小麥低分子量麥谷蛋白亞基功能標記研究進展

高振賢, 曹 巧, 何明琦, 田國英, 王 飛, 單子龍, 韓 然

石家莊市農(nóng)林科學(xué)研究院小麥研究中心, 石家莊 050041

小麥(TriticumaestivumL.)是世界三大糧食作物之一，因其出色的加工特性成為人類食物中主要的能量和營養(yǎng)來源，小麥面團常被加工成各式各樣的食品，如面包、面條、糕點和餅干等[1]。小麥種子中的貯藏蛋白主要分為以單體形式存在的醇溶蛋白和以聚合體形式存在的麥谷蛋白，它們分別決定了面團的延展性和彈性[2,3]。根據(jù)麥谷蛋白在聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳中遷移率的不同，可將麥谷蛋白分為高分子量麥谷蛋白亞基(high molecular weight glutenin subunit，HMW-GS)和低分子量麥谷蛋白亞基(LMW-GS)，其中，低分子量麥谷蛋白大約占全部麥谷蛋白的60%，決定著面團的強度和粘度，對于面粉的加工品質(zhì)起著重要作用[4,5]，而其對面筋拉伸阻力和延展性參數(shù)的影響甚至超過HMW-GS[6,7]。

目前，已報道的LMW-GS家族表達序列標簽有100多個，部分LMW-GS的全長基因和假基因已被克隆測序[8]。Hai等[9]根據(jù)已知基因的N端保守序列，將檢索到的69個LMW-GS基因分為9組，每組均有相應(yīng)的引物。Ikeda等[10]根據(jù)已發(fā)表的LMW-GS基因序列開發(fā)設(shè)計了12對引物，將Norin 61小麥品種的LMW-GS分為相應(yīng)的12組，其中Glu-A3、Glu-B3和Glu-D3位點分別含有3組、2組和7組不同類型的DNA序列，隨后利用雙向電泳和質(zhì)譜技術(shù)鑒定了20個蛋白點，其中11個蛋白點分屬于12組中的10組，而其他9個蛋白點為醇溶蛋白；此外，還有2組未檢測到相應(yīng)蛋白點。蛋白檢測鑒定結(jié)果進一步表明，同一組中的多數(shù)蛋白點在不同品種間存在數(shù)目、分子量或酸堿性等差異[10]。上述研究表明，小麥LMW-GS蛋白等位變異與DNA變異之間的對應(yīng)關(guān)系十分復(fù)雜，針對不同LMW-GS類型開發(fā)特異功能標記，有助于建立兩者之間的關(guān)系。本文主要綜述了低分子量麥谷蛋白亞基的結(jié)構(gòu)特征、分類以及相關(guān)功能標記的研究進展，以期加速LMW-GS功能標記在優(yōu)質(zhì)小麥育種工作中的應(yīng)用進程。

1 LMW-GS結(jié)構(gòu)特征

小麥LMW-GS是一個復(fù)雜的多基因家族，大部分LMW-GS基因位于第一同源群染色體短臂上的Glu-A3、Glu-B3和Glu-D3位點[11]。隨后陸續(xù)發(fā)現(xiàn)其他LMW-GS位點，例如位于1B染色體上的Glu-B2和Glu-B4位點[12,13]，以及位于1D染色體上的Glu-D4位點和7D染色體上的Glu-D5位點[13]。編碼LMW-GS的基因不含內(nèi)含子，且開放閱讀框(open reading frame，ORF)近側(cè)的非編碼DNA序列有2個明顯特征，一是在啟動子區(qū)具有2個TATA框，二是具有雙重終止密碼子[14]。LMW-GS全長編碼序列的變化范圍在909～1 167 bp之間，對應(yīng)的成熟蛋白質(zhì)分子量大小在32～42.8 kDa之間。典型的LMW-GS包含6個主要結(jié)構(gòu)域：信號肽、N末端結(jié)構(gòu)域、重復(fù)域、C末端Ⅰ(半胱氨酸富集區(qū))、C末端Ⅱ(谷氨酰胺富集區(qū)，0～2個半胱氨酸)和C末端Ⅲ(1個保守的半胱氨酸)[15]。LMW-GS除了具有典型結(jié)構(gòu)域之外，在N端、C端和重復(fù)域中還存在廣泛的位點突變、堿基替換和片段缺失/插入[15]。

