李國(guó)臻,耿亞松,楊志偉,陶林林,段新崇,王鑫鑫
(邢臺(tái)不孕不育專(zhuān)科醫(yī)院,邢臺(tái)生殖與遺傳專(zhuān)科醫(yī)院,邢臺(tái) 054000)
隨著輔助生殖技術(shù)的成熟,胚胎學(xué)家逐漸把目光從提高妊娠率轉(zhuǎn)移到減少多胎妊娠率。減少多胎妊娠率最直接有效的辦法就是減少移植胚胎個(gè)數(shù)[1],那么如何在減少移植胚胎個(gè)數(shù)的同時(shí)保障高的妊娠率呢?多數(shù)研究著眼于胚胎優(yōu)選和改良操作方式保證移植胚胎的優(yōu)質(zhì)化[2-4]。影響ICSI結(jié)局的因素中以卵母細(xì)胞質(zhì)量最為重要,因此模擬體內(nèi)環(huán)境以保證卵母細(xì)胞培養(yǎng)體系穩(wěn)態(tài)成為各大生殖中心的首選方案[5]。
有研究提出人類(lèi)IVF實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行配子及胚胎體外操作容易造成溫度的改變,溫度改變對(duì)于卵母細(xì)胞紡錘體的損傷是不可逆的,嚴(yán)重影響卵母細(xì)胞的質(zhì)量[6]。而影響ICSI結(jié)局的因素中以卵母細(xì)胞質(zhì)量最為重要,卵母細(xì)胞紡錘體對(duì)于胞體和環(huán)境微小的改變都非常敏感[7-8]。因此如何在操作中盡可能減少環(huán)境的變化以減少對(duì)配子胚胎生長(zhǎng)發(fā)育潛能的危險(xiǎn)因素,成為胚胎學(xué)家最關(guān)心的話(huà)題。
本研究主要探討ICSI操作過(guò)程中兩個(gè)操作皿對(duì)妊娠結(jié)局的影響,通過(guò)比較實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的正常受精率、卵裂率、優(yōu)質(zhì)胚胎率、囊胚形成率、種植率、臨床妊娠率等,探究ICSI操作的改進(jìn)方法是否行之有效,以期獲得更好的妊娠結(jié)局,逐漸減少多胚胎移植增加單胚胎移植比例。
2016年1月至2017年7月在我中心行ICSI治療,獲卵數(shù)>6枚的363個(gè)周期;設(shè)對(duì)照組242個(gè)周期,在ICSI操作中應(yīng)用一個(gè)ICSI操作皿,每次注射5枚卵母細(xì)胞,操作皿重復(fù)使用;實(shí)驗(yàn)組121個(gè)周期,應(yīng)用兩個(gè)ICSI操作皿,每注射5枚卵母細(xì)胞更換一次ICSI操作皿(若卵母細(xì)胞數(shù)小于10枚,每次注射半數(shù)的卵母細(xì)胞),替換下來(lái)的ICSI皿置37℃培養(yǎng)箱內(nèi)復(fù)溫,兩個(gè)ICSI操作皿交替使用。胚胎培養(yǎng)室為(23±2)℃恒溫和40%~60%恒濕的弱光環(huán)境。
1.促排卵及穿刺取卵
促排卵均使用常規(guī)長(zhǎng)方案,女方在黃體期肌肉注射促性腺激素釋放激素類(lèi)似物(GnRHa)(達(dá)菲林,Ipsen Pharma Biotech,法國(guó)),達(dá)到降調(diào)目的后,給予重組促卵泡β素(普麗康,Merck Sharp & Dohme Limited,英國(guó))或尿促性素(樂(lè)寶得,麗珠制藥,珠海)促排卵,定期通過(guò)陰道B超監(jiān)測(cè)卵泡發(fā)育情況,當(dāng)1/3卵泡直徑≥1.8 cm時(shí)肌肉注射人絨毛膜促性腺激素(麗珠制藥,珠海)5 000~10 000 U,36.5 h左右B超引導(dǎo)下經(jīng)陰道穿刺取卵,卵冠丘復(fù)合體置于37℃、6% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3~4 h。
2.脫顆粒細(xì)胞
