩黄色一级片| 国产欧美日韩精品一区二区| 精品国产三级普通话版| 可以在线观看的亚洲视频| 国产精品亚洲一级av第二区| 我要看日韩黄色一级片| 十八禁国产超污无遮挡网站| 他把我摸到了高潮在线观看| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| 97碰自拍视频| 国产成人aa在线观看| 在线天堂最新版资源| 岛国在线免费视频观看| 国产熟女xx| 美女黄网站色视频| 麻豆av噜噜一区二区三区| 亚洲电影在线观看av| 俄罗斯特黄特色一大片| av在线老鸭窝| 国产91精品成人一区二区三区| 首页视频小说图片口味搜索| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 亚洲成人久久爱视频| 国产视频一区二区在线看| 麻豆国产97在线/欧美| 首页视频小说图片口味搜索| 亚洲精品一区av在线观看| 国产亚洲精品久久久com| 白带黄色成豆腐渣| 51午夜福利影视在线观看| 久久久久久久久中文| 深夜精品福利| 男女那种视频在线观看| 国产精品免费一区二区三区在线| 99久国产av精品| 久久精品人妻少妇| 国产美女午夜福利| 精品人妻偷拍中文字幕| 成人av在线播放网站| 免费无遮挡裸体视频| 亚洲av一区综合| 亚洲中文日韩欧美视频| 丰满乱子伦码专区| 成人精品一区二区免费| 丰满乱子伦码专区| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 国产成人福利小说| 可以在线观看毛片的网站| 男女做爰动态图高潮gif福利片| 99久久精品国产亚洲精品| 麻豆久久精品国产亚洲av| 国产成人影院久久av| 白带黄色成豆腐渣| 啪啪无遮挡十八禁网站| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 久久6这里有精品| 欧美乱色亚洲激情| 欧美性感艳星| 一本综合久久免费| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 中文字幕av在线有码专区| 长腿黑丝高跟| 国产色婷婷99| 亚洲18禁久久av| 精品人妻一区二区三区麻豆 | 一个人看视频在线观看www免费| 精品午夜福利在线看| 日韩欧美国产在线观看| 久久中文看片网| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 欧美bdsm另类| 亚洲不卡免费看| 少妇被粗大猛烈的视频| 精品久久久久久成人av| 男人舔女人下体高潮全视频| 成熟少妇高潮喷水视频| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆| 国产v大片淫在线免费观看| 亚洲乱码一区二区免费版| 亚洲人成伊人成综合网2020| 日韩精品青青久久久久久| 青草久久国产| 精品国产亚洲在线| 精品欧美国产一区二区三| 九九在线视频观看精品| 精品免费久久久久久久清纯| 国内精品一区二区在线观看| 岛国在线免费视频观看| 99国产综合亚洲精品| 欧美中文日本在线观看视频| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 国产真实乱freesex| 久久午夜亚洲精品久久| 婷婷亚洲欧美| 性插视频无遮挡在线免费观看| 激情在线观看视频在线高清| 亚洲国产精品成人综合色| 内射极品少妇av片p| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 中文字幕久久专区| 亚洲国产欧美人成| 免费av观看视频| 欧美一区二区国产精品久久精品| 欧美高清成人免费视频www| 久久久久久大精品| 99久久99久久久精品蜜桃| www.999成人在线观看| 亚洲在线自拍视频| 精品久久久久久久久av| 人人妻人人看人人澡| 90打野战视频偷拍视频| 国产伦在线观看视频一区| 九九热线精品视视频播放| 91麻豆av在线| 老司机午夜十八禁免费视频| 中文字幕精品亚洲无线码一区| 欧美+日韩+精品| 国产精品一及| 久久久国产成人免费| 国产亚洲精品av在线| 久久亚洲精品不卡| 一进一出抽搐动态| 日韩国内少妇激情av| 精品久久久久久久久av| 久久精品国产亚洲av天美| 国产精品亚洲一级av第二区| 国产亚洲精品久久久com| 国产极品精品免费视频能看的| 午夜精品在线福利| 悠悠久久av| 国产成人aa在线观看| 国内精品美女久久久久久| 亚洲最大成人手机在线| 悠悠久久av| 亚洲人与动物交配视频| 午夜免费成人在线视频| 极品教师在线视频| 男女做爰动态图高潮gif福利片| 黄色丝袜av网址大全| 国产精品,欧美在线| 精品一区二区三区av网在线观看| 国产三级黄色录像| 国产伦在线观看视频一区| 精品免费久久久久久久清纯| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 成人无遮挡网站| 国产探花极品一区二区| av视频在线观看入口| h日本视频在线播放| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 欧美日本视频| 一二三四社区在线视频社区8| 国产不卡一卡二| 色综合站精品国产| x7x7x7水蜜桃| 欧美日本视频| 国产成年人精品一区二区| 简卡轻食公司| 国产精品亚洲一级av第二区| 免费高清视频大片| 1024手机看黄色片| 婷婷精品国产亚洲av| 婷婷六月久久综合丁香| 老司机午夜十八禁免费视频| 亚洲精品在线美女| 久久精品综合一区二区三区| 亚洲天堂国产精品一区在线| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 美女被艹到高潮喷水动态| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 一区二区三区四区激情视频 | 欧美精品国产亚洲| 国产在线男女| 免费大片18禁| 成人国产综合亚洲| 中亚洲国语对白在线视频| 在线观看免费视频日本深夜| 欧美日韩福利视频一区二区| 亚洲精品一区av在线观看| 特大巨黑吊av在线直播| 色吧在线观看| 免费人成在线观看视频色| 