LMW-GS的半胱氨酸殘基可形成分子內(nèi)和分子間的二硫鍵，而半胱氨酸殘基的數(shù)量和位置對谷蛋白聚合物的結(jié)構(gòu)與功能具有重要的決定作用[16]。一般情況下，LMW-GS中有8個半胱氨酸殘基，其在LMW-GS中的分布有3種類型：①1個半胱氨酸位于N末端結(jié)構(gòu)域，其他半胱氨酸位于C末端；②1個半胱氨酸位于重復(fù)域，其他半胱氨酸位于C末端；③8個半胱氨酸全部位于C末端[16]。通常第1個、第7個半胱氨酸殘基參與形成分子間二硫鍵，而其他半胱氨酸殘基參與形成分子內(nèi)二硫鍵[17]。Zhao等[18]在小偃6號的Glu-D3位點克隆到1個含有9個半胱氨酸殘基的全長LMW-GS基因，推測其來源于染色體的同源重組，是小麥品質(zhì)改良的重要遺傳材料。

小麥LMW-GS中有1段富含谷氨酰胺的結(jié)構(gòu)域，該區(qū)域由12～25個重復(fù)基序組成，這些重復(fù)基序開始和結(jié)束于幾個谷氨酰胺，如PFSQQQ，也可以表示為QQQPFS[14,19]。Kreis等[12]認為LMW-GS的N端結(jié)構(gòu)域有2個一致的7肽重復(fù)基序，分別是PQQPPPFS和QQQQPVL。Cassidy和Dvorak[20]則提出了另一種短肽重復(fù)模式：PPFSQQQn。而Colot等[21]根據(jù)LMW-GS的N末端結(jié)構(gòu)域重復(fù)基序的DNA序列CAACAACAACC(A)CCATTTC(T)CA，提出QQQP(Q)PFP(S)重復(fù)基序特征。Cassidy等[14]對所有已報道的LMW-GS重復(fù)結(jié)構(gòu)域的DNA序列進行比較，發(fā)現(xiàn)重復(fù)基序的DNA特征為CCA1-2TTTT(C)CA(G)CAA(G)CAA1-4，然而，有的LMW-GS基因重復(fù)基序不同于上述模式且存在一定差異，但單個LMW-GS基因中的重復(fù)趨于均質(zhì)化。

上述LMW-GS基因和所編碼蛋白的結(jié)構(gòu)特征，如編碼序列的長度、單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)差異和蛋白保守序列等，為開發(fā)利用不同類型LMW-GS特異功能標記的引物設(shè)計提供了重要的參考信息。

2 LMW-GS分類

早期LMW-GS分類方法是根據(jù)蛋白質(zhì)的分子量和等電點，將其分為B、C、D組[11]。多數(shù)典型的LMW-GS均為B組，屬于堿性蛋白，分子量在40～50 kDa之間[17,22]。D組LMW-GS的N端氨基酸序列與ω-醇溶蛋白類似，但因其存在半胱氨酸殘基，參與谷蛋白聚合物形成，故將其歸于LMW-GS，其分子量比B組大，且僅在某些品種中表達[16,22,23]。與B組、D組的LMW-GS相比，C組LMW-GS蛋白的等電點從弱酸性到強堿性均有分布，分子量介于30～40 kDa之間，對其N端氨基酸序列分析顯示主要由與α/β和γ-醇溶蛋白類似成分組成，同時具有典型的LMW-GS的N端氨基酸序列SHIP或METS[16,17,24,25]。這一分類法存在明顯的缺陷，即B、D亞基易與小麥基因組(AABBDD)中B、D基因組混淆[26]。

