B類1型清道夫受體基因敲除雌鼠不孕相關(guān)機(jī)制的研究進(jìn)展

張劉洋，龔婷，喻紅，張?jiān)?

(1.武漢大學(xué)中南醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心，武漢 430071；2.海南省第三人民醫(yī)院婦產(chǎn)科，三亞 572099；3.武漢大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)系，武漢 430071)

WHO一項(xiàng)調(diào)查結(jié)果顯示，截止2010年底，發(fā)展中國(guó)家平均每4個(gè)家庭中就有1對(duì)夫婦受到女性不孕的困擾[1]。女性不孕的主要病因包括卵巢功能障礙、輸卵管異常、子宮異常及不明原因的不孕等。其中，不明原因的不孕約占10～20%[2]，目前應(yīng)用的檢測(cè)手段無法對(duì)其進(jìn)行確診，且缺乏肯定有效的治療方法和療效指標(biāo)，不明原因的不孕是女性不孕中仍待攻克的一大難題。另一方面，隨著生活水平的提高，不健康的生活方式所導(dǎo)致的肥胖、高脂血癥等疾病已成為人群中的常見病，脂代謝異常與不孕之間的關(guān)系也逐漸被人們所發(fā)現(xiàn)和重視。

B類1型清道夫受體(scavenger receptor class B type I，SR-B1)是首個(gè)被明確的高密度脂蛋白(high density lipoprotein，HDL)受體[3]，SR-B1基因敲除(SR-B1 gene knockout，SR-B1-/-)小鼠除HDL及膽固醇代謝紊亂、動(dòng)脈粥樣硬化易感等特點(diǎn)外，還表現(xiàn)為雌性不孕。與此同時(shí)，大量流行病學(xué)研究顯示，人類SR-B1基因(SCARB1)單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)與血脂水平、冠心病易感性等有顯著相關(guān)性[4-5]，且SCARB1 rs4238001 SNP(G2S 突變)與卵泡液中孕酮水平下降及胚胎移植存活率顯著降低有關(guān)，rs10846744 SNP也顯示與胚胎存活率較低有關(guān)[6]。

多項(xiàng)研究證實(shí)，SR-B1-/-雌鼠體內(nèi)異常的脂蛋白代謝與其不孕有密切的關(guān)聯(lián)，但其具體機(jī)制尚未明確。本文將從SR-B1的功能特點(diǎn)及SR-B1-/-雌鼠的病理改變出發(fā)，對(duì)其不孕的可能相關(guān)機(jī)制進(jìn)行探究和分析。

一、SR-B1的基本功能

1.SR-B1參與細(xì)胞對(duì)脂蛋白膽固醇的攝?。篠R-B1能以高親和力結(jié)合HDL而選擇性介導(dǎo)膽固醇攝取，它主要分布在肝臟、類固醇激素生成器官等組織細(xì)胞膜表面，參與膽固醇逆向轉(zhuǎn)運(yùn)(reverse cholesterol transport，RCT)及類固醇合成細(xì)胞的膽固醇攝取等過程。

RCT的最終環(huán)節(jié)中，肝細(xì)胞表面的SR-B1可與攜有肝外組織膽固醇的HDL顆粒結(jié)合，HDL中膽固醇酯(cholesteryl ester，CE)被肝細(xì)胞選擇性攝取進(jìn)入胞內(nèi)，隨之被代謝為膽汁而排出體外[7]。此外，肝細(xì)胞表面的SR-B1還可介導(dǎo)細(xì)胞對(duì)HDL中脂質(zhì)氫過氧化物的選擇性攝取[8]，以避免累積的脂質(zhì)氧化產(chǎn)物對(duì)HDL結(jié)構(gòu)和功能產(chǎn)生損害。