淫秽高清视频在线观看| 99国产精品一区二区三区| 中亚洲国语对白在线视频| 国产一级毛片七仙女欲春2| 成人av在线播放网站| 亚洲精品一区av在线观看| 99久国产av精品| 国产av在哪里看| 色视频www国产| 欧美在线黄色| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 国产欧美日韩精品亚洲av| 国产亚洲精品综合一区在线观看| 日韩av在线大香蕉| 小说图片视频综合网站| 熟女人妻精品中文字幕| 亚洲欧美日韩无卡精品| 性欧美人与动物交配| 国产伦精品一区二区三区视频9| 亚洲在线观看片| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 日本熟妇午夜| 国产亚洲av嫩草精品影院| 男人舔奶头视频| 99热6这里只有精品| 一级a爱片免费观看的视频| 欧美国产日韩亚洲一区| 长腿黑丝高跟| 91狼人影院| 欧美在线一区亚洲| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 可以在线观看的亚洲视频| 美女大奶头视频| 国产久久久一区二区三区| 深夜精品福利| 欧美日韩国产亚洲二区| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 老熟妇仑乱视频hdxx| 男人狂女人下面高潮的视频| 黄片小视频在线播放| 中文字幕av在线有码专区| 女人十人毛片免费观看3o分钟| 亚洲 欧美 日韩 在线 免费| xxxwww97欧美| 久久久久久久久大av| 国产av麻豆久久久久久久| 51午夜福利影视在线观看| 全区人妻精品视频| 少妇人妻精品综合一区二区 | 国产成人aa在线观看| 美女免费视频网站| 午夜久久久久精精品| 免费高清视频大片| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看| 亚洲欧美清纯卡通| 欧美又色又爽又黄视频| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 亚洲av成人av| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 久久性视频一级片| 亚洲国产高清在线一区二区三| 亚洲国产色片| 久久精品国产自在天天线| 国产色婷婷99| 狠狠狠狠99中文字幕| 国产午夜福利久久久久久| 99热6这里只有精品| 搡女人真爽免费视频火全软件 | 国产真实乱freesex| av国产免费在线观看| 久久久精品大字幕| 嫩草影院新地址| 一级黄色大片毛片| 国产美女午夜福利| 国产高清激情床上av| 中文在线观看免费www的网站| 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| 757午夜福利合集在线观看| 一本一本综合久久| av国产免费在线观看| 欧美一级a爱片免费观看看| 午夜亚洲福利在线播放| 欧美日韩综合久久久久久 | 免费黄网站久久成人精品 | 成人高潮视频无遮挡免费网站| 搡老妇女老女人老熟妇| 在线a可以看的网站| 99热6这里只有精品| www.色视频.com| 午夜日韩欧美国产| 欧美zozozo另类| 成人毛片a级毛片在线播放| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区| 一二三四社区在线视频社区8| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 日本一二三区视频观看| 亚洲欧美日韩无卡精品| 欧美一级a爱片免费观看看| 亚洲av第一区精品v没综合| 精品不卡国产一区二区三区| 桃色一区二区三区在线观看| 欧美黄色片欧美黄色片| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 久久久精品欧美日韩精品| 九九在线视频观看精品| 首页视频小说图片口味搜索| www.999成人在线观看| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 国产精品自产拍在线观看55亚洲| 一个人看视频在线观看www免费| 国产精品国产高清国产av| 国产精品自产拍在线观看55亚洲| 在线观看舔阴道视频| 亚洲av一区综合| 天天一区二区日本电影三级| 69av精品久久久久久| 欧美日本视频| 一夜夜www| 国产精品国产高清国产av| 18美女黄网站色大片免费观看| 免费av不卡在线播放| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 国产黄片美女视频| 久久久久九九精品影院| 国产精品综合久久久久久久免费| 亚洲人成伊人成综合网2020| 亚洲成人中文字幕在线播放| 国产成人啪精品午夜网站| 亚洲自拍偷在线| 一级av片app| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 国产综合懂色| 亚洲内射少妇av| 搡老熟女国产l中国老女人| 51午夜福利影视在线观看| av福利片在线观看| 亚洲欧美日韩高清专用| 欧美+亚洲+日韩+国产| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 精品人妻1区二区| 免费黄网站久久成人精品 | 一进一出抽搐动态| 婷婷精品国产亚洲av在线| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 日韩中字成人| 内地一区二区视频在线| 国产亚洲欧美在线一区二区| 九九在线视频观看精品| 极品教师在线视频| 色综合站精品国产| 亚洲 欧美 日韩 在线 免费| 人妻久久中文字幕网| 露出奶头的视频| 亚洲第一区二区三区不卡| 99久国产av精品| 午夜福利免费观看在线| 国产午夜福利久久久久久| 亚洲人成网站在线播| 亚洲性夜色夜夜综合| 我的老师免费观看完整版| 色尼玛亚洲综合影院| 制服丝袜大香蕉在线| 日韩人妻高清精品专区| 十八禁国产超污无遮挡网站| 亚洲国产精品成人综合色| 自拍偷自拍亚洲精品老妇| 啦啦啦韩国在线观看视频| 一边摸一边抽搐一进一小说|