另一種分類方法是根據(jù)成熟的LMW-GS的第一個氨基酸殘基的差異將其分為3種類型：LMW-m、LMW-i和LMW-s，分別表示首個氨基酸為蛋氨酸、絲氨酸和異亮氨酸的亞基類型[17,25,27]。3種類型亞基在其他方面也存在著明顯差別，如LMW-m型亞基分子量在30～40 kDa之間，LMW-s型亞基分子量在35～45 kDa之間，LMW-i型亞基分子量在38.9～42.6 kDa之間[1]，此外，LMW-i與LMW-m、LMW-s相比缺少短的N末端結(jié)構(gòu)域[28]。保守的半胱氨酸殘基對于LMW-GS的結(jié)構(gòu)和功能有著重要影響，但不同亞基類型的LMW-GS半胱氨酸殘基的相對位置也存在較大差異[16,29]。

小麥中LMW-GS存在廣泛的多態(tài)性[30]，Gupta和Shepherd[31]利用SDS-PAGE電泳對LMW-GS的組成開展研究，從32個國家收集的222份小麥品種中檢測到20種蛋白帶型，Glu-A3位點有6種等位蛋白類型，分別是a、b、c、d、e、f；Glu-B3位點有9種等位蛋白類型，分別是a、b、c、d、e、f、g、h、i；Glu-D3位點有5種等位蛋白類型，分別是a、b、c、d、e。McIntosh等[32]鑒定到了7個新的等位變異，分別是Glu-A3g、Glu-A3h、Glu-B3m、Glu-B3n、Glu-B3o、Glu-B3p和Glu-B3q。此外，利用特異引物進行PCR擴增，分離出若干LMW-GS基因，如Glu-A3位點的GluA3-1、GluA3-2和GluA3-3基因，Glu-B3位點的GluB3-1、GluB3-2、GluB3-3和GluB3-4基因，以及GluD3位點的GluD3-1、GluD3-2、GluD3-3、GluD3-4、GluD3-5和GluD3-6基因[8,33～35]。利用分子標記技術(shù)和全長基因克隆的方法檢測中國小麥微核心種質(zhì)的LMW-GS基因，結(jié)果表明，單個小麥品種中LMW-GS基因一般多于15個，其中，Glu-A3位點為4～6個，Glu-B3位點為3～5個，Glu-D3位點為8個[30]，但通常只有9～13個LMW-GS基因可以產(chǎn)生蛋白。研究表明，LMW-i位于Glu-A3位點，LMW-s位于Glu-B3和Glu-D3位點，而LMW-m在3個位點都可以檢測到[30]。目前開發(fā)的LMW-GS功能標記主要與蛋白等位變異的分類方法相對應(yīng)。

3 LMW-GS分子標記

已有研究常利用SDS-PAGE或反相高效液相色譜(reversed-phase high-performance liquid chromato-graphy，RP-HPLC)檢測小麥LMW-GS的組成和等位變異，但由于LMW-GS屬多基因家族，且在SDS-PAGE電泳中，部分LMW-GS與醇溶蛋白重疊，同時，實驗結(jié)果易受實驗人員操作熟練度的影響，限制了這一方法在小麥育種中早代群體檢測等方面的應(yīng)用[34,36,37]，因此，有必要開發(fā)功能標記以鑒定小麥中的LMW-GS[38]。

3.1 Glu-A3位點功能標記

Zhang等[39]從7個含不同Glu-A3等位基因的小麥品種中擴增出7個具有完整閱讀框的LMW-GS基因(Glu-A3a到Glu-A3g)，且均屬LMW-i型基因。其中，等位基因Glu-A3a、Glu-A3b、Glu-A3c、Glu-A3f和Glu-A3g分別編碼單個B型LMW-GS，Glu-A3d編碼2個B型LMW-GS，而Glu-A3e沒有檢測到蛋白產(chǎn)物[31,39]。比較這7個基因的DNA序列后發(fā)現(xiàn)其同源性較高，但存在1～37個SNP位點和1～5個插入/缺失片段，根據(jù)這些特征，設(shè)計了7對特異引物進行PCR擴增(表1)。其中，5對特異性引物可以成功區(qū)別Glu-A3a、Glu-A3d、Glu-A3e、Glu-A3f和Glu-A3g，但由于Glu-A3b特異SNP標記位于基因的重復(fù)區(qū)，未發(fā)現(xiàn)Glu-A3b的特異引物，因而，檢測Glu-A3b可以聯(lián)合使用GluA-3abc和Glu-A3a標記或者Glu-A3abc和Glu-A3ac標記。同時，由于Glu-A3c基因沒有可以區(qū)分其他6個等位基因的特異SNP標記，也未發(fā)現(xiàn)其特異引物，故可聯(lián)合使用Glu-A3ac和Glu-A3a標記檢測Glu-A3c[39]。

