無綠藻PCR ITS1-ITS2基因分型法的建立及應用

趙悅 朱巍巍 劉錦燕 孟玲寧 王玨婷 李文靜 項明潔

(1.上海交通大學醫(yī)學院附屬瑞金醫(yī)院檢驗科，上海 200025；2.上海交通大學醫(yī)學院附屬瑞金醫(yī)院盧灣分院放免檢驗科，上海 200020)

無綠藻 (Prototheca)作為一種3～30 μm的單細胞條件致病菌，通常情況下，定植于人體的指甲、皮膚、呼吸道和消化系統(tǒng)[1]。目前，生物學將無綠藻歸為：綠色植物界、綠藻門、Trebouxlophyceae綱、綠藻目、綠藻科、無綠藻屬。該屬包含6個種[2]：Protothecastagnora、Protothecaulmea、Protothecablashkeae[3-4]、Protothecawickerhamii、Protothecacutis[5]、Protothecazopfii[6]，后4種對人和動物具有致病性。

近年來，由于臨床免疫抑制治療，廣譜抗生素、皮質類固醇激素的大量使用和濫用以及艾滋病、接受器官移植[7]、干細胞移植[8]、白血病[9]、多發(fā)性骨髓瘤[10]、惡性腫瘤和糖尿病[2]患者的增多，無綠藻的感染率也逐年上升。因此，深入細致地研究無綠藻的分型方法，對研究無綠藻的致病性和流行病學特征具有十分重要的意義。

ITS序列為內源轉錄間隔區(qū) (internal transcribed spacer region, ITS)，位于真菌18S、5.8S和28S rRNA基因之間，分別為ITS 1和ITS 2，即18S rRNA-ITS1-5.8S rRNA-ITS2-28 S rRNA。在真菌中，5.8S、18S和28S rRNA基因具有較高的保守性，而ITS由于承受較小的自然選擇壓力，因而在絕大多數(shù)真核生物中表現(xiàn)出極為廣泛的序列多態(tài)性。同時，ITS的保守型表現(xiàn)為種內相對一致，種間差異明顯，可以將菌株鑒定至種、亞種。此外，由于ITS序列片段較小，易于分析，目前已被廣泛用于真菌不同種屬的系統(tǒng)發(fā)育分析。

本實驗應用PCR ITS1-ITS2基因分型方法建立無綠藻菌株的ITS基因分型方法，并通過MEGA6.0軟件建立系統(tǒng)發(fā)育樹，比較不同菌株間的基因親緣性。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗菌株共5株，其中1號菌株采自中國醫(yī)學科學院皮膚病醫(yī)院 (研究所)患者，2號菌株采自山東省皮膚病醫(yī)院，3號菌株來自華山醫(yī)院，4、5號菌株采自中山醫(yī)科大學附屬二院。

本實驗涉及的測序引物見表1 (上海生工生物工程有限公司合成)。

1.2 方法

無綠藻菌株分離、純化及基因組DNA的抽提 將菌株接種于YPD固體培養(yǎng)基，有氧條件下于37℃培養(yǎng)48～72 h。待菌落出現(xiàn)后，分離純化。取適量菌落懸浮于500 mL蒸餾水中，按照改良版的堿裂解法抽提無綠藻基因組DNA。

SSU rDNA PCR 反應體系總體積為50 μL，包括0.25 μL rTaq聚合酶 (5 U/μL, R001A, Japan, TaKaRa)，5 μL 10×PCR緩沖液，4 μL 2.5 mmol/L dNTPs，0.2 μL引物 (50 μmol/L)，及1 μL無綠藻基因組DNA。

30個PCR反應條件為：94℃變性1 min，59℃退火1 min，72℃延伸2 min。PCR產物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠檢測，以DNA Marker為相對分子質量標記，電泳結果在紫外燈下觀察并照相記錄。

表1 本實驗涉及的所有PCR引物

ITS1-ITS2 PCR 反應體系總體積為50 μL，包括：1 μL KOD-plus聚合酶 (1 U/μL，Lot.32570h3, Japan, TOYOBO)，5 μL 10×PCR緩沖液，5 μL 2 mmol/L dNTPs，1.5 μL引物 (10 μmol/L)，3 μL MgSO4(25 mmol/L)，2.5 μL 100%二甲亞砜 (dimethyl sulfoxide, DMSO)[13]及無綠藻基因組DNA (≤200 ng, ≥1 μL)。

PCR反應條件為：98℃預變性10 min，冰浴5 min后加入1 μL KOD-plus聚合酶。之后進行30個PCR反應循環(huán)：98℃變性10 s，55℃退火30 s，68℃延伸30 min。PCR產物觀察方法同上。

DNA 堿基序列測定 ITS1、ITS2、SSU rDNA區(qū)域的PCR擴增產物進行純化及DNA堿基序列測定 (上海生工生物工程有限公司)。

BLAST序列比對 通過BLAST X在線檢索工具將測定的SSU rDNA、ITS1、ITS2區(qū)域的DNA堿基序列與Genbank中的數(shù)據(jù)庫進行比對，找出與之相似的序列記錄，菌株的鑒定以最高分的菌種決定。

