宏基因組來(lái)源果膠酸裂解酶在畢赤酵母中的表達(dá)及應(yīng)用

董俊帥, 秦 星, 張志偉*, 張宇宏*, 張 偉

1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院, 山西 太谷 030801；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所, 北京100081

果膠(pectin)廣泛存在于植物細(xì)胞初生壁及中膠層，是一種復(fù)雜的高分子聚合物，其主鏈由α-1,4-糖苷鍵連接的聚半乳糖醛酸組成[1,2]。在多種農(nóng)產(chǎn)品加工過(guò)程中，果膠的存在會(huì)帶來(lái)一些不利影響。如在果汁加工中，果膠的存在導(dǎo)致果漿粘稠，果汁壓榨率低而且渾濁；在動(dòng)物的腸胃中，果膠的存在會(huì)增加食糜粘性，影響消化吸收。在苧麻紡織中，果膠將韌皮組織中的單纖維粘結(jié)成片狀，導(dǎo)致纖維粘結(jié)、不易染色、吸水性差。在傳統(tǒng)精煉脫膠工藝中，需要把麻纖維在強(qiáng)堿和高溫條件下煮煉數(shù)小時(shí)以脫除果膠，不僅使棉織物纖維機(jī)械強(qiáng)度降低，還存在高能耗、高污染的問(wèn)題。近年來(lái)，果膠酶尤其是果膠裂解酶在棉麻脫膠領(lǐng)域得到廣泛關(guān)注。在新型的酶法精煉工藝中，生產(chǎn)過(guò)程在較低溫度下進(jìn)行，降低了生產(chǎn)能耗，減少了污水排放，經(jīng)酶處理所得的紡織品吸水率高、易染色、手感更好。因而酶精煉工藝有望成為未來(lái)紡織工業(yè)生產(chǎn)技術(shù)的重要發(fā)展方向[3,4]。

果膠酶(pectinase)是一類(lèi)催化降解果膠分子的酶的總稱(chēng)，通常可分為聚半乳糖醛酸酶(PG，EC 3.2.1.15)、果膠酯酶(PE，EC 3.1.1.11)和果膠解聚酶[5]。果膠酸裂解酶(Pel, EC 4.2.2.2)是果膠解聚酶的一種。果膠酸裂解酶來(lái)源廣泛，如：來(lái)源于微生物(Pseudoalteromonassp.[6]、Bacillussp.[7～9]、Aspergillussp.[10,11])、植物[12]、動(dòng)物[13～15]等。除前述用于棉麻脫膠外，果膠酸裂解酶還可應(yīng)用于食品加工、造紙、環(huán)保、油料提取和茶葉發(fā)酵等領(lǐng)域[5]。但目前商品化的果膠酸裂解酶仍然不能滿(mǎn)足各種應(yīng)用環(huán)境對(duì)酶制劑的特殊性質(zhì)要求，例如在苧麻脫膠中，為了降低能耗和減少環(huán)境污染，需要酶在較低的催化溫度和偏堿pH環(huán)境下保持高催化效率，而且要求酶在最適操作條件下具有較好的穩(wěn)定性。然而目前大多數(shù)果膠酸裂解酶仍然難以完全滿(mǎn)足苧麻脫膠對(duì)酶性質(zhì)的要求。因此，有待于進(jìn)一步挖掘和開(kāi)發(fā)性質(zhì)優(yōu)良的新型果膠酸裂解酶。