以含有不同LMW-GS等位變異的近等基因系A(chǔ)roona-A3a (Glu-A3a)、Aroona-A3b (Glu-A3b)、Aroona-A3c (Glu-A3c)、Aroona-A3d (Glu-A3d)、Aroona-A3e (Glu-A3e)、Aroona-A3f (Glu-A3f)和Glenlea (Glu-A3g)為材料，PCR擴增LMW-GS基因，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Glu-A3位點的每個LMW-GS蛋白對應(yīng)3個編碼序列等位變異，但只有1～2個編碼序列可編碼蛋白，其中，Glu-A3d和Glu-A3g基因型含有2個功能基因，其他5個基因型只有1個功能基因，在這些材料中共發(fā)現(xiàn)17個LMW-GS的等位變異，但是其中包含8個假基因[33]，這可能是導(dǎo)致Glu-A3位點蛋白條帶比Glu-B3和Glu-D3位點少的原因[31]。為了鑒定Glu-A3位點單倍型(基因水平)和蛋白等位變異(蛋白水平)之間的關(guān)系，并解決現(xiàn)有檢測方法耗時的弊端(即檢測1個品種用多個標記)，Wang等[33]開發(fā)了一套將序列標簽位點(sequence tagged sites，STS)標記與多重PCR結(jié)合的方法用來檢測小麥Glu-A3位點等位變異。新開發(fā)的7個STS標記中，有6對特異性引物可以成功區(qū)別Glu-A3a、Glu-A3b、Glu-A3d、Glu-A3e、Glu-A3f和Glu-A3g，只有1對引物同時擴增Glu-A3a和Glu-A3c。同時，采用多重PCR法可以經(jīng)濟快速的鑒定Glu-A3位點的等位變異，開發(fā)了4組多重PCR組合，分別是Glu-A3b+Glu-A3f，Glu-A3d+Glu-A3f，Glu-A3d+Glu-A3g和Glu-A3b+Glu-A3e，顯著提高了鑒定效率[33]。將這些功能標記用于CIMMYT小麥品種及其高代品系和捷克摩拉維亞地區(qū)不同籽粒顏色小麥品種中Glu-A3位點的鑒定，結(jié)果表明鑒定準確可靠[33,40]。

Ikeda等[10]利用雙向電泳，發(fā)現(xiàn)Norin 61小麥(Glu-A3d)中有4個蛋白點來自Glu-A3位點的2種基因類型，而其他類型(Glu-A3a、Glu-A3b、Glu-A3c或Glu-A3f)小麥品種Glu-A3位點只對應(yīng)1個蛋白點，說明Glu-A3d蛋白等位變異對應(yīng)更多的功能編碼基因或蛋白修飾。品質(zhì)檢測結(jié)果顯示，Glu-A3d較其他等位變異更有助于提高面條的品質(zhì)和面團的強度[41]，而Norin 61小麥(Glu-B3i)Glu-B3位點的同一個基因可編碼2種類型的亞基(LMW-m和LMW-s)，說明LMW-GS存在翻譯后加工，此外，蛋白點的豐度在不同小麥品種中也存在較大差異[10]，這些都可能影響小麥的最終品質(zhì)，因此，在今后育種過程中，需注重和加強利用功能基因標記選取優(yōu)良LMW-GS類型并采取有效栽培措施提高其表達豐度。

