熒光染色和乳酸酚棉蘭染色在甲真菌感染檢測中的應(yīng)用比較

董興軍 吳立華 王尚武

(湖北省潛江市皮膚病醫(yī)院檢驗(yàn)科，潛江 433100)

直接鏡檢是淺部真菌形態(tài)學(xué)檢查的基本方法，也是最簡單、快速、實(shí)用的實(shí)驗(yàn)室診斷方法。尤其是甲真菌感染患者病情頑固，易傳播和交叉感染，給患者帶來很大心里壓力，臨床需要準(zhǔn)確診斷，及時治療。本實(shí)驗(yàn)用乳酸酚棉藍(lán)染液法和熒光染色法[1]對同一患者的同一部位標(biāo)本同時進(jìn)行鏡檢，比較這兩種方法的鏡檢陽性率。

1 材料和方法

1.1 標(biāo)本來源

取自本院皮膚科門診患者，擬診為甲真菌感染者。其中男145例，女135例，共280例。取材部位：指甲152例，趾甲128例。

1.2 方法

取材 用75%酒精在皮損處消毒，取活動性邊緣的甲屑，趾 (指)甲取病甲下或近端甲屑，同時采集2份標(biāo)本放置2張玻片上送檢。

乳酸酚棉藍(lán)染色法 染液配制方法：石碳酸20 mL，乳酸20 mL，甘油40 mL，蒸餾水20 mL，稍加熱溶解，然后加入棉藍(lán)50 mg，混勻，過濾即可。將標(biāo)本置于玻片上，滴加一滴染液，覆上蓋玻片，輕壓使標(biāo)本平鋪5 min后鏡檢。

真菌熒光染色液 由南京漢瑞生物科技有限公司提供。主要成份：氫氧化鉀、水溶性熒光增白劑、純化水。制片同上。

器材 奧林巴斯CX31普通光學(xué)顯微鏡，奧林巴斯CX23熒光顯微鏡。

鏡檢 固定由兩位具有多年工作經(jīng)驗(yàn)的檢驗(yàn)師進(jìn)行全片觀察，以發(fā)現(xiàn)多個孢子或菌絲判定為陽性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件，兩樣本率比較采用χ2檢驗(yàn)，組間率的兩兩比較采用分割χ2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

對280例患者，每例同時采集兩份標(biāo)本到兩塊玻片上，分別進(jìn)行熒光染色法 (280份)及乳酸酚棉藍(lán)染色法 (280份)直接鏡檢，以高倍鏡下觀察到菌絲或孢子判定為陽性。結(jié)果見表1。不同部位的菌絲在兩種方法中的形態(tài)見圖1～4。

乳酸酚棉藍(lán)染色法直接鏡檢，趾甲部、指甲部陽性率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (χ2=0.17，P>0.05)。熒光染色法直接鏡檢，趾甲部、指甲部陽性率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (χ2=0.06，P>0.05)，其中趾甲部用兩種方法鏡檢，陽性率比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (χ2=15.52，P<0.05)；指甲部用兩種方法鏡檢，陽性率比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (χ2=13.12，P<0.05)。

3 討 論

皮膚癬菌是常見的真菌感染性皮膚病，其基本形態(tài)分為菌絲和孢子兩種，取樣直接鏡檢見到一定數(shù)量的菌絲或孢子，即可確定有真菌感染存在[2]。張宏等[3]根據(jù)真菌結(jié)構(gòu)和感染部位指出乳酸酚棉藍(lán)染色法可用于淺部真菌的直接鏡檢，這種方法取材簡單，操作方便。用乳酸酚棉藍(lán)染色后直接鏡檢，鏡下菌絲形態(tài)結(jié)構(gòu)清楚易辨，背景干凈、清晰，反差大，孢子染色后呈圓形或橢圓形,易于分辨[4]。

表1 不同部位兩種方法鏡檢結(jié)果情況 (n，%)

圖1趾甲標(biāo)本：乳酸酚棉藍(lán)染色，×40圖2趾甲標(biāo)本：熒光染色，×40圖3指甲標(biāo)本：乳酸酚棉藍(lán)染色，×40圖4指甲標(biāo)本：熒光染色，×40

Fig.1Toenail specimens: lactophenol cotton blue stain,×40Fig.2Toenail specimens:fluorescent staining,×40Fig.3Nail specimens: lactophenol cotton blue stain,×40Fig.4Nail specimens: fluorescent staining,×40

但不能對角質(zhì)細(xì)胞起溶解作用，角質(zhì)層細(xì)胞和菌絲同時被染成淡藍(lán)色，特別在菌絲或孢子較少時更不易看到，由于真菌生長環(huán)境的因素，菌絲染色很淡，仔細(xì)才能看見。熒光染色法通過特殊熒光素與組織中可能存在的真菌細(xì)胞壁中的幾丁質(zhì)發(fā)生特異性結(jié)合[5]，在紫外光的激發(fā)下，可使真菌顯示熒光。在熒光顯微鏡特定的激發(fā)光波段下 (340～400 nm),菌絲或孢子發(fā)出明亮的藍(lán)綠色熒光，在黑暗的背景下特別顯影，根據(jù)典型的菌絲橫隔和出芽結(jié)構(gòu)，非常便于識別。有一些纖維素也能被熒光著色，但沒有菌絲那樣分枝的管狀結(jié)構(gòu)，容易區(qū)分。標(biāo)本經(jīng)過熒光染色后，孢子呈明亮的圓形、橢圓形，有的長出芽胞，對脂肪滴不產(chǎn)生標(biāo)記，與脂肪滴易于鑒別[6]，熒光染液還有KOH成份，能對組織細(xì)胞起溶解作用，使組織透明化，提高鏡檢陽性率。兩種方法鏡檢甲真菌結(jié)果顯示，熒光染色法優(yōu)于乳酸酚棉藍(lán)染色法 (χ2=28.44，P<0.05)，正確選擇取樣部位和足夠的標(biāo)本量，耐心細(xì)致地觀察全片，結(jié)合臨床癥狀，就能夠提高鏡檢工作效率和準(zhǔn)確率，但真菌菌種的明確仍需依賴真菌培養(yǎng)及鑒定。

[1] 劉運(yùn)德，樓永良，王躍，等. 微生物學(xué)檢驗(yàn)[M].第2版，北京：人民衛(wèi)生出版社，2003：360-363.

[2] 帥麗華，宋秋荷，孫曉紅.兩種浮載液真菌直接鏡檢效果比較[J].中國真菌學(xué)雜志,2008,3(6):343-346.

[3] 張宏，廖萬清，郭寧如，等.真菌感染的實(shí)驗(yàn)室診斷.實(shí)用臨床真菌病學(xué)[M].第1版.北京:人民軍醫(yī)出版社，2009:10-13.

[4] 黃霞云，劉晶杰.真菌染色新方法的探索[J].實(shí)用醫(yī)技雜志,2006,13(11)：1862-1863.

[5] 張宏，吳紹熙.深部真菌病快速診斷的新實(shí)驗(yàn)方法[J].國外醫(yī)學(xué)皮膚性病學(xué)分冊,1995，21(1):12-14.

[6] 韓德忞, 劉原志,朱均昊，等.熒光染色法與KOH濕片法在真菌直接鏡檢中的應(yīng)用比較[J].中國真菌學(xué)雜志,2016，11(4):240-243.