宏基因組(metagenome)是指特定生態(tài)環(huán)境中可培養(yǎng)和不可培養(yǎng)的所有生物遺傳物質(zhì)的總和。據(jù)報(bào)道，99%的微生物應(yīng)用現(xiàn)有實(shí)驗(yàn)條件和技術(shù)還不能進(jìn)行培養(yǎng)，僅1%為可培養(yǎng)微生物。傳統(tǒng)分離純培養(yǎng)的方法極大的限制了人們對(duì)微生物資源的開(kāi)發(fā)和認(rèn)識(shí)，大量潛在的新的微生物和基因資源仍未被發(fā)現(xiàn)。從宏基因組中挖掘新基因成為研究熱點(diǎn)，傳統(tǒng)方法是構(gòu)建宏基因組文庫(kù)，基于序列驅(qū)動(dòng)篩選或者功能驅(qū)動(dòng)篩選策略從中發(fā)現(xiàn)新基因。但構(gòu)建文庫(kù)及篩選過(guò)程需要耗費(fèi)大量人工和時(shí)間。近年來(lái)，隨著高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，越來(lái)越多的宏基因組DNA信息被解析，使得不依賴(lài)于文庫(kù)構(gòu)建的新基因挖掘成為可能。

本研究從富含果膠的土壤中，基于高通量宏基因組測(cè)序技術(shù)挖掘到1個(gè)果膠酸裂解酶基因，并在畢赤酵母中成功實(shí)現(xiàn)了異源表達(dá)，并對(duì)其性質(zhì)進(jìn)行了研究,以期為微生物基因資源利用及苧麻脫膠相關(guān)研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1宏基因組的制備及測(cè)序 取果園土壤，加入大量果膠并自然發(fā)酵兩個(gè)月，取土壤樣品委托百邁克生物科技有限公司進(jìn)行宏基因組測(cè)序。

1.1.2菌株、酶和試劑 Trans1-T1大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞和FastpfuDNA 聚合酶為北京全式金生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；表達(dá)載體pPIC9和酵母菌株P(guān)ichiapastorisGS115為Invitrogen公司產(chǎn)品；質(zhì)粒小提試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒為北京天根生化技術(shù)有限公司產(chǎn)品；限制性?xún)?nèi)切酶(EcoRⅠ、NotⅠ、BglⅡ)為T(mén)hermo公司產(chǎn)品；聚半乳糖醛酸(PGA)、酯化度約34%的果膠(DE34)、酯化度約70%的果膠(DE70)和酯化度約85%的果膠(DE85)為Sigma公司產(chǎn)品。酵母提取物(yeast extract)和蛋白胨(tryptone)為Oxford公司產(chǎn)品；氨芐青霉素和牛血清白蛋白(BSA)標(biāo)準(zhǔn)品為經(jīng)科宏達(dá)產(chǎn)品；內(nèi)切β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(Endo-H)為New England Biolabs公司產(chǎn)品；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.3實(shí)驗(yàn)儀器 PCR儀(BioRad公司)；基因電擊導(dǎo)入儀(BioRad公司)；發(fā)酵罐(Bioengineering AG公司)；蛋白純化系統(tǒng)和鎳親和層析柱(GE Healthcare公司)；切向流超濾系統(tǒng)(Sartorius公司)；Stop-flow停留反應(yīng)分析儀(Applied Photophysics公司)。