3.2 Glu-B3位點功能標記

Glenlea是加拿大西部的一個強筋春小麥品種，Huang和Cloutier[34]利用Glenlea小麥品種構(gòu)建BAC文庫，在Glu-B3位點鑒定到2個LMW-GS基因，分別為LMW-m型和LMW-s型。而在Dong等[1]利用小偃54小麥品種構(gòu)建的BAC文庫中，在Glu-B3位點鑒定到3個LMW-GS基因，其中，B3-1和B3-2分別編碼LMW-m和LMW-s型的LMW-GS，而B3-3編碼了1個編碼區(qū)插入1個轉(zhuǎn)座子的LMW-s型假基因。此外，根據(jù)LMW-GS的N端和C端保守氨基酸序列設(shè)計PCR引物，從Norin 61的cDNA文庫以及基因組DNA中獲得了包括假基因在內(nèi)的106個全長的LMW-GS基因，并根據(jù)推導(dǎo)的氨基酸序列將其分成12組[29]。Glu-B3位點LMW-GS基因序列的獲得為該位點功能標記的開發(fā)提供參考。

Zhao等[42]根據(jù)已經(jīng)公布的Glu-B3基因序列(GenBank登錄號為AB062852、AB062853和AB062860的3個序列)，首先與NCBI中EST和NR數(shù)據(jù)庫進行比對，然后根據(jù)比對結(jié)果中SNP差異設(shè)計引物，結(jié)果找到了AB062852和另外兩個BF293671和AY831800代表的Glu-B3基因的特異引物，由于不能確定Glu-B3基因與其編碼等位蛋白之間的關(guān)系，這些標記無法區(qū)分Glu-B3位點a、b、c、d、e、f、g、h和i的蛋白等位類型。后來，根據(jù)7個LMW-GS基因(GenBank登錄號分別為AB119006、AB164415、AB164416、AB262661、Y14104、AB062852和AJ007746)和1個與Glu-B3高度相似的序列(AY542898)，設(shè)計了63個引物，共378種引物組合，利用這些引物在Aroona近等基因系A(chǔ)roona-B3a (Glu-B3a)、Aroona-B3c (Glu-B3c)、Aroona-B3d (Glu-B3d)、Aroona-B3f (Glu-B3f )、Aroona-B3g (Glu-B3g)、Aroona-B3h (Glu-B3h)、Aroona-B3i (Glu-B3i)和Cheyenne(Glu-B3e )中分離Glu-B3基因并開發(fā)成分子標記，研究發(fā)現(xiàn)4個Glu-B3基因，分別是GluB3-1、GluB3-2、GluB3-3和GluB3-4，包含17個等位變異[43]。其中，GluB3-1基因檢測到5種單倍型(或者等位變異)，命名為GluB3-11、GluB3-12、GluB3-13、GluB3-14和GluB3-15，分別對應(yīng)Aroona-B3a、Aroona-B3b、Cheyenne (Glu-B3e)、Aroona-B3f和Aroona-B3g；GluB3-2基因檢測到3個單倍型，分別命名為GluB3-21、GluB3-22和GluB3-23，GluB3-21對應(yīng)Aroona-B3a，GluB3-22對應(yīng)Aroona-B3b、Cheyenne (Glu-B3e)和Aroona-B3f，GluB3-23對應(yīng)Aroona-B3g；GluB3-3基因檢測到4個單倍型，分別命名為GluB3-31、GluB3-32、GluB3-33和GluB3-34，分別對應(yīng)Aroona-B3c、Aroona-B3d、Aroona-B3h和Aroona-B3i；GluB3-4基因檢測到5個單倍型，分別命名為GluB3-41、GluB3-42、GluB3-43、GluB3-44和GluB3-45，GluB3-41對應(yīng)Aroona-B3b、Aroona-B3c和Aroona-B3d，GluB3-42對應(yīng)Aroona-B3b，GluB3-43對應(yīng)Cheyenne (Glu-B3e)和Aroona-B3h類型，GluB3-44對應(yīng)Aroona-B3f和Aroona-B3g，GluB3-45對應(yīng)于Aroona-B3i[43]。以上這些等位變異都源于SNP或者小片段的插入/缺失，每個蛋白的等位變異會對應(yīng)1個或多個單倍型[43]。將這些序列比對后在有差異的位置(SNP或插入/缺失)設(shè)計引物，用于分辨小麥Glu-B3位點的9個蛋白的等位變異。多數(shù)蛋白等位變異可以用一對引物進行有效擴增和分辨，只有Glu-B3f沒有特異的PCR引物，需要2對引物(SB6F/SB6R和SB7FSB7R)進行校正[43]。