系統(tǒng)發(fā)育樹繪制 利用MEGA 6.0軟件，采用相鄰連接法 (Neighbour-joining, NJ)構建系統(tǒng)發(fā)育樹，并對構建的樹進行自檢 (Bootstrap)，重復次數(shù)設定為1 000次。由于無綠藻SSU rDNA的測序方法相對成熟，當ITS1、ITS2序列建立的系統(tǒng)發(fā)育樹與之相同時，證明ITS基因分型方法建立成功。

2 結 果

2.1 ITS1-ITS2 PCR

以基因組DNA為模板，通過PCR反應，對ITS1和ITS2區(qū)擴增產物純化、測序后，得到相應大小的片段。電泳結果顯示，無綠藻ITS擴增片段的大小呈現(xiàn)一種菌種特異性，P.wickerhamii菌株的ITS1及ITS2區(qū)擴增片段均明顯大于P.zopfii(見圖1)。

2.2 BLAST序列比對

將測序得到的SSU rDNA、ITS1、ITS2序列與Genbank/EMBL/DDBJ數(shù)據(jù)庫中的已知菌株進行BLAST搜索比對。

SSU rDNA序列比對結果顯示：1、2號菌株鑒定為P.zopfiiportoricensis(genotype 1)，3號菌株鑒定為P.zopfiihydrocarbonea(genotype 2)，4、5號菌株鑒定為P.wickerhamii。

ITS1、ITS2序列比對與之相同，但由于目前無綠藻ITS基因分型方法尚未建立，缺乏有關P.zopfiiportoricensis的ITS基因序列，因而1、2號菌株暫無比對結果。

但兩種方法中，P.zopfiiportoricensis(genotype 1)和P.zopfiihydrocarbonea(genotype 2)菌株的比對可靠性都較高，均大于90%，而P.wickerhamii菌株的比對差異較大[11]，這一點與此前文獻的研究結果相符，可能由于P.wickerhamii菌株內部的變異性較大導致。

2.3 系統(tǒng)發(fā)育樹

在NCBI數(shù)據(jù)庫中，搜索已報道的無綠藻標準菌株的ITS1、ITS2、SSU rDNA序列，進行系統(tǒng)發(fā)育樹構建 (見圖2～4)。

3 討 論

近年來，隨著各種原因導致的免疫缺陷患者人數(shù)的增加，無綠藻的感染在全球有上升趨勢。截至2012年，全球已報告無綠藻病160例[14]。Chun-Ting Yeh等[2]通過對近3年教學醫(yī)院的16例無綠藻患者跟蹤研究發(fā)現(xiàn)，該菌引起免疫低下患者的死亡率高達62.5%，且一般預后較差。此外，中型無綠藻基因2型可導致奶牛患乳腺炎，免疫抑制的小鼠、山羊和貓[13]、犬[15-16]的感染。

由于無綠藻病的臨床癥狀缺乏特異性，加之又缺乏足夠的認識和有效的鑒別手段，因而該病的診斷率遠低于發(fā)病率。目前無綠藻常見的鑒定方法有：形態(tài)學及生化反應鑒定、genotype-special PCR、限制性片段長度多態(tài)性分析、SSU rDNA測序、LSU rDNA測序，質譜分析。然而，形態(tài)學及生化反應鑒定常因為各種因素而產生模棱兩可的結果，給無綠藻的鑒定帶來困難。genotype-special PCR和RFLP操作較為簡便,但只能鑒定P.zopfiigenotype1,P.zopfiigenotype2和P.blashkeae。此外，SSU rDNA測序、LSU rDNA的鑒別力明顯低于ITS鑒定。

圖1ITS區(qū)PCR產物電泳結果：a.ITS1區(qū)域PCR產物；b.ITS2區(qū)域PCR產物 (1-4.1-4號菌株電泳結果,1-4a.1-4號菌株重復PCR結果,M.5000 bp Marker圖2基于ITS1序列的系統(tǒng)發(fā)育樹圖3基于ITS2序列的系統(tǒng)發(fā)育樹圖4基于SSU rDNA序列的系統(tǒng)發(fā)育樹

Fig.1Electrophoretic patterns of the ITS region PCR products:a.The PCR products of ITS1 region;b.The PCR products of ITS2 region (1-4.electrophoresis results of strains 1-4,1-4a.repeated electrophoresis results of strains 1-4,M.5000 bp Marker)Fig.2Phylogenetic tree showing the molecular taxonomy of the ITS1 fragmentsFig.3Phylogenetic tree showing the molecular taxonomy of the ITS2 fragmentsFig.4Phylogenetic tree showing the molecular taxonomy of the SSU rDNA fragments

