蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在肉類鑒別及肉質(zhì)分析中的應(yīng)用進(jìn)展

胡爭(zhēng)艷, 王軍淋, 吳平谷, 王天嬌, 王立媛, 湯 鋆

浙江省疾病預(yù)防控制中心, 杭州 310051

隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和人民生活水平的提高，人們對(duì)肉食的需求量越來(lái)越大，同時(shí)也對(duì)肉類的品質(zhì)提出了更高的要求。此外，多種市售深加工肉制品因其食用方便受到了廣大消費(fèi)者的歡迎，但是這也對(duì)深加工肉制品(特別是熟肉制品)中肉類的鑒別及其品質(zhì)把控提出了挑戰(zhàn)。

目前，肉制品中肉類的鑒別方法主要包括[1～3]：以DNA檢測(cè)為基礎(chǔ)的多重PCR法、限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性PCR法、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性PCR法、熒光定量PCR法等；以蛋白質(zhì)檢測(cè)為基礎(chǔ)的電泳分析法、免疫分析法、色譜分析法等；還有紅外光譜法、核磁法、電子鼻技術(shù)等。雖然這些檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展已經(jīng)明顯提高了肉類鑒別的精確度和靈敏度，但是也都存在著較大的局限性。其中，PCR法因其具有較好的檢測(cè)靈敏度和特異性，目前應(yīng)用較為廣泛，但由于PCR法容易出現(xiàn)交叉污染，因此對(duì)于樣本制備的要求較高，而且容易受到肉制品加工過(guò)程中出現(xiàn)的DNA降解、復(fù)雜基質(zhì)干擾等因素的影響而出現(xiàn)假陽(yáng)性或假陰性的鑒定結(jié)果[4]。而蛋白質(zhì)電泳法不適用于深加工及混合不同肉類的肉制品的分析。免疫分析法對(duì)于親緣關(guān)系較近的物種易出現(xiàn)交叉反應(yīng)，產(chǎn)生假陽(yáng)性結(jié)果，且單克隆抗體雖然能大幅提高檢測(cè)特異性，但其制備成本昂貴、步驟繁雜，因此難以推廣應(yīng)用。另外，在肉制品的加工過(guò)程中蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)會(huì)發(fā)生不可逆的改變，導(dǎo)致其溶解性降低，難以采用色譜分析法進(jìn)行檢測(cè)。雖然，紅外光譜法、核磁法具有檢測(cè)快速無(wú)損耗、無(wú)需樣品前處理的優(yōu)點(diǎn)，但其精確度較低且不適用于復(fù)雜混合樣品的檢測(cè)。而電子鼻技術(shù)目前仍處于發(fā)展階段，其在肉制品檢測(cè)中的靈敏度、識(shí)別率等尚未達(dá)到令人滿意的程度。因此，蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展為探索肉制品中肉類的鑒別提供了新的研究思路。

肉的品質(zhì)是指與肉的外觀、適口性和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值等有關(guān)的物理、化學(xué)特性的綜合體現(xiàn)，包括肉的顏色、pH、保水性指標(biāo)(滴水損失)等，是決定消費(fèi)者感官享受的重要因素[5]。一般來(lái)說(shuō)，肉質(zhì)的形成受到多種因素的影響，其中包括遺傳(品種、基因型等)、營(yíng)養(yǎng)因素(氨基酸水平、飼料添加劑等)、飼養(yǎng)方式、屠宰和儲(chǔ)存條件等[6]，然而，影響其品質(zhì)形成的潛在分子機(jī)制尚未研究清楚。而蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的應(yīng)用為探索肉類品質(zhì)形成的影響因素提供了新的研究視角。雖然，目前蛋白質(zhì)組學(xué)在肉類鑒別和肉質(zhì)研究中的應(yīng)用尚處于早期階段，但已經(jīng)展現(xiàn)出了較好的前景。本文將對(duì)蛋白質(zhì)組學(xué)的定義、主要研究策略及其在肉類鑒別和肉質(zhì)研究中的應(yīng)用進(jìn)行介紹。