在性腺、腎上腺等組織中，也可發(fā)現(xiàn)SR-B1的大量表達(dá)。性腺組織合成的性激素是一類甾體激素，卵巢所分泌的兩種性激素——雌激素與孕激素，分別由卵泡內(nèi)的顆粒細(xì)胞和排卵后形成的黃體細(xì)胞合成并分泌。研究發(fā)現(xiàn)，小鼠卵巢黃體細(xì)胞的SR-B1基因沉默后其胞內(nèi)膽固醇濃度顯著降低[9]，而大鼠卵巢顆粒細(xì)胞的CE攝取過程也被證實(shí)與SR-B1密切相關(guān)[10]。也就是說，SR-B1在卵巢性激素的合成過程中發(fā)揮了一定的作用。

2.SR-B1介導(dǎo)胞內(nèi)游離膽固醇的外流：在符合膽固醇濃度梯度的條件下，細(xì)胞表面的SR-B1還可介導(dǎo)胞內(nèi)游離膽固醇(free cholesterol，F(xiàn)C)流向胞外成熟的HDL顆粒[11]。

巨噬細(xì)胞表面主要存在三種分子可介導(dǎo)胞內(nèi)FC的外流：SR-B1，三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體G1(ATP-binding cassette transporter G1，ABCG1)，和三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體A1(ATP-binding cassette transporter A1，ABCA1)。SR-B1和ABCG1主要介導(dǎo)胞內(nèi)FC外流至HDL顆粒，ABCA1則負(fù)責(zé)將磷脂和FC轉(zhuǎn)運(yùn)至胞外缺乏脂質(zhì)的載脂蛋白AI(apolipoprotein AI，apoAI)或載脂蛋白E(apolipoprotein E，apoE)上。在人巨噬細(xì)胞中，ABCA1和SR-B1是膽固醇外流的主要途徑[12]。顯然，在ABCA1途徑缺陷的情況下，作為抗動(dòng)脈粥樣硬化的協(xié)助環(huán)節(jié)之一，SR-B1介導(dǎo)巨噬細(xì)胞內(nèi)FC外流的重要性就顯得尤為突出。接受ABCA1/SR-B1雙敲除小鼠骨髓的LDLR基因敲除(LDLR-/-)小鼠，其體內(nèi)動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展程度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于接受ABCA1基因敲除小鼠骨髓的LDLR-/-小鼠水平[13]，這一現(xiàn)象也就可以得到合理的解釋。

3.SR-B1的抗炎、抗氧化作用：多項(xiàng)研究結(jié)果表明，SR-B1與機(jī)體內(nèi)促炎細(xì)胞因子水平密切相關(guān)[14]。在受到炎性因子的刺激時(shí)，核轉(zhuǎn)錄因子κB(nuclear factor kappa B，NF-κB)可被激活，從而進(jìn)一步提高炎性因子的轉(zhuǎn)錄水平，而SR-B1與配體的結(jié)合可活化蛋白激酶B，并同時(shí)抑制NF-κB的激活[15]，使得抗炎因子分泌增加[14]。當(dāng)SR-B1介導(dǎo)的上述通路被阻斷時(shí)，炎性細(xì)胞因子和活性氧(reactive oxygen species，ROS)產(chǎn)生增多，過高的炎癥和氧化應(yīng)激水平最終可導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。

作為抗炎的重要角色之一，糖皮質(zhì)激素(glucocorticoid，GC)的合成也與SR-B1密切相關(guān)。小鼠體內(nèi)的SR-B1缺陷可導(dǎo)致GC合成減少[16]，且Sophie等[17]通過實(shí)驗(yàn)證實(shí)，小鼠腎上腺皮質(zhì)SR-B1的缺失可導(dǎo)致應(yīng)激GC水平下降，全身炎癥反應(yīng)加劇，內(nèi)毒素血癥致死率顯著上升。

另一方面，WT小鼠中的HDL關(guān)聯(lián)蛋白，對(duì)氧磷酶1(paraoxonase 1，PON1)、血小板活化因子乙酰水解酶(platelet-activating factor acetylhydrolase，PAF-AH)等，可通過抑制LDL的氧化修飾達(dá)到抗氧化的作用。而SR-B1-/-小鼠血清中PON1和PAF-AH蛋白水平較WT小鼠均顯著下降，PON1活性明顯降低，且其體內(nèi)脂質(zhì)和蛋白氧化水平顯著高于WT小鼠，證實(shí)SR-B1-/-小鼠體內(nèi)氧化應(yīng)激水平較WT顯著升高[8]。