1.1.4培養(yǎng)基配方 YPD培養(yǎng)基：20 g/L蛋白胨，10 g/L酵母提取物，20 g/L葡萄糖；MD 固體培養(yǎng)基：20 g/L葡萄糖，0.000 4 g/L生物素，13.4 g/L 酵母氨基氮源(YNB)，20 g/L瓊脂糖；BMGY培養(yǎng)基：20 g/L蛋白胨，10 g/L酵母提取物，11.8 g/L KH2PO4，3 g/L K2HPO4·3H2O，13.4 g/L YNB，0.000 4 g/L生物素，20 g/L甘油；BMMY培養(yǎng)基：20 g/L蛋白胨，10 g/L酵母提取物，11.8 g/L KH2PO4，3 g/LK2HPO4·3H2O，13.4 g/L YNB，0.000 4 g/L生物素，1%(V/V)甲醇；LB培養(yǎng)基：10 g/L蛋白胨，5 g/L酵母提取物，10 g/L NaCl。固體培養(yǎng)基含 20 g/L瓊脂。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1果膠酸裂解酶基因序列分析 從宏基因組測(cè)序數(shù)據(jù)中，將注釋為果膠酸裂解酶基因的序列提取出來(lái)，使用在線(xiàn)比對(duì)工具Nucleotide Blast(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)進(jìn)行序列比對(duì)。收集文獻(xiàn)報(bào)道已經(jīng)驗(yàn)證功能的果膠酸裂解酶、GenBank中登錄的果膠酸裂解酶以及本研究從宏基因組中搜索得到的果膠酸裂解酶氨基酸序列，用MEGA 5軟件Neighbor-Joining方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)。使用Vector NTI 10.3軟件預(yù)測(cè)蛋白理論分子量和等電點(diǎn)。使用在線(xiàn)工具SignalP 4.1 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)預(yù)測(cè)蛋白信號(hào)肽；用NetNGlyc 1.0 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/)和NetOGlyc 4.0 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetOGlyc/)分別預(yù)測(cè)蛋白潛在的N-糖基化位點(diǎn)和O-糖基化位點(diǎn)。

1.2.2果膠酸裂解酶基因擴(kuò)增引物設(shè)計(jì) 根據(jù)果膠酸裂解酶pela基因測(cè)序序列，設(shè)計(jì)不含信號(hào)肽的擴(kuò)增引物P1(5′-CCGGAATTCAATACAAATACTGACAATTCGTACAAAGAGAATGCTA-CTCCCGACCGTTC-3′，下劃線(xiàn)為EcoRⅠ位點(diǎn))和P2(5′-ATAAGAATGCGGCCGCTTAGTGGTGGTGG-TGGTGGTGTTTTTTAGAATCCGCAGGATAC-3′，下劃線(xiàn)為NotⅠ位點(diǎn)，斜體為His-tag序列)。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.2.3果膠酸裂解酶基因的擴(kuò)增及pPIC9-pela構(gòu)建 參考Sean[16]報(bào)道的土壤宏基因組提取方法，將提取的宏基因組經(jīng)DNA回收試劑盒回收大片段DNA。以回收的宏基因組DNA為模板，以P1和P2為引物，使用FastpfuDNA聚合酶擴(kuò)增果膠酸裂解酶基因。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)EcoRⅠ和NotⅠ酶切，連接表達(dá)載體pPIC9，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化Trans1-T1大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含有氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基平板上，37℃過(guò)夜培養(yǎng)，挑取單菌落進(jìn)行PCR驗(yàn)證。驗(yàn)證正確的菌落經(jīng)擴(kuò)大培養(yǎng)后抽提得到pPIC9-pela重組質(zhì)粒。

1.2.4重組質(zhì)粒pPIC9-pela轉(zhuǎn)化及誘導(dǎo)表達(dá) 重組質(zhì)粒pPIC9-pela經(jīng)BglⅡ線(xiàn)性化后電擊轉(zhuǎn)化P.pastorisGS115感受態(tài)細(xì)胞并涂布于MD培養(yǎng)基平板，28℃培養(yǎng)48～72 h至轉(zhuǎn)化子長(zhǎng)出。挑取MD平板上陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子于含有500 μL BMGY培養(yǎng)基的48孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，28℃振蕩培養(yǎng)48 h，4 000 g離心10 min棄去上清，然后加入500 μL BMMY誘導(dǎo)培養(yǎng)基重懸菌體，28℃振蕩培養(yǎng)48 h。每隔24 h補(bǔ)加一次甲醇，補(bǔ)加量為體系終濃度的1%。培養(yǎng)結(jié)束后，4 000 g離心10 min分離菌體，測(cè)定培養(yǎng)液上清中的果膠酸裂解酶活力。