1 蛋白質(zhì)組學(xué)及其主要研究策略

作為后基因組時(shí)代的核心，蛋白質(zhì)組學(xué)(proteomics)是指通過(guò)生物及化學(xué)方法對(duì)細(xì)胞、組織等生物體內(nèi)的蛋白質(zhì)進(jìn)行全面分析的一門(mén)學(xué)科[7]。傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)樣品分析通常是基于二維凝膠電泳(2D SDS-PAGE)色譜系統(tǒng)，它具有蛋白分離效率高的特點(diǎn)，但也存在操作步驟繁瑣、重現(xiàn)性差、不適合分離疏水性蛋白及分子量極大或極小的蛋白等問(wèn)題。此外，分離后蛋白質(zhì)的鑒定需要通過(guò)Edman降解法進(jìn)行氨基酸測(cè)序，極大程度上限制了蛋白質(zhì)樣品分析的通量[8～10]。20世紀(jì)90年代以來(lái)，生物質(zhì)譜技術(shù)的不斷發(fā)展，實(shí)現(xiàn)了蛋白質(zhì)樣品的大規(guī)模分析，使蛋白質(zhì)組學(xué)研究取得了突破性進(jìn)展?；谏镔|(zhì)譜的蛋白質(zhì)分析法現(xiàn)已成為蛋白質(zhì)組學(xué)研究的核心內(nèi)容[11,12]。

隨著蛋白質(zhì)組學(xué)研究的不斷深入，僅提供蛋白質(zhì)鑒定信息的分析策略已不能滿足當(dāng)前研究工作的需要，而準(zhǔn)確地定位生物體不同狀態(tài)下發(fā)生變化的蛋白質(zhì)則是目前研究的難點(diǎn)，這對(duì)蛋白質(zhì)定量分析技術(shù)即差異蛋白質(zhì)組學(xué)的發(fā)展提出了要求。傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)定量分析主要是通過(guò)2D SDS-PAGE顯色反應(yīng)來(lái)實(shí)現(xiàn)的，其能同時(shí)定量上千種蛋白質(zhì)的表達(dá)差異，是蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)早期應(yīng)用于肉質(zhì)分析中的主要研究方法。

近年來(lái)，隨著質(zhì)譜技術(shù)的發(fā)展，基于質(zhì)譜分析的定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)也得到了快速發(fā)展，被廣泛應(yīng)用于生命活動(dòng)的研究中。基于質(zhì)譜技術(shù)的蛋白質(zhì)定量策略主要有無(wú)標(biāo)記定量和同位素標(biāo)記相對(duì)定量?jī)煞N方法(表1)。無(wú)標(biāo)記定量技術(shù)是基于多次質(zhì)譜分析的結(jié)果，因此，樣品分析時(shí)要求穩(wěn)定的液相色譜分離系統(tǒng)及良好的質(zhì)譜采集數(shù)據(jù)重現(xiàn)性，以保證定量結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。但同時(shí)由于其不需要對(duì)樣品進(jìn)行同位素標(biāo)記等步驟，不會(huì)增加樣品的復(fù)雜程度，操作簡(jiǎn)單，現(xiàn)多應(yīng)用于肉質(zhì)分析領(lǐng)域。而同位素標(biāo)記定量技術(shù)根據(jù)同位素標(biāo)記引入的方式又分為體內(nèi)標(biāo)記和體外標(biāo)記。其中，體內(nèi)標(biāo)記方法省去了標(biāo)記反應(yīng)和分離純化的步驟，減少了樣品的損失，提高了蛋白質(zhì)定量的準(zhǔn)確性，但是，重同位素標(biāo)記蛋白質(zhì)的標(biāo)記周期較長(zhǎng)、成本較高。體外標(biāo)記方法主要包括通過(guò)將標(biāo)記試劑與蛋白質(zhì)或肽段中的氨基酸反應(yīng)引入穩(wěn)定同位素的化學(xué)標(biāo)記方法以及在蛋白質(zhì)的酶解過(guò)程中引入穩(wěn)定同位素的酶解標(biāo)記方法(酶促標(biāo)記)。其中，二甲基標(biāo)記技術(shù)因具有標(biāo)記效率高、反應(yīng)迅速、標(biāo)記試劑價(jià)格低等優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)成為應(yīng)用最為廣泛的化學(xué)標(biāo)記方法。而酶解標(biāo)記方法主要是指蛋白質(zhì)在酶解的過(guò)程中使用H218O，在蛋白酶的作用下使肽段C端增加2個(gè)18O原子，從而實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)的定量分析。目前，基于同位素標(biāo)記的定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)也已開(kāi)始逐漸應(yīng)用于肉質(zhì)分析的研究中。