二、SR-B1-/-雌鼠的病理表現(xiàn)及其不孕的可能機(jī)制

1.SR-B1-/-雌鼠的激素水平缺陷：膽固醇是類固醇激素合成的主要原料[18]，SR-B1作為HDL受體，在調(diào)節(jié)類固醇合成細(xì)胞攝取高密度脂蛋白膽固醇(HDL cholesterol，HDL-C)，為激素合成提供原材料的過程中發(fā)揮重要作用[10]?；诖?，“激素合成不足”假說被提出。

Trigatti等[19]發(fā)現(xiàn)SR-B1-/-雌鼠卵巢脂質(zhì)的油紅O染色顯著弱于WT雌鼠卵巢，但交配相同天數(shù)后的SR-B1-/-與WT雌鼠血漿孕酮水平并無顯著差異，且SR-B1-/-雌鼠的動(dòng)情周期、排卵數(shù)目與對(duì)照組相比并無缺陷。隨后，Jiménez等[20]對(duì)同時(shí)給予HCG促排卵處理的SR-B1-/-和WT雌鼠血漿孕酮水平進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)處于黃體期的SR-B1-/-雌鼠孕酮水平較WT雌鼠下降了約50%。

同年，Kolmakova等[21]構(gòu)建了SR-B1缺陷的人顆粒細(xì)胞模型，檢測(cè)其孕酮分泌及相關(guān)蛋白表達(dá)的水平。在各種培養(yǎng)條件下，SR-B1 Knockdown(SR-B1 KD)顆粒細(xì)胞的孕酮分泌水平均顯著低于對(duì)照組顆粒細(xì)胞，且SR-B1 KD顆粒細(xì)胞中多種類固醇合成關(guān)鍵酶，如P450膽固醇側(cè)鏈切除酶(P450 side-chain cleavage，P450 SCC)、3β-羥化類固醇脫氫酶(3β-hydroxysteroid dehydrogenase，3βHSD)、類固醇合成快速調(diào)節(jié)蛋白(steroidogenic acute regulatory protein，StAR)，其RNA表達(dá)水平均顯著下降。SR-B1可能通過調(diào)節(jié)StAR、SCC、3βHSD等多種類固醇合成途徑中的關(guān)鍵蛋白的表達(dá)，從而影響顆粒細(xì)胞的孕酮分泌。

以上一系列的研究結(jié)果證實(shí)，SR-B1-/-雌鼠卵巢能夠合成一定水平的類固醇激素以維持器官的一些基本功能，但在應(yīng)激(促排卵)條件下，歸因于激素合成關(guān)鍵酶的低表達(dá)或其他因素，機(jī)體能夠動(dòng)員利用的激素水平是相對(duì)不足的。

這種一定水平上的激素缺陷是否直接導(dǎo)致SR-B1-/-雌鼠不孕，Miettinen等[22]的研究對(duì)此做出了一個(gè)回復(fù)。研究人員以重組激活基因2敲除(reconstruction activating gene 2-/-，RAG-2-/-)的免疫耐受雌鼠為受體，手術(shù)切除其原卵巢后將SR-B1-/-雌鼠卵巢移植到其體內(nèi)，再將其與WT雄鼠配對(duì)。術(shù)后的2～3周，SR-B1-/-卵巢移植的RAG-2-/-雌鼠中即有成功受孕鼠，最終妊娠率高達(dá)85.7%(6/7)。

在SR-B1正常表達(dá)的卵巢外環(huán)境中，SR-B1-/-卵巢可順利產(chǎn)生功能性卵母細(xì)胞，并維持正常功能至成功妊娠。該項(xiàng)研究結(jié)果也從側(cè)面證實(shí)，SR-B1-/-雌鼠不孕的原因不應(yīng)僅局限于卵巢激素的合成缺陷，更多應(yīng)該關(guān)注于紊亂的卵巢外環(huán)境。