本文利用PCR SSU rDNA、ITS1、ITS2基因分型方法對6株臨床無綠藻分離株進行基因分型，共分為3類，其中，1、2號菌株鑒定為P.zopfiiportoricensis(P.zopfiigenotype1)，3號菌株鑒定為P.zopfiihydrocarbonea(genotype 2)，4、5號菌株鑒定為P.wickerhamii。雖然由于數(shù)據(jù)庫中缺乏P.zopfiiportoricensis菌株ITS序列導致1、2號菌株不能被鑒定，但ITS區(qū)系統(tǒng)發(fā)育樹中這兩株菌株仍被歸為P.zopfii中獨立的一簇，與SSU rDNA系統(tǒng)發(fā)育樹相近，證明此分型方法無誤。此外，ITS1、ITS2區(qū)域的PCR結果顯示，擴增片段的大小呈現(xiàn)一種菌種特異性，P.wickerhamii菌株的ITS1及ITS2區(qū)擴增片段大于P.zopfii。

由于無綠藻DNA的ITS片段富含GC堿基比，因而在PCR擴增該片段時十分困難。為克服這一問題，我們對此前的研究方法進行了修改[11]，通過在反應體系中添加5% DMSO和在98℃預變性10 min后冰浴5 min，以確保所有的DNA均變性為單鏈，保證該方法的可靠性和重復性。

本文采用PCR擴增無綠藻臨床菌株的ITS1、ITS2目的基因，并根據(jù)堿基序列的差異得出了基因分型的結果。由于PCR ITS1、ITS2基因分型法具有準確、簡便快捷等特點，在無綠藻多態(tài)性分析和流行病學調查中顯示出巨大潛力。但由于該方法剛開始應用于研究無綠藻基因型研究，其優(yōu)、缺點尚待大量流行病學調查數(shù)據(jù)的積累和更為詳盡的分析。

[1] Kovalyshyn I, Brankov N, Fernandez AP. Erythematous and edematous plaques on the bilateral extremities in an immunocompromised patient[J]. Int J Dermatol, 2016, 55(2): e59-61.

[2] Yeh CT, Li MC, Chuang YC, et al. Prototheca algaemia: a rare but fatal opportunistic infection among immunocompromised individuals[J]. Jpn J Infect Dis, 2013, 66(6):523-525.

[3] Ricchi M, De Cicco C, Buzzn P, et al. First outbreak of bovine mastitis caused byProtothecablashkeae[J]. Vet Microbiol, 2013,162(2-4):997-999.

[4] Takano M, Hoshi S, Nagai K, et al. The first case of human protothecosis caused byProtothecazopfiiin Japan[J]. J Infect Chemother, 2014, 20(10):647-649.

[5] Kazuo S, Kenji O, Hirotoshi N, et al.Protothecacutissp.nov., a newly discovered pathogen of protothecosis isolated from inflamed human skin[J].Int J Syst Evol Microbiol,2010, 60(pt 5):1236-1240.

[6] Takano M, Hoshi S, Nagai K, et al. The first case of human protothecosis caused byProtothecazopfiiin Japan[J]. J Infect Chemother, 2014, 20(10):647-649.

[7] Bandaranayake TD, Paniz Mondolfi A, Peaper DR, et al.Protothecawickerhamiialgaemia: an emerging infection in solid organ transplant recipients[J]. Transpl Infect Dis, 2015, 17(4):599-604.

[8] Macesic N, Fleming S, Kidd S, et al. Protothecosis: a lethal infection due to an achlorophylous algae[J]. Clin Infect Dis, 2014, 59(12): iv.

[9] Macesic N, Fleming S, Kidd S, et al. Protothecosis in hematopoietic stem cell transplantation: case report and review of previous cases[J]. Transpl Infect Dis, 2014, 16(3):490-495.

[10] Figueroa CJ, Camp BJ, Varghese GI, et al. A case of protothecosis in a patient with multiple myeloma[J]. J Cutan Patho, 2014, 41(5):409-413.

[11] Hirose N, Nishimura K, Inoue-Sakamoto M, et al. Ribosomal internal transcribed spacer ofProtothecawickerhamiihas characteristic structure useful for identification and genotyping[J]. PLoS One, 2013,8(11):e81223.

[12] Roesler U, Scholz H, Hensel A. Emended phenotypic characterization ofProtothetazopfii: a proposal for three biotypes and standards for their identification[J].Int J Syst Evol Microbiol, 2003, 53(4): 1195-1199.

[13] Huth N, Wenkel RF, Roschanski N, et al. Prototheca zopfii genotype 2-induced nasal dermatitis in a cat[J]. J Comp Pathol, 2015, 152(4):287-290.

[14] Todd JR, King JW, Oberle A, et al. Protothecosis: report of a case with 20-year follow-up and review of previously published cases[J]. Med Mycol,2012,50(7): 673-689.

[15] Font C, Mascort J, Márquez M, et al. Paraparesis as initial manifestation of aProtothecazopfiiinfection in a dog[J]. J Small Anim Pract, 2014, 55(5):283-286.

[16] Manino PM, Oliveira F, Ficken M, et al. Disseminated protothecosis associated with diskospondylitis in a dog[J]. J Am Anim Hosp Assoc, 2014, 50(6):429-435.