然而，上述蛋白質(zhì)組學(xué)的定量方法均是通過(guò)高分辨質(zhì)譜檢測(cè)而實(shí)現(xiàn)的生物樣本中信號(hào)強(qiáng)度較強(qiáng)(較高豐度)的蛋白質(zhì)的相對(duì)定量，具有高通量的優(yōu)點(diǎn)，但也表現(xiàn)出明顯的局限性，即上述方法中蛋白質(zhì)的定量結(jié)果具有非靶向性，而且無(wú)法實(shí)現(xiàn)樣品中信號(hào)強(qiáng)度較弱(較低豐度)的蛋白質(zhì)的定量，約束了檢測(cè)的靈敏度。因此，為了增加蛋白質(zhì)定量分析的特異性和準(zhǔn)確性，提高對(duì)于目標(biāo)蛋白質(zhì)(尤其是低豐度目標(biāo)蛋白質(zhì))定量分析的靈敏度，以蛋白質(zhì)的特異性肽段為分析對(duì)象的靶向蛋白質(zhì)組學(xué)定量方法逐步得到了發(fā)展[25]。靶向蛋白質(zhì)組學(xué)定量方法主要包括2種技術(shù)：選擇/多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(selected/multiple reaction monitoring，SRM/MRM)[26,27]和平行反應(yīng)監(jiān)測(cè)(parallel reaction monitoring，PRM)[28,29]。SRM/MRM技術(shù)是利用三重四級(jí)桿質(zhì)譜對(duì)目標(biāo)蛋白質(zhì)中特定肽段的母離子和子離子依次進(jìn)行分選，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)蛋白的定量分析，具有靈敏度高、準(zhǔn)確性好的特點(diǎn)。而PRM技術(shù)則是在SRM/MRM的基礎(chǔ)上，同時(shí)利用了四級(jí)桿的高選擇性以及靜電場(chǎng)軌道阱(Orbitrap)的高分辨率、高精度的特性來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)蛋白的定量分析，具有更加優(yōu)異的抗干擾能力和檢測(cè)靈敏度。目前，靶向蛋白質(zhì)組學(xué)定量方法在肉類鑒定方面得到了廣泛的應(yīng)用。

表1 定量蛋白質(zhì)組學(xué)主要分析方法Table 1 The main analysis methods of quantitative proteomics.

注：+和++分別代表標(biāo)記效率較高、非常高；￥、￥￥和￥￥￥分別代表定量分析成本較便宜、較高、非常高。

通過(guò)數(shù)據(jù)分析對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行鑒定是蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的核心步驟之一。主要利用生物信息學(xué)技術(shù)，采用特定的算法，根據(jù)蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)酶解得到的多肽分子量與蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，從而鑒定出樣品中的蛋白質(zhì)種類。目前，用于蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)鑒定的數(shù)據(jù)庫(kù)主要是NCBI(National Center for Biotechnology Information database)數(shù)據(jù)庫(kù)和UniProt KB(Universal Protein Knowledgebase)數(shù)據(jù)庫(kù)；用于蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)鑒定的軟件較多，較為常用的有Mascot、Protein Pilot、MaxQuant和X!Tandem等。

2 蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在肉類鑒別及肉質(zhì)分析中的應(yīng)用

近年來(lái)，基于生物質(zhì)譜技術(shù)的蛋白質(zhì)組學(xué)方法得到了較快的發(fā)展，已被廣泛用于深加工肉制品中肉類的鑒別、肉質(zhì)特性(顏色、嫩度等)分析的相關(guān)研究中。而蛋白質(zhì)組學(xué)的研究結(jié)果表明，肉質(zhì)特性與其所含的蛋白質(zhì)分子密切相關(guān)。