Wang等[43]用Glu-B3位點的10個功能標記檢測161份小麥品種或品系，只有5個品種檢測結(jié)果與SDS-PAGE的檢測結(jié)果不符，這主要是由SDS-PAGE技術(shù)檢測LMW-GS時的低分辨率和品種的低純度導(dǎo)致的。研究表明，在Glu-B3位點現(xiàn)有10個用于區(qū)分蛋白等位變異的特異性標記可用于小麥品質(zhì)改良的分子設(shè)計育種工作。

3.3 Glu-D3位點功能標記

與Glu-A3、Glu-B3位點相比，Glu-D3位點編碼LMW-GS的可用信息較少，很難通過SDS-PAGE電泳分離[41,44]。從8個小麥品種Tasman、中國春(Chinese Spring)、Silverstar、Sunco、Aroona、Norin61、Hartog和BT2288A中獲得3個Glu-D3基因，分別是GluD3-1、GluD3-2和GluD3-3，包括7個等位變異，GluD3-1有2個等位變異，GluD3-2有3個等位變異，GluD3-3有2個等位變異[35]。經(jīng)DNA序列分析發(fā)現(xiàn)，這3個基因序列同源性在81.5%～88.5%之間，單個基因的不同等位變異(單倍型)之間的相似性高達99.3%～99.9%。此外，GluD3-1的上游序列比GluD3-2和GluD3-3長約500 bp，序列比對后發(fā)現(xiàn)基因文庫中仍有LMW-GS基因序列與GluD3-1、GluD3-2和GluD3-3不匹配[35]。隨后又從上述8個小麥品種中獲得3個Glu-D3基因，分別是GluD3-4、GluD3-5、GluD3-6，包括5個等位變異，其中，GluD3-4有3個單倍型，GluD3-5和GluD3-6各1個單倍型[8]。根據(jù)Glu-D3位點的12個等位變異，開發(fā)了7個STS標記，這7個標記的引物M2F12/M2R12、M2F2/M2R2、M2F3/M2R3、M3F1/M3R1、M3F2/M3R2、M4F1/M4R1和M4F3/M4R3分別可特異擴增GluD3-21/22、GluD3-22、GluD3-23、GluD3-31、GluD3-32、GluD3-41和GluD3-43[8]。由于GluD3-5和GluD3-6在8個小麥品種中只存在1個等位變異，無法根據(jù)單倍型間的差異開發(fā)出相應(yīng)的特異標記；GluD3-1的2種單倍型存在差異，即這2種單倍型在一段含有11個重復(fù)CAA堿基序列中存在1個CAA的插入/缺失的差異，但據(jù)此差異開發(fā)的標記不能有效區(qū)分這2種單倍型；根據(jù)GluD3-2基因3個單倍型的SNP差異開發(fā)的功能標記，M2F12/M2R12、M2F2/M2R2、M2F3/M2R3擴增產(chǎn)生884 bp、958 bp和725 bp不同長度的片段，分別對應(yīng)等位基因GluD3-21/22、GluD3-22和GluD3-23；GluD3-3有2對引物，M3F1/M3R1在單倍型GluD3-31中擴增產(chǎn)生528 bp片段，M3F2/M3R2在單倍型GluD3-32擴增產(chǎn)生334 bp片段；GluD3-4有2對引物，M4F1/M4R1在單倍型GluD3-41擴增產(chǎn)生773 bp片段，M4F3/M4R3在單倍型GluD3-43擴增產(chǎn)生413 bp片段[8]。