2.SR-B1-/-雌鼠的失調(diào)性膽固醇代謝：在正常的RCT過程中，HDL中的FC在膽固醇脂酰轉(zhuǎn)移酶(lecithin-cholesterol acyl transferase，LCAT)的作用下酯化為CE進(jìn)而被細(xì)胞選擇性攝取。上述膽固醇酯化的過程降低了體內(nèi)FC的濃度，可有效地避免膽固醇過量蓄積引起的細(xì)胞功能障礙甚至凋亡或壞死的細(xì)胞毒性[23]。

SR-B1-/-小鼠體內(nèi)RCT途徑的受阻直接導(dǎo)致膽固醇代謝的一系列紊亂，具體表現(xiàn)為以FC升高為主的高膽固醇血癥，其血漿游離膽固醇與總膽固醇(total cholesterol，TC)的比值(FC/TC)約為對(duì)照組兩倍(0.5 vs. 0.25)，而作為決定該比值的關(guān)鍵因素，LCAT在SR-B1-/-小鼠肝臟的mRNA表達(dá)水平和血漿中的蛋白水平與WT相比均無顯著差異[24]。針對(duì)LCAT活性的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，SR-B1-/-小鼠LCAT內(nèi)源性酯化活性顯著低于WT水平[24-25]，但在加入外源性HDL-C的條件下，SR-B1-/-的LCAT外源性酯化活性與WT并無顯著差異[25]。上述結(jié)果提示，SR-B1缺陷引起的HDL顆粒體積和成分的異常變化對(duì)于LCAT活性有很大影響，可進(jìn)而導(dǎo)致FC向CE轉(zhuǎn)化的酯化率降低，體內(nèi)FC過量蓄積。

考慮到過量FC的細(xì)胞毒性與SR-B1-/-雌鼠不孕的可能聯(lián)系，Yesilaltay等[25]構(gòu)建了表達(dá)人LCAT的轉(zhuǎn)基因SR-B1-/-小鼠模型(SR-B1-/-/LCATTg)對(duì)此進(jìn)行研究。與非轉(zhuǎn)基因組(SR-B1-/-)相比，轉(zhuǎn)基因組小鼠LCAT外源性活性升高7～11倍，SR-B1-/-/LCATTg組FC/TC比值相比于SR-B1-/-組顯著下降(0.37 vs. 0.44，P<0.001)，但仍比WT/LCATTg組值(FC/TC=0.18)高出約一倍。值得注意的是，SR-B1-/-/LCATTg組雌鼠的妊娠率(2/15)與SR-B1-/-組(0/7)相比具有顯著差異。盡管SR-B1-/-雌鼠中LCAT的外源性活性升高近10倍只能部分改善其膽固醇酯化缺陷，但仍可有效地逆轉(zhuǎn)不孕。

后期進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，SR-B1-/-雌鼠卵母細(xì)胞中FC水平遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于WT雌鼠，且前者易發(fā)生過早激活，即在未受精的情況下，自動(dòng)跳過減速分裂MII間期，排出第二極體。在體外膽固醇負(fù)荷的培養(yǎng)條件下，WT雌鼠卵母細(xì)胞出現(xiàn)了相同的現(xiàn)象[26]。

上述結(jié)果證實(shí)，過多的FC蓄積很有可能是造成SR-B1-/-雌鼠不孕的原因之一，而促進(jìn)FC向CE的轉(zhuǎn)化可有效逆轉(zhuǎn)其不孕。

3.SR-B1-/-雌鼠的炎癥與氧化應(yīng)激：早有多篇文獻(xiàn)報(bào)道，母體內(nèi)的氧化應(yīng)激水平可影響卵母細(xì)胞和胚胎質(zhì)量，甚至可誘發(fā)多種妊娠并發(fā)癥，如子癇前期、復(fù)發(fā)性流產(chǎn)等的發(fā)生[27]。