2.1 肉類品種鑒別

蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)應(yīng)用于肉類品種的鑒別時(shí)，其主要研究策略為：首先提取待測(cè)肉制品所使用的原料肉中的蛋白質(zhì)，經(jīng)蛋白酶解、除雜凈化后，利用高分辨質(zhì)譜技術(shù)進(jìn)行多肽鑒定(自下而上的蛋白質(zhì)組學(xué)分析方法，bottom-up strategy)，并將鑒定結(jié)果與蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)(如UniProt等)進(jìn)行比對(duì)，篩選出具有良好穩(wěn)定性、物種特異性的1條或多條多肽標(biāo)志物，然后建立上述多肽標(biāo)志物的質(zhì)譜MRM定性、定量分析方法，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)肉制品中肉類的鑒別和摻假鑒定。該方法與應(yīng)用較為廣泛的PCR法相比，不僅具有良好的檢測(cè)靈敏度和特異性，還具有更為突出的優(yōu)點(diǎn)：多肽的穩(wěn)定性強(qiáng)于DNA，待檢樣品不易受到肉制品加工過(guò)程的影響；可通過(guò)多條肽段標(biāo)志物進(jìn)行定性、定量分析，不僅能夠保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性，且能避免出現(xiàn)假陽(yáng)性現(xiàn)象；樣品處理相對(duì)簡(jiǎn)單，且MRM分析速度快、檢測(cè)通量高，可以對(duì)肉制品中多物種進(jìn)行同時(shí)溯源分析和鑒定。例如，Wulff等[30]通過(guò)自下而上的蛋白質(zhì)組學(xué)分析方法，建立了22種不同種類魚(yú)肉組織的肽段質(zhì)譜圖譜數(shù)據(jù)庫(kù)，從而通過(guò)將未知魚(yú)肉組織的肽段質(zhì)譜分析圖譜與已建立的質(zhì)譜圖譜數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)來(lái)實(shí)現(xiàn)鑒定魚(yú)肉種類的目的，而且該方法適用于經(jīng)過(guò)深加工的魚(yú)肉種類的鑒別。另外，Montowska等[31]利用無(wú)標(biāo)記相對(duì)定量蛋白質(zhì)組學(xué)的方法建立了禽類深加工肉制品中是否摻假的判斷方法。該研究通過(guò)定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)得到了雞肉、鴨肉和鵝肉3種禽肉中具有熱穩(wěn)定性和物種特異性的20個(gè)肽段標(biāo)志物，以用于3種禽肉加工產(chǎn)品中肉類的鑒定，該方法可以識(shí)別出3種禽肉混合物中摻雜低至1%的豬肉以及市售禽肉香腸中摻雜低至0.8%的牛肉蛋白，具有非常高的靈敏度。

2.2 新鮮肉與凍融肉的鑒別

肉類的儲(chǔ)存和加工方式會(huì)影響其肉質(zhì)的變化。冷凍一直被視作是肉類保存的最佳方法，然而，肉在冷凍的同時(shí)會(huì)伴隨著品質(zhì)的下降。這是由于冷凍時(shí)冰晶的形成會(huì)導(dǎo)致肉的組織結(jié)構(gòu)破壞、機(jī)械張力破壞、蛋白變性等一系列生化和物理指標(biāo)的變化，因而，一般來(lái)說(shuō)冷凍肉的價(jià)格會(huì)低于新鮮肉，然而，一些不法商家為了追求利益最大化會(huì)將冷凍肉融化來(lái)冒充新鮮肉進(jìn)行銷售，因此，開(kāi)發(fā)有效的區(qū)分新鮮肉和凍融肉的方法成為了研究熱點(diǎn)。Kim等[32]首次利用2D SDS-PAGE結(jié)合生物質(zhì)譜的方法對(duì)新鮮豬胸最長(zhǎng)肌(1.0±0.5℃儲(chǔ)存60 h)和經(jīng)過(guò)凍融過(guò)程的豬胸最長(zhǎng)肌(-20℃冷凍48 h后，1.0±0.5℃解凍12 h)的肉滲出液進(jìn)行了差異蛋白質(zhì)組學(xué)分析。結(jié)果顯示，2種豬胸最長(zhǎng)肌滲出液2D SDS-PAGE分別檢測(cè)到450個(gè)蛋白點(diǎn)，其中24個(gè)蛋白點(diǎn)的豐度表現(xiàn)出顯著性差異，經(jīng)質(zhì)譜分析進(jìn)一步確證后，共發(fā)現(xiàn)22個(gè)可用于區(qū)分新鮮豬胸最長(zhǎng)肌和經(jīng)過(guò)凍融過(guò)程的豬胸最長(zhǎng)肌的潛在蛋白標(biāo)志物(包括鈣網(wǎng)蛋白、脯氨酰羥化酶β亞基前體蛋白、血紅蛋白α鏈、血紅蛋白β鏈和丙酮酸激酶亞型3等)。這一研究表明差異蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的應(yīng)用成功實(shí)現(xiàn)了新鮮肉和凍融肉的判別，同時(shí)也為蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)用于研究其他儲(chǔ)存方式和加工方式對(duì)肉質(zhì)的影響奠定了理論基礎(chǔ)。