此外，Zhao等[42]根據(jù)小麥(AABBDD)D組供體粗山羊草(Aegilopstauschii)的7個LMW-GS基因序列，分別設(shè)計7對等位基因特異性PCR(allele-specific PCR，AS-PCR)引物擴增小麥Glu-D3基因，從5個含不同Glu-D3等位基因(a、b、c、d和e)的小麥品種以及粗山羊草的PCR擴增結(jié)果中發(fā)現(xiàn)， S13F2/S13R1特異擴增Glu-D3c、d的等位變異，其對應(yīng)粗山羊草AY585356基因序列；S1F1/S1R2擴增時發(fā)現(xiàn)1個SNP位點，根據(jù)這一特點，重新設(shè)計1條反向引物S1R3，利用S1F1/S1R3特異檢測Hartog小麥(Glu-D3e)的等位變異，對應(yīng)粗山羊草中AY585350基因序列；同時，根據(jù)已有的Glu-D3的基因序列，選擇GenBank登錄號為AB062851、AB062865和AB062872的3條序列，與NCBI中EST和NR數(shù)據(jù)庫進行比對，根據(jù)SNP設(shè)計引物，T1F4/T1R1可以特異擴增AB062872。但截至目前，已開發(fā)的Glu-D3位點的功能標記與Glu-A3和Glu-B3相比還有差距，只能區(qū)分該位點的一些單倍型，不能很好的區(qū)別等位蛋白類型，導(dǎo)致Glu-D3位點標記在育種中的應(yīng)用受到限制。

4 展望

SDS-PAGE電泳、雙向電泳、基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜(matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF-MS)和PCR擴增常被用于檢測小麥中的LMW-GS等位類型，但是每種方法都有一定的局限性[44,45]。SDS-PAGE技術(shù)使用最為廣泛，但因帶型復(fù)雜，對結(jié)果的判讀和分析要求技術(shù)含量高，容易造成誤判，此外，和醇溶蛋白的蛋白條帶重疊，會降低部分等位基因判讀的可靠性；雙向電泳根據(jù)蛋白質(zhì)的等電點和分子量的不同進行分離，分辨率高，近年來鑒定出一批利用SDS-PAGE無法觀察到的新等位變異，然而不是所有低分子量谷蛋白亞基等位變異均可用雙向電泳鑒別出來；MALDI-TOF-MS能夠較好的區(qū)分Glu-D3位點的等位變異，但是對Glu-A3和Glu-B3位點等位變異的識別效果不佳，此外，該方法需要昂貴的儀器，限制了其在育種中的應(yīng)用。與以上3種方法相比，PCR擴增是最簡單的一種方法，已開發(fā)Glu-A3和Glu-B3位點常見的等位基因的功能標記，只需進行常規(guī)PCR擴增和檢測就可以明確其攜帶LMW-GS的等位變異，該方法目前正逐漸應(yīng)用到小麥育種工作中，但是一些稀有的、陸續(xù)被發(fā)現(xiàn)和鑒定的LMW-GS等位基因尚未開發(fā)出功能標記，不能用該種方法檢測；同時該方法檢測Glu-D3位點的等位變異效果不佳，主要由于Glu-D3位點序列相似程度最高[45]。目前，共有7個和10個功能標記分別用于Glu-A3和Glu-B3位點的檢測，多重PCR的使用被證明可以提高這些標記選擇的有效性[33,35,46]。

大規(guī)?；蚪M測序與相關(guān)生物信息學(xué)挖掘加速了對小麥基因組結(jié)構(gòu)和功能的分析，現(xiàn)已逐步公布中國春小麥、節(jié)節(jié)麥、烏拉爾圖小麥的全基因組序列的數(shù)據(jù)，為小麥大規(guī)?；蚩寺『蚐NP標記開發(fā)提供了可能。特別是中國春小麥各染色體上的DNA序列組裝工作取得重大進展(http://www.wheatgenome.org/)，為開發(fā)功能標記提供了模板，加快了功能標記開發(fā)速度[47]。

同時，揭示LMW-GS基因的等位變異與品質(zhì)之間關(guān)系對進一步提高小麥加工品質(zhì)具有重要作用。目前，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)一些LMW-GS的等位變異較其他等位基因?qū)γ鎴F品質(zhì)有正效應(yīng)[48,49]，如不同Glu-3等位基因?qū)ψ畲罄熳枇Φ挠绊懘嬖诓町怺46]。

綜上所述，國內(nèi)外已開發(fā)出一些LMW-GS功能標記并應(yīng)用于小麥品種LMW-GS檢測，但是對于不同標記類型與小麥品質(zhì)的關(guān)系研究較少，今后將陸續(xù)開發(fā)出更多的LMW-GS功能標記，研究不同類型LMW-GS對品質(zhì)的貢獻，對小麥加工品質(zhì)的改良具有重要意義。

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