1.2.5高活力轉(zhuǎn)化子復(fù)篩及高細(xì)胞密度發(fā)酵

挑取酶活力較高的轉(zhuǎn)化子接種于10 mL BMGY培養(yǎng)基中，28℃ 200 r/min培養(yǎng)48 h，4 000 g離心10 min，棄去上清后加入5 mL BMMY誘導(dǎo)培養(yǎng)基，28℃ 200 r/min繼續(xù)培養(yǎng)48 h。每隔24 h補(bǔ)加1次甲醇，補(bǔ)加量為終濃度的1%。培養(yǎng)結(jié)束后，4 000 g離心10 min分離菌體，測(cè)定培養(yǎng)液上清中的果膠酸裂解酶活力。將篩選出的酶活力最高的轉(zhuǎn)化子在3 L發(fā)酵罐進(jìn)行高細(xì)胞密度發(fā)酵。發(fā)酵工藝參照Invitrogen畢赤酵母操作手冊(cè)。

1.2.6重組果膠酸裂解酶的純化 將所得發(fā)酵液在6 000 g，4℃離心10 min以除去細(xì)胞和其他不溶物。上清液用0.1 μm微濾膜去除殘留的菌體，濾液經(jīng)截留分子量為10 kDa的超濾膜進(jìn)行超濾濃縮，并去除色素和高濃度的鹽分。所得超濾濃縮液經(jīng)鎳離子親和層析柱進(jìn)行純化。純化的重組蛋白PELA經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)檢測(cè)純化結(jié)果。純化的重組蛋白經(jīng)內(nèi)切β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(Endo-H)處理去除糖基化。

1.2.7果膠酸裂解酶活力測(cè)定 果膠酸裂解酶活力測(cè)定方法參考Zhou等[17]的方法：380 μL的0.2%(w/V)聚半乳糖醛酸底物預(yù)熱2 min，加入20 μL酶液(適當(dāng)稀釋)，45℃反應(yīng)10 min后立即加入600 μL 0.03 mol/L的H3PO4終止反應(yīng)，于波長(zhǎng)235 nm處測(cè)定光吸收值?？瞻讓?duì)照380 μL的底物預(yù)熱2 min，先加入600 μL 0.03 mol/L的H3PO4反應(yīng)10 min后再加入20 μL酶液。酶活力(X)計(jì)算公式：

式中，5 500表示雙鍵在235 nm波長(zhǎng)處的消光系數(shù)為5 500/mol·cm[18,19]。

1個(gè)酶活力單位定義為在1 min內(nèi)生成1 μmol的雙鍵所需蛋白量。

1.2.8重組PELA酶學(xué)性質(zhì)測(cè)定 以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)品，根據(jù)Bradford方法測(cè)定純化重組PELA的蛋白濃度，并計(jì)算出酶的比活力。酶的比活力定義為每毫克蛋白所具有酶活力的單位數(shù)。

在40℃，不同pH(4.0～11.0)條件下測(cè)定重組酶最適pH。測(cè)定所用的緩沖液為：HAc-NaAc緩沖液pH 4.0～6.0；Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液pH 6.0～8.0；Tris-HCl緩沖液pH 8.0～9.0；Gly-NaOH緩沖液pH 9.0～12.0。在最適pH條件下，測(cè)定不同溫度(20～70℃)下的重組酶活力以確定重組酶蛋白的最適溫度。

將純化的酶蛋白置于不同pH(4.0～12.0)的緩沖液中，室溫處理1 h后，測(cè)定重組酶的剩余活力。在最適pH下，將重組酶在不同的溫度(20～65℃)下保溫1 h，取出立即置于冰上，測(cè)定重組酶的剩余活力。

以較低濃度(0.25 mg/mL)聚半乳糖醛酸為底物，使用Stop-flow停留反應(yīng)分析儀測(cè)定重組酶的一級(jí)反應(yīng)時(shí)間。在一級(jí)反應(yīng)時(shí)間內(nèi)測(cè)定不同底物濃度下(0.25～2.5 mg/mL)重組酶的反應(yīng)速率。用GraphPad Prism 5軟件非線(xiàn)性擬合工具計(jì)算重組酶的Km和Vmax。