2.3 肉的嫩度

肉的嫩度、色澤和風(fēng)味等均是關(guān)系到消費(fèi)者滿意度的重要屬性(肉的適口性)，其中，嫩度是最重要的組成因素，同時(shí)也是不同肉類間差異最大的屬性之一。肉的嫩度通常被認(rèn)為是生物體內(nèi)溶酶體酶、組織蛋白酶、鈣激活中性蛋白酶和蛋白酶體等多種內(nèi)源性蛋白酶經(jīng)過(guò)一系列的生化反應(yīng)導(dǎo)致的肌原纖維和結(jié)締組織弱化的結(jié)果[33]。而隨著雙向電泳(2-DE)、生物質(zhì)譜和生物信息學(xué)的不斷發(fā)展，蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)已成為闡釋肉的嫩度與α-肌動(dòng)蛋白(α-actin)和肌球蛋白輕鏈-1(myosin light chain 1，MLC1)等部分結(jié)構(gòu)蛋白、熱休克蛋白27(heat shock protein，HSP27)等熱休克蛋白、脂質(zhì)抗氧化酶(peroxiredoxin-6，Prdx-6)等嫩度相關(guān)蛋白標(biāo)志物之間關(guān)聯(lián)的不可或缺的研究工具[34,35]。例如，Morzel等[36]通過(guò)對(duì)屠宰后的法國(guó)布朗德·安奎坦牛的新鮮胸最長(zhǎng)肌和老化14 d的胸最長(zhǎng)肌進(jìn)行2-DE分析，發(fā)現(xiàn)HSP27可能是與其嫩度相關(guān)的重要蛋白標(biāo)志物。同樣地，Carvalho等[37]利用2-DE結(jié)合生物質(zhì)譜檢測(cè)的方法對(duì)剪切力大小不同(即嫩度不同)的2組牛肉進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)2組牛肉之間的蛋白質(zhì)種類和豐度均存在明顯差異。質(zhì)譜鑒定結(jié)果發(fā)現(xiàn)2組不同嫩度的牛肉中的差異蛋白質(zhì)主要包括α-actin、MLC1、MLC3、MLC2F和原肌球蛋白等結(jié)構(gòu)蛋白，HSPB1和HSP70等與細(xì)胞組織相關(guān)的熱休克蛋白以及β-乳球蛋白(β-lactoglobulin，β-LG)、酰基輔酶A結(jié)合結(jié)構(gòu)域蛋白6(ACBD6)等與代謝過(guò)程相關(guān)的蛋白，這一結(jié)果證明不同嫩度的牛肉中結(jié)構(gòu)蛋白含量存在顯著性差異。此外，Jia等[38]利用2-DE結(jié)合質(zhì)譜鑒定的方法對(duì)不同嫩度的牛背長(zhǎng)肌肌肉進(jìn)行了蛋白質(zhì)組學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)過(guò)氧化物氧還酶6(peroxiredoxin 6，Prdx6)可能是影響其嫩度的潛在蛋白質(zhì)標(biāo)志物。而B(niǎo)jarnadóttir等[39]則通過(guò)iTRAQ同位素標(biāo)記定量蛋白質(zhì)組學(xué)方法對(duì)不同嫩度的牛肉進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)了3個(gè)均未被報(bào)道過(guò)的與嫩度差異相關(guān)的蛋白質(zhì)：三羧酸循環(huán)相關(guān)蛋白2(oxoglutarate dehydrogenase complex component E2)、細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白(galectin-1)以及控制細(xì)胞內(nèi)鈣離子釋放的蛋白(annexin A6)。另外，肉類的包裝方式和儲(chǔ)存時(shí)間也會(huì)影響其嫩度。Moczkowska等[40]研究發(fā)現(xiàn)，真空貼體包裝條件下的牛背最長(zhǎng)肌的剪切力在其儲(chǔ)存14 d和28 d后顯著低于氣調(diào)保鮮包裝儲(chǔ)存條件下的牛背最長(zhǎng)肌，同時(shí)嫩度也更佳，這是由于氣調(diào)保鮮包裝方式中氧氣的存在會(huì)促進(jìn)牛背最長(zhǎng)肌中肌球蛋白的聚合，從而使肌肉老化。盡管上述研究結(jié)果尚未完全闡明蛋白質(zhì)標(biāo)志物與肉的嫩度之間的潛在分子機(jī)制，但為肉產(chǎn)業(yè)中肉質(zhì)嫩度預(yù)測(cè)和動(dòng)物肉質(zhì)嫩度改良方法的研究提供了理論基礎(chǔ)。