SR-B1缺陷引起的炎癥、氧化應(yīng)激與多種機(jī)制有關(guān)。除上述提及的促炎與抗炎因子的表達(dá)失衡、GC合成減少及抗氧化酶活性降低等因素外，SR-B1缺陷還可引起膳食成分中的抗氧化物(如β-胡蘿卜素和α-生育酚)生物利用度下降[28]。α-生育酚(α-tocopherol，α-T)是脂溶性維生素E最具生物活性的形式，也是人體內(nèi)最主要的抗氧化物之一。維生素E最早作為一種嚙齒類動(dòng)物正常生育所必須的微量營(yíng)養(yǎng)素而被發(fā)現(xiàn)，且動(dòng)物研究證實(shí)，在胚胎植入過程中回補(bǔ)維生素E可部分挽救由于維生素E缺乏所導(dǎo)致的不孕[29]。維生素E被腸上皮細(xì)胞所吸收，而這一過程有腸上皮細(xì)胞表面SR-B1的參與[28]。在循環(huán)中，LDL和HDL是α-T的主要運(yùn)載體，細(xì)胞通過相應(yīng)的脂蛋白受體攝取α-T[30]。相比于WT雌鼠，SR-B1-/-雌鼠血漿α-T的水平升高，但卵巢組織中α-T水平明顯下降[31]。前期研究表明，SR-B1-/-雌鼠的不孕與其植入前胚胎的發(fā)育能力異常有關(guān)[19]。SR-B1-/-雌鼠卵巢內(nèi)的低α-T水平可能加劇卵巢內(nèi)氧化應(yīng)激狀態(tài)從而影響卵泡的正常發(fā)育，最終導(dǎo)致不孕。

在正常妊娠期間，母胎界面的母體面和胎兒面均有SR-B1的表達(dá)[32]。胚胎植入后的發(fā)育階段中，母體循環(huán)中的脂蛋白α-T轉(zhuǎn)運(yùn)入胚胎的過程依賴于此界面中的SR-B1分子。已有研究證實(shí)，胚胎期維生素E的缺乏可引起胚胎宮內(nèi)發(fā)育遲緩及出生后各種形態(tài)和功能上的異常[32-34]。SR-B1-/-小鼠胚胎在發(fā)育期間的α-T攝取不足甚至可導(dǎo)致神經(jīng)管閉合障礙，最終引起胎鼠的圍產(chǎn)期死亡[35]。SR-B1+/-雜合雌鼠與SR-B1-/-雄鼠配對(duì)后代中，SR-B1-/-仔鼠所占比例明顯少于孟德爾遺傳定律的50%，也就得到了合理的解釋。

三、總結(jié)與展望

SR-B1-/-雌鼠的不孕可能涉及到多重機(jī)制。就激素水平而言，應(yīng)激條件下的激素缺陷似乎并不能對(duì)此作出完全的解釋；膽固醇代謝方面，通過促進(jìn)SR-B1-/-雌鼠體內(nèi)的FC向CE轉(zhuǎn)化，可有效逆轉(zhuǎn)其不孕，這一結(jié)果明確了過量FC蓄積可引起的生育毒性；此外，SR-B1-/-雌鼠體內(nèi)異常升高的炎癥與氧化應(yīng)激水平可能干擾了卵母細(xì)胞和胚胎的正常發(fā)育，推動(dòng)了不孕的發(fā)展。

SR-B1-/-雌鼠不孕的機(jī)制尚未完全明確，相關(guān)的機(jī)制假說仍需進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)證實(shí)。對(duì)于臨床不孕女性患者，可針對(duì)其SCARB1基因展開一定的檢測(cè)，結(jié)合動(dòng)物模型的相關(guān)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，分析結(jié)果可能更有說服力。

針對(duì)SR-B1與女性不孕的相關(guān)研究為女性不孕的病因?qū)W提供了一個(gè)新的診斷方向，也為不明原因的不孕提供了一個(gè)新的治療方向。