至少在取卵后1.5 h,用預(yù)熱的透明質(zhì)酸酶消化顆粒細(xì)胞,消化時(shí)間<60 s,用140 μm孔徑剝卵針?lè)磸?fù)吹打,直至將顆粒細(xì)胞完全脫離。
新鮮精液和凍存精液使用不連續(xù)密度梯度離心法或直接洗滌法,附睪和睪丸精子使用直接洗滌法,處理后計(jì)數(shù)精子密度和活率,放入培養(yǎng)箱中備用。
將卵母細(xì)胞和精子分別加入到蓋有礦物油(Vitrolife,瑞典)的操作微滴(配子和胚胎處理液,Vitrolife,瑞典)中,應(yīng)用顯微操作系統(tǒng)(Nikon,日本),用30度角ICSI針(Vitrolife,瑞典)在37℃恒溫下選擇形態(tài)正常、活力好的精子在聚乙烯毗咯烷酮尹汀(polyvinyl pyrrolidone,PVP)(LifeGlobal,美國(guó))中制動(dòng)并在卵母細(xì)胞液滴內(nèi)行穿刺注射。穿刺時(shí)使極體的方向處在6~7點(diǎn)或11~12點(diǎn)的位置,在3點(diǎn)鐘的位置注射精子。注射之后的卵母細(xì)胞放置在被覆礦物油的約25 μl卵裂培養(yǎng)液微滴(Vitrolife,瑞典)內(nèi),胚胎發(fā)育第3天轉(zhuǎn)入囊胚培養(yǎng)液(Vitrolife,瑞典)使用抽屜式培養(yǎng)箱(Astec,日本)37℃,6% CO2下培養(yǎng)。
1.受精與胚胎觀(guān)察
顯微注射授精后16~20 h,倒置顯微鏡(Nikon,日本)下觀(guān)察卵細(xì)胞有兩個(gè)原核(2PN)為正常受精。
2.根據(jù)卵裂球數(shù)、碎片、卵裂球大小均一程度對(duì)卵裂期胚胎進(jìn)行評(píng)分,優(yōu)選胚胎原則為:ICSI后68~72 h,6個(gè)≤細(xì)胞數(shù)≤10個(gè),卵裂球大小均勻,形態(tài)規(guī)則,透明帶完整,碎片<20%;D5或D6,采用Gardner[9]評(píng)分法進(jìn)行囊胚評(píng)分,優(yōu)選囊胚原則為:囊胚腔擴(kuò)張充滿(mǎn)整個(gè)胚胎,內(nèi)細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞密集,滋養(yǎng)層細(xì)胞數(shù)目多且均勻。
取卵當(dāng)日肌肉注射黃體酮注射液(浙江仙琚)進(jìn)行黃體支持。視HCG注射日E2水平,移植日給予適量雌二醇(補(bǔ)佳樂(lè),拜耳醫(yī)藥,德國(guó))補(bǔ)充。在胚胎發(fā)育第3天或第5天選擇良好胚胎1~3枚移植入子宮,移植當(dāng)日開(kāi)始使用黃體酮(安琪坦,博賞醫(yī)藥,法國(guó))口服或陰道上藥進(jìn)行黃體支持。移植后14 d查血HCG確定生化妊娠,移植后28 d B超檢查,見(jiàn)孕囊確定臨床妊娠。
正常受精率=正常受精卵數(shù)/成熟卵母細(xì)胞數(shù)×100%;卵裂率=正常受精卵裂數(shù)/正常受精卵數(shù)×100%;優(yōu)質(zhì)胚胎率=優(yōu)質(zhì)胚胎/正常受精的卵裂胚胎總數(shù)×100%;囊胚形成率=可用囊胚數(shù)/養(yǎng)囊胚胚胎總數(shù)×100%;種植率=孕囊數(shù)/移植胚胎數(shù)×100%;臨床妊娠率=臨床妊娠周期數(shù)/總移植周期數(shù)×100%。
2016年1月至2017年7月在我中心行ICSI治療的363個(gè)周期,分為對(duì)照組242個(gè)周期,實(shí)驗(yàn)組121個(gè)周期。兩組在年齡、不孕年限、體質(zhì)量指數(shù)、基礎(chǔ)FSH水平、基礎(chǔ)AMH、HCG日激素水平、不孕因素、移植日子宮內(nèi)膜厚度等方面無(wú)顯著性差異(P>0.05)(表1)。
表1 兩組患者基本情況比較[(-±s),%(n)]