2.4 肉色

從銷售的角度來(lái)講，肉色是影響消費(fèi)者購(gòu)買(mǎi)欲望的關(guān)鍵因素之一，消費(fèi)者通常認(rèn)為櫻桃紅色是新鮮、可靠的健康肉的標(biāo)志，而肉色的變化會(huì)直接影響其銷售情況和價(jià)格，因此，從蛋白質(zhì)水平上開(kāi)展對(duì)于不同品種或不同部位肌肉肉色差異的研究具有非常重要的意義。以往關(guān)于肉色的研究多關(guān)注于肌紅蛋白與少數(shù)小分子之間的相互作用，認(rèn)為肉色變化與脂質(zhì)氧化引起的肌紅蛋白氧化密切相關(guān)。近年來(lái)，蛋白質(zhì)組學(xué)和質(zhì)譜技術(shù)開(kāi)始成為研究肉色差異的潛在生化機(jī)制的高通量分析工具。Li等[41,42]發(fā)現(xiàn)綿羊肉中肌漿蛋白質(zhì)的磷酸化水平可能與其顏色的形成密切相關(guān)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，綿羊肉顏色的穩(wěn)定性與肌紅蛋白的磷酸化水平呈負(fù)相關(guān)，而蛋白質(zhì)的磷酸化水平則可能通過(guò)調(diào)節(jié)肌紅蛋白的糖基化和氧化還原穩(wěn)定性來(lái)實(shí)現(xiàn)，進(jìn)而影響其顏色的形成。Joseph等[43]利用無(wú)標(biāo)記定量蛋白質(zhì)組學(xué)的方法對(duì)具有不同肌肉顏色穩(wěn)定性的牛背長(zhǎng)肌肌肉(顏色穩(wěn)定)和腰大肌肌肉(顏色易變)的肌漿蛋白質(zhì)組分別進(jìn)行了分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與肌肉紅色及顏色穩(wěn)定性正相關(guān)的抗氧化蛋白、分子伴侶等蛋白質(zhì)均在背長(zhǎng)肌肌肉中過(guò)表達(dá)，而在腰大肌肌肉中過(guò)表達(dá)的蛋白質(zhì)均與肌肉紅色呈負(fù)相關(guān)，這一結(jié)果也證實(shí)了要針對(duì)不同組織部位開(kāi)發(fā)不同的牛肉處理方法以改善牛肉顏色的必要性。Yu等[44]利用無(wú)標(biāo)記定量蛋白質(zhì)組學(xué)的方法闡明了荷斯坦牛肉在宰后4℃儲(chǔ)存過(guò)程中腰最長(zhǎng)肌和腰大肌的顏色穩(wěn)定性。結(jié)果表明在儲(chǔ)存4 d和9 d后，腰最長(zhǎng)肌比腰大肌表現(xiàn)出更好的紅色，而腰大肌中高鐵肌紅蛋白的增加比例要明顯高于腰最長(zhǎng)肌。另外，腰最長(zhǎng)肌和腰大肌的比較蛋白質(zhì)組學(xué)研究結(jié)果表明，大量具有抗氧化、保護(hù)和修復(fù)作用的有益于顏色穩(wěn)定的蛋白質(zhì)在腰最長(zhǎng)肌中過(guò)表達(dá)；而大量主要參與氧化還原過(guò)程、三羧酸循環(huán)和線粒體電子傳遞過(guò)程的蛋白質(zhì)則在腰大肌中過(guò)表達(dá)，從而導(dǎo)致其具有較差的顏色穩(wěn)定性。這一研究從蛋白質(zhì)組學(xué)的角度闡明了牛肉組織呈現(xiàn)顏色特異性的分子機(jī)制。

綜上所述，目前鑒定到的與肉色穩(wěn)定性相關(guān)的蛋白質(zhì)標(biāo)志物主要與動(dòng)物宰后肉的氧化代謝過(guò)程相關(guān)，其存在能夠延遲肉類pH的下降并且減緩蛋白質(zhì)的變性，因此，上述研究為開(kāi)發(fā)保持肉色的方法(抗氧化方法或包裝方式等)提供了新思路。