在最適溫度和最適pH下，酶活力測(cè)定體系中分別加入不同的金屬離子(Ni2+，Co2+，Cd2+，Mg2+，Zn2+，Mn2+，Ca2+，F(xiàn)e3+，Cu2+，Li+，K+)或化學(xué)試劑(EDTA，SDS，CTAB)，使其終濃度分別為1 mmol/L和2 mmol/L，以研究其對(duì)重組酶活性的影響。以未加上述金屬離子和化學(xué)試劑的樣品測(cè)得的酶活力記為100%，計(jì)算不同的金屬離子或化學(xué)試劑對(duì)酶活性的影響程度。

1.2.9重組果膠酸裂解酶在苧麻脫膠中的應(yīng)用 用不同的處理方法處理苧麻纖維并計(jì)算質(zhì)量損失率。①化學(xué)法：準(zhǔn)確稱(chēng)取苧麻1 g，在20 mL 0.5% NaOH中，100℃處理1 h。處理結(jié)束后，用去離子水沖洗干凈，100℃烘干至恒重(w)。②酶處理法：準(zhǔn)確稱(chēng)取苧麻1 g，在20 mL含有30 U/mL重組酶PELA的Gly-NaOH的緩沖液(pH 9.0)中，40℃處理4 h，每間隔20 min震蕩1次。處理結(jié)束后，用去離子水沖洗干凈后，100℃烘干至恒重(w)。以不含重組PELA的Gly-NaOH緩沖液pH 9.0作為對(duì)照。③酶-化學(xué)聯(lián)合法：將經(jīng)過(guò)酶處理的苧麻浸入20 mL 0.5% NaOH，100℃處理1 h，100℃烘干至恒重(w)。

質(zhì)量損失率(%)=(1-w)/1×100%

2 結(jié)果與分析

2.1 果膠酸裂解酶pela基因序列分析

從宏基因組測(cè)序數(shù)據(jù)中，挖掘得到1個(gè)果膠酸裂解酶基因pela。該基因全長(zhǎng)1 494 bp，編碼497個(gè)氨基酸和1個(gè)終止密碼子，預(yù)測(cè)前20個(gè)氨基酸為信號(hào)肽序列。Blast比對(duì)結(jié)果顯示該酶DNA序列與Bacteroidesthetaiotaomicron來(lái)源果膠酸裂解酶基因(WP_011109109.1)的相似性達(dá)到99%，但該基因仍未進(jìn)行功能鑒定。使用已知的果膠酸裂解酶氨基酸序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)(圖1)，發(fā)現(xiàn)這些基因可以分為3個(gè)簇(Cluster)。大部分已經(jīng)驗(yàn)證功能的果膠酸裂解酶屬于Cluster Ⅱ和Cluster Ⅲ，而PELA所屬的Cluster Ⅰ中，僅有來(lái)源于Pseudoalteromonashaloplanktisstrain ANT/505的果膠酸裂解酶被克隆并進(jìn)行了性質(zhì)研究[6]，其余絕大部分僅報(bào)道了基因序列，而未進(jìn)行功能驗(yàn)證，說(shuō)明Cluster Ⅰ中蛋白可能是一類(lèi)新的未被開(kāi)發(fā)利用的果膠酸裂解酶。

PELA蛋白的理論分子量為53.3 kDa，等電點(diǎn)(pI)為6.19，預(yù)測(cè)存在2個(gè)N-糖基化位點(diǎn)(124 NYTF，409 NYTY)和8個(gè)O-糖基化位點(diǎn)(33 T，37 S，52 T，53 T，405 T，437 S，440 T和442 T)(圖2)。