實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的正常受精率、卵裂率和優(yōu)質(zhì)胚胎率之間無(wú)顯著性差異(P均>0.05);實(shí)驗(yàn)組的囊胚形成率顯著高于對(duì)照組(P<0.05)(表2)。
移植周期中實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組移植日子宮內(nèi)膜厚度和新鮮移植胚胎個(gè)數(shù)無(wú)顯著性差異(P均>0.05);實(shí)驗(yàn)組的新鮮周期移植種植率比對(duì)照組高,但差異無(wú)顯著性(P>0.05);實(shí)驗(yàn)組的臨床妊娠率顯著高于對(duì)照組(P<0.05)(表 3)。
表2 兩組間胚胎質(zhì)量比較[%(n)]
注:與對(duì)照組相比,*P<0.05
表3 兩組間新鮮移植妊娠結(jié)局比較[(-±s),%(n)]
注:與對(duì)照組相比,*P<0.05
ICSI的操作時(shí)間隨著獲卵數(shù)的增加而延長(zhǎng),ICSI操作皿在培養(yǎng)箱外的滯留時(shí)間也會(huì)延長(zhǎng)。雖然多數(shù)IVF實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)箱外的操作主要在含有HEPES/MOPS緩沖體系的培養(yǎng)液中進(jìn)行,可以有效降低CO2濃度改變帶來(lái)的pH值變化,但是操作在培養(yǎng)箱外持續(xù)暴露,很可能會(huì)引起ICSI操作微滴物理和化學(xué)的不穩(wěn)定性[10]。Bavister等[12]認(rèn)為紡錘體是卵母細(xì)胞的一個(gè)重要組成部分,在分裂中起著決定細(xì)胞極性的作用。紡錘體結(jié)構(gòu)上或功能上的非生理狀態(tài)會(huì)影響細(xì)胞分裂期的染色體正常分離和移動(dòng),造成細(xì)胞分裂錯(cuò)誤、染色體單倍體和多倍體的形成、非整倍體胚胎產(chǎn)生、受精卵發(fā)育異常和卵裂延遲等[11-12]。人類(lèi)IVF實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行配子及胚胎操作可能造成溫度的改變,卵母細(xì)胞紡錘體對(duì)于胞體和環(huán)境溫度的改變非常敏感[13-14],并且溫度改變對(duì)于卵母細(xì)胞紡錘體的損傷是不可逆的,會(huì)嚴(yán)重影響卵母細(xì)胞的質(zhì)量[15-16],而卵母細(xì)胞質(zhì)量是影響ICSI結(jié)局因素中最為重要的因素。因此,溫度的改變成為影響配子胚胎生長(zhǎng)發(fā)育潛能的關(guān)鍵因素。在本研究中使用兩個(gè)ICSI皿,通過(guò)交替使用的方法平衡和穩(wěn)定操作皿,減弱因培養(yǎng)箱外操作時(shí)間過(guò)長(zhǎng)引起培養(yǎng)體系的改變。結(jié)果顯示ICSI操作中使用兩個(gè)操作皿可以顯著提高囊胚形成率。推測(cè)兩個(gè)ICSI操作皿的交替平衡使用可能可以通過(guò)穩(wěn)定操作微滴的溫度從而減弱因ICSI操作皿中暴露時(shí)間過(guò)長(zhǎng)產(chǎn)生的胚胎發(fā)育潛能的危害。
綜上所述,本研究通過(guò)在ICSI操作中增加操作皿的方法顯著提高了囊胚形成率和ICSI新鮮移植周期的臨床妊娠率。我們推測(cè)培養(yǎng)箱外操作時(shí)間過(guò)長(zhǎng)可能會(huì)引起培養(yǎng)體系溫度的改變,溫度通過(guò)影響pH值間接和直接導(dǎo)致卵母細(xì)胞紡錘體形成和解聚紊亂可能是影響囊胚形成和ICSI周期臨床妊娠率的原因。因此,ICSI操作中通過(guò)使用兩個(gè)操作皿可能可以減弱環(huán)境的不穩(wěn)定因素對(duì)于胚胎發(fā)育潛能的危害[18-20],從而可以獲得更好的妊娠結(jié)局。