2.5 持水性

持水性是肉質(zhì)的一個(gè)重要特性，通常用滴水損失來(lái)評(píng)價(jià)，與動(dòng)物宰后的新陳代謝變化有著密切聯(lián)系。Lawson等[45]研究表明宰后肉中整合素(integrin)蛋白的降解會(huì)導(dǎo)致其滴水通道的形成，即integrin降解越少，滴水損失率越小，肌肉持水力越強(qiáng)，因此，肉中蛋白質(zhì)的組成與變化對(duì)于肉的持水性具有重要影響。而利用差異蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)研究不同持水能力的肉中蛋白質(zhì)的組成與變化對(duì)于揭示與肉持水性相關(guān)的分子機(jī)制是十分必要的。研究發(fā)現(xiàn)，不同肉類的持水能力與其表達(dá)的多種代謝酶和熱休克蛋白等的含量密切相關(guān)。例如，Phongpa-Ngan等[46]對(duì)具有不同持水能力的雞肉進(jìn)行了差異蛋白質(zhì)組學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)高持水能力的雞肉與低持水能力的雞肉相比，含有5個(gè)高表達(dá)、4個(gè)低表達(dá)的蛋白點(diǎn)，經(jīng)基質(zhì)輔助激光解吸/電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)鑒定后發(fā)現(xiàn)，這些差異蛋白質(zhì)主要包括丙酮酸激酶、磷酸丙糖異構(gòu)酶等代謝酶及熱休克蛋白等。同樣地，Di等[47]通過(guò)對(duì)不同持水能力的豬肉離心滴出液進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)分析，質(zhì)譜鑒定結(jié)果表明，44個(gè)蛋白質(zhì)的豐度會(huì)隨著豬肉宰后時(shí)間的增加而發(fā)生變化，但這些蛋白質(zhì)中只有HSP70的豐度在低滴水損失樣品的滴出液中顯著高于其他樣品，由此推斷，在不同滴水損失的樣品中，細(xì)胞內(nèi)HSP70的含量存在明顯差異，即HSP70可能作為豬肉樣品中持水性預(yù)測(cè)的潛在標(biāo)志物。Zuo等[48]通過(guò)利用2D SDS-PAGE結(jié)合基質(zhì)輔助激光解吸離子飛行時(shí)間串聯(lián)(MALDI TOF/TOF)質(zhì)譜分析方法，分別對(duì)屠宰后0 d、1 d、7 d內(nèi)的不同持水性的牦牛背長(zhǎng)肌進(jìn)行了差異蛋白質(zhì)組學(xué)分析。結(jié)果表明，55個(gè)蛋白質(zhì)的豐度隨著宰后時(shí)間的增加發(fā)生了顯著變化，這些蛋白質(zhì)主要包括4類：代謝酶、細(xì)胞結(jié)構(gòu)蛋白、壓力相關(guān)蛋白和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，其中，肌球蛋白輕鏈、熱休克蛋白27和磷酸丙糖異構(gòu)酶3個(gè)蛋白質(zhì)在高、低滴水損失率樣品中表現(xiàn)出顯著性差異，可以作為肉持水能力預(yù)測(cè)的潛在標(biāo)志物。另外，生物信息學(xué)分析結(jié)果表明，這些鑒定到的蛋白質(zhì)主要參與了碳代謝、氨基酸的糖基化和生物合成等生物學(xué)過(guò)程，這一結(jié)果對(duì)于揭示與肉類持水性相關(guān)的分子機(jī)制具有重要意義。

2.6 宰后代謝機(jī)制

宰后新陳代謝一直被認(rèn)為是影響肉質(zhì)變化的重要因素。研究表明，宰后肉類會(huì)發(fā)生一系列的生化反應(yīng)(pH下降、滴水損失等)，這些生化反應(yīng)發(fā)生的過(guò)程可能會(huì)極大地影響肉類的品質(zhì)，然而，目前宰后代謝過(guò)程中肉質(zhì)變化的相關(guān)分子機(jī)制仍不清晰?，F(xiàn)階段，蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的應(yīng)用開(kāi)始從分子水平上揭示宰后蛋白質(zhì)磷酸化修飾水平的變化與肉質(zhì)變化之間存在著的密切聯(lián)系。例如，Huang等[49]通過(guò)利用SDS-PAGE結(jié)合MALDI-TOF質(zhì)譜檢測(cè)的方法，研究發(fā)現(xiàn)隨著屠宰后豬背長(zhǎng)肌放置時(shí)間的延長(zhǎng)，肌纖維蛋白的磷酸化水平發(fā)生了明顯變化，而肌纖維蛋白磷酸化水平的變化則可能是與屠宰后發(fā)生豬肉肌肉僵直和肉質(zhì)變化關(guān)聯(lián)的直接原因。近期，Huang等[50]又利用高通量的二甲基標(biāo)記定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)對(duì)屠宰24 h內(nèi)的豬背長(zhǎng)肌肌肉的磷酸化蛋白質(zhì)組進(jìn)行了分析，定量結(jié)果發(fā)現(xiàn)93個(gè)磷酸化蛋白質(zhì)的184個(gè)磷酸化位點(diǎn)發(fā)生了顯著變化，而這些發(fā)生變化的蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能主要是與葡萄糖的代謝以及肌肉的收縮過(guò)程相關(guān)。由此說(shuō)明，由宰后豬肉的新陳代謝引起的肉質(zhì)變化與蛋白質(zhì)的磷酸化水平具有緊密的關(guān)聯(lián)。因此，蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的應(yīng)用對(duì)于動(dòng)物宰后新陳代謝分子機(jī)制的研究及其與宰后肉質(zhì)變化之間的關(guān)聯(lián)性研究具有重要價(jià)值。