2.2 重組果膠酸裂解酶PELA的表達(dá)和純化

從100個(gè)陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子中，篩選到1個(gè)高活力轉(zhuǎn)化子。該重組菌株在3 L發(fā)酵罐水平表達(dá)果膠酸裂解酶PELA，甲醇誘導(dǎo)10 h后酶活力達(dá)到最高為10.8 U/mL，粗酶液經(jīng)微濾和超濾濃縮后，經(jīng)鎳離子親和層析純化得到電泳純蛋白，SDS-PAGE結(jié)果顯示單一條帶，其分子量大小約為60.0 kDa(圖3泳道2，箭頭所示)，大于預(yù)測(cè)理論分子量53.3 kDa。經(jīng)糖基化酶(Endo-H)處理后，可見(jiàn)其分子量?jī)H略微變小(圖3泳道3，箭頭所示)，可能原因是蛋白表達(dá)過(guò)程中PELA還經(jīng)過(guò)了O-糖基化、脂?；蛘吡姿峄绕渌g后修飾。

圖1 果膠酸裂解酶進(jìn)化樹(shù)Fig.1 Phylogenetic trees of the pectate lyases.注：圖中進(jìn)化樹(shù)分支所示數(shù)字為自舉檢驗(yàn)置信值(1 000個(gè)復(fù)制序列)?！癖硎疽堰M(jìn)行功能驗(yàn)證的果膠酸裂解酶。

圖2 pela的DNA序列和推導(dǎo)的氨基酸序列Fig.2 The DNA sequence and deduced amino acid sequence of the pela.注：加下劃線(xiàn)處為信號(hào)肽序列；星號(hào)為終止密碼子；預(yù)測(cè)N-糖基化位點(diǎn)以方框突出顯示；預(yù)測(cè)O-糖基化位點(diǎn)以灰色底紋突出顯示。

2.3 重組果膠酸裂解酶PELA酶學(xué)性質(zhì)測(cè)定

重組PELA的最適溫度為45℃，高于50℃時(shí)酶活力急劇下降(圖4A)。重組PELA在40℃時(shí)表現(xiàn)出良好的穩(wěn)定性，在低于40℃條件下處理1 h，酶活力不變(圖4C)。重組PELA的最適pH為9.0(圖4B)。在pH 9.0～9.5范圍內(nèi)表現(xiàn)出較高活性，在低于pH 8.5或高于pH 9.5時(shí)酶活力急劇下降，在pH 8.5和pH 10.0時(shí)僅表現(xiàn)出40%的相對(duì)活力(圖4B)。重組酶在堿性范圍內(nèi)穩(wěn)定性較好，在pH 7.5～11.0條件下處理1 h，剩余酶活力在60%以上，當(dāng)pH高于11.0時(shí)，酶變得極不穩(wěn)定，在pH 12.0時(shí)，酶活力完全喪失(圖4D)。

圖3 重組果膠酸裂解酶PELA的SDS-PAGE分析Fig.3 SDS-PAGE analysis of the recombinant pectate lyase PELA.M：蛋白分子量Marker； 1：發(fā)酵粗酶液； 2：純化重組果膠酸裂解酶PELA； 3：Endo-H處理的重組果膠酸裂解酶PELA； 4：Endo-H。

在最適條件下測(cè)得重組果膠酸裂解酶PELA的比活力為244.12 U/mg。在設(shè)定條件下，Stop-flow分析PELA酶催化一級(jí)反應(yīng)時(shí)間為20 s，在一級(jí)反應(yīng)時(shí)間內(nèi)反應(yīng)速率維持在1.96 μmol/s·mg左右(圖5A)。在一級(jí)反應(yīng)時(shí)間內(nèi)，不同底物濃度下，PELA的Km值是0.26 mg/mL，最大反應(yīng)速度Vmax值為488.40 μmol/min·mg(圖5B)。

圖4 溫度和pH對(duì)重組PELA活力的影響Fig.4 Effect of temperature and pH on the recombinant PELA.A：溫度對(duì)果膠酸裂解酶活力的影響；B：pH對(duì)果膠酸裂解酶活力的影響；C：果膠酸裂解酶溫度穩(wěn)定性；D：果膠酸裂解酶pH穩(wěn)定性。