2.7 肉質(zhì)的營(yíng)養(yǎng)調(diào)控

一般來(lái)說(shuō)，肉類的品質(zhì)受到遺傳、飼養(yǎng)條件(包括營(yíng)養(yǎng)條件和飼養(yǎng)方式等)、屠宰和儲(chǔ)存條件等多種因素的影響。在動(dòng)物的飼養(yǎng)過(guò)程中，可通過(guò)吸收飼料中的可消化營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)來(lái)改變機(jī)體的能量和蛋白質(zhì)的代謝水平，并最終影響動(dòng)物的肉質(zhì)，因此，可以通過(guò)調(diào)整動(dòng)物飼料中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的組成(如增加脂肪、氨基酸、維生素、礦物質(zhì)的含量等)和供給水平(短期禁飼等)來(lái)達(dá)到改善肉質(zhì)的目的[51～55]。目前，蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)已逐漸應(yīng)用于闡述膳食營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的添加對(duì)于肉質(zhì)調(diào)控的研究中。例如，Ma等[54]研究發(fā)現(xiàn)在豬飼料中添加1%L-精氨酸，能夠在不影響其生長(zhǎng)速度的前提下，使豬肉的肌內(nèi)脂肪含量增加約32%，同時(shí)降低其宰后48 h的滴水損失。這是由于向豬飼料中添加1%L-精氨酸會(huì)顯著影響豬肉中與能量代謝、肌纖維類型和結(jié)構(gòu)形成等相關(guān)的蛋白質(zhì)的豐度，從而使豬肉的肌內(nèi)脂肪含量增加，并達(dá)到改善肉質(zhì)的目的。另外，della Malva等[55]通過(guò)分析添加了亞麻籽和藜麥的飼料喂養(yǎng)的意大利美利奴羊的差異蛋白質(zhì)組信息，評(píng)價(jià)了飼料中亞麻籽和藜麥的添加對(duì)于羊肉嫩度的影響，研究結(jié)果顯示，添加了亞麻籽的飼料喂養(yǎng)的羊肉與普通無(wú)脂肪添加的飼料喂養(yǎng)的羊肉相比，其肌間線蛋白和肌鈣蛋白復(fù)合物等發(fā)生了顯著降解，即羊肉嫩度增加，這一結(jié)果與不同喂養(yǎng)方式下羊肉剪切力的測(cè)定結(jié)果一致(添加了亞麻籽的飼料喂養(yǎng)的羊肉剪切力最小)；而喂養(yǎng)添加了藜麥的飼料對(duì)于羊肉的嫩度的改善作用略低于添加了亞麻籽的飼料的喂養(yǎng)結(jié)果。因此，蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的應(yīng)用從分子水平上闡明了動(dòng)物飼料中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的添加對(duì)于肉質(zhì)改善的作用機(jī)理。

3 展望

目前，基于2-DE和生物質(zhì)譜的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)已經(jīng)成為肉類鑒別和肉質(zhì)分析中高通量、結(jié)果可靠的強(qiáng)有力的分析工具。蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的發(fā)展與應(yīng)用使肉的新鮮度鑒別及深加工肉制品中肉的種類鑒定成為了可能，同時(shí)在揭示肉質(zhì)特性形成的潛在分子機(jī)制方面已經(jīng)取得了一系列的進(jìn)展，在一定程度上，從分子水平上闡明了蛋白質(zhì)及生物分子之間的相互作用是影響肉質(zhì)相關(guān)生化、物理化學(xué)特性的根本原因。然而，由于生物體是其基因、蛋白質(zhì)等相互作用的有機(jī)體，蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)并不能完全解釋各種生物學(xué)系統(tǒng)的現(xiàn)象，因此，綜合利用系統(tǒng)生物學(xué)中多組學(xué)技術(shù)(蛋白質(zhì)組學(xué)、基因組學(xué)、翻譯后修飾組學(xué)、代謝組學(xué)等)將成為未來(lái)肉質(zhì)研究的重要方向。與此同時(shí)，基于SRM/MRM和PRM的靶向蛋白質(zhì)組學(xué)定量技術(shù)也將作為非靶向蛋白質(zhì)組學(xué)方法的補(bǔ)充，在肉質(zhì)分析相關(guān)的蛋白標(biāo)志物的高通量驗(yàn)證中發(fā)揮越來(lái)越重要的作用。

參 考 文 獻(xiàn)

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