化學(xué)試劑EDTA及金屬離子Ni2+、Co2+、Cu2+、Cd2+、Zn2+、Mn2+和Cu2+對(duì)PELA酶活力具有不同程度的抑制作用。其中Cd2+、Zn2+、Mn2+和Cu2+表現(xiàn)為對(duì)酶活性的強(qiáng)烈抑制(表1)。1 mmol/L SDS對(duì)酶活性沒(méi)有明顯的影響，當(dāng)濃度達(dá)到2 mmol/L時(shí)，表現(xiàn)出明顯的抑制作用，但是仍有70%以上活力。Mg2+、Li+、K+和Ca2+均能促進(jìn)酶的活力。2 mmol/L的K+或1 mmol/L的Ca2+對(duì)酶活力具有明顯的促進(jìn)作用(表1)，但2 mmol/L的Ca2+卻表現(xiàn)出對(duì)酶活性的抑制。

2.4 重組果膠酸裂解酶PELA在苧麻脫膠中的應(yīng)用

用PELA在40℃作用于苧麻4 h，苧麻纖維質(zhì)量損失率達(dá)到9.2%，與單獨(dú)使用0.5% NaOH效果相當(dāng)，而對(duì)照質(zhì)量損失率僅1.3%；當(dāng)PELA和0.5% NaOH共同作用時(shí)，質(zhì)量損失率達(dá)到了16.6%(圖6A，彩圖見(jiàn)圖版一)。在苧麻形態(tài)變化上，用PELA處理苧麻4 h后，與對(duì)照相比，苧麻纖維分散度和白度得到明顯地提高；當(dāng)PELA和0.5% NaOH共同作用時(shí)，苧麻纖維的分散度和白度均優(yōu)于單獨(dú)使用PELA或者0.5% NaOH(圖6B)。

圖5 PELA酶動(dòng)力學(xué)測(cè)定Fig.5 Kinetic parameters of the recombinant PELA.A：PELA一級(jí)反應(yīng)時(shí)間測(cè)定；B：PELA催化動(dòng)力學(xué)參數(shù)測(cè)定。

表1 不同化學(xué)試劑和金屬離子對(duì)重組酶活性的影響Table 1 The effects of various chemical reagents and metal ions on the recombinant PELA activity.

注：a所得的值為3次所測(cè)酶活力的平均值。ND:無(wú)數(shù)據(jù)。當(dāng)部分離子或化合物濃度為2 mmol/L時(shí)，在波長(zhǎng)235 nm處不能測(cè)出其相應(yīng)吸光值。

3 討論

高通量宏基因組測(cè)序技術(shù)一次可以對(duì)上百萬(wàn)條DNA分子序列進(jìn)行測(cè)定，具有成本低、數(shù)據(jù)量大的特點(diǎn)。海量的新基因從宏基因組測(cè)序數(shù)據(jù)庫(kù)得到挖掘，如Roehe等[20]的研究中通過(guò)宏基因組測(cè)序揭示的與甲烷排放相關(guān)的2 700多個(gè)基因中，只有0.6%在NCBI的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)中能夠匹配。Venter等[21]對(duì)馬尾海藻的宏基因組測(cè)序發(fā)現(xiàn)了超過(guò)120萬(wàn)個(gè)未知新基因。本研究獲得的pela基因經(jīng)進(jìn)化樹(shù)分析，其與已經(jīng)驗(yàn)證功能的果膠酸裂解酶屬于不同的Cluster，可能是一類(lèi)新的未被開(kāi)發(fā)利用的果膠酸裂解酶，同時(shí)也說(shuō)明宏基因組測(cè)序能夠高效挖掘到新基因。另外，本研究通過(guò)宏基因組測(cè)序挖掘到多個(gè)果膠酸裂解酶基因并在P.pastoris中進(jìn)行了異源表達(dá)，但僅有pela異源表達(dá)產(chǎn)物顯示出了果膠酸裂解酶活性。P.pastoris并不是所有蛋白的最佳表達(dá)宿主，對(duì)于挖掘到的大量的果膠酸裂解酶基因，后期將嘗試在不同的宿主中進(jìn)行異源表達(dá)。

pela在P.pastoris中的表達(dá)量為10.8 U/mL，低于大多數(shù)已報(bào)道的果膠酸裂解酶，如Aspergillusnidulans和Paenibacillussp. 0602來(lái)源的果膠酸裂解酶基因在E.coli中的表達(dá)量分別為360.0 U/mL[10]和2 467.4 U/mL[22]。為了降低酶制劑的生產(chǎn)成本，提高PELA的表達(dá)量，我們將進(jìn)一步在表達(dá)系統(tǒng)選擇、發(fā)酵條件優(yōu)化以及基因序列的優(yōu)化上開(kāi)展后續(xù)研究。但值得指出的是，PELA的Vmax為488.40 μmol/min·mg，Km為0.26 mg/mL，幾乎低于所有已報(bào)道的果膠酸裂解酶的Km值，如來(lái)源于Bacilluslicheniformis、Aspergillusniger和Streptomycessp. S27的Km分別為0.38 mg/mL[17]、1.16 mg/mL[11]和7.90 mg/mL[23]。PELA的最大反應(yīng)速度Vmax也高于大多數(shù)果膠酸裂解酶的數(shù)值[11,22,24,25]，說(shuō)明PELA具有很高的催化效率。另外，本研究中的PELA具有較高比活力(244.12 U/mg)，高于大多數(shù)已報(bào)道果膠酸裂解酶，如來(lái)源于Streptomycessp. S27(23.00 U/mg[23])和Bacilluslicheniformis14A(45.40 U/mg[26])的果膠酸裂解酶。

圖6 不同處理后苧麻纖維質(zhì)量損失率(A)及形態(tài)變化(B)Fig.6 Percentage of ramie fiber weight loss (A) and morphological change (B) after different treatments.(彩圖見(jiàn)圖版一)

在紡織工業(yè)中應(yīng)用果膠酶往往要兼顧催化效率和穩(wěn)定性。通過(guò)對(duì)純化的PELA進(jìn)行酶學(xué)性質(zhì)研究，結(jié)果表明PELA在最適反應(yīng)條件下的穩(wěn)定性很好，能夠兼顧催化效率與穩(wěn)定性。PELA最適溫度為45℃，在40℃具有良好的穩(wěn)定性，處理1 h酶活力仍有100%的活性，優(yōu)于已報(bào)道的來(lái)源于Paenibacillussp.的PelN，PelN在最適溫度下處理1 h，剩余酶活力不足25%[22]。來(lái)源于Bacillussubtilis的PL，其在最適溫度下處理20 min，剩余酶活力不足40%[27]。PELA的最適pH為9.0，在最適pH條件下處理1 h，剩余90%以上的酶活力。

目前報(bào)道的大多數(shù)適用于紡織行業(yè)的果膠酸裂解酶多為高溫酶，酶的最適溫度在50～70℃范圍內(nèi)的較多，如BacillustequilensisSV11來(lái)源的果膠酸裂解酶的最適溫度為60℃[28]，BacilluspumilusBK2來(lái)源的PL在70℃具有最高酶活性[29]。這些酶在實(shí)際工業(yè)應(yīng)用中可能仍然存在高耗能的問(wèn)題，更重要的是對(duì)纖維質(zhì)量造成影響。PELA的最適溫度為45℃，并且PELA對(duì)纖維素沒(méi)有催化活性，不會(huì)降低纖維質(zhì)量。因此PELA更適合應(yīng)用于紡織脫膠過(guò)程中。這些結(jié)果表明PELA在苧麻脫膠中具有良好的應(yīng)用潛力。

參 考 文 獻(xiàn)

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