單增李斯特菌prsA1基因的截短表達(dá)、純化及多克隆抗體的制備

孫靜娟, 邱景璇, 曾海娟, 丁承超, 王廣彬, 李 杰, 王淑娟, 劉 箐*

1.上海理工大學(xué)醫(yī)療器械與食品學(xué)院, 上海 200093;2.徐州綠健乳品飲料有限公司, 江蘇 徐州 221006

單增李斯特菌能在生物體內(nèi)轉(zhuǎn)變成細(xì)胞內(nèi)的病原體，是常見的四大食源性致病菌之一，一般在健康個體中引起輕度疾病，但是在免疫功能低下者體內(nèi)，該菌感染易患敗血癥、腦膜炎、腦膿腫等，甚至可通過孕婦胎盤感染發(fā)育中的胎兒，導(dǎo)致死產(chǎn)和流產(chǎn)[1,2]。單增李斯特菌能夠粘附在食品加工器械上形成菌膜，進(jìn)而增加食品污染的可能性[3,4]。同時伴隨著抗生素的濫用，單增李斯特菌對抗生素的耐藥性增加[5,6]，對食品安全構(gòu)成嚴(yán)重威脅。單增李斯特菌能夠在廣泛的環(huán)境條件下生存，使得其在食品加工企業(yè)難以得到控制[7]。但目前，對單增李斯特菌的檢測仍缺乏高效快速的檢測手段，因此，亟需開發(fā)一種快速高效的檢測方法。

單增李斯特菌從腐生菌到胞內(nèi)病原體的轉(zhuǎn)移依賴于分泌性致病因子介導(dǎo)細(xì)胞入侵及細(xì)胞內(nèi)增殖[8]。蛋白質(zhì)在細(xì)菌表面的轉(zhuǎn)運(yùn)是細(xì)菌正常生命活動的必需過程，如鞭毛等復(fù)雜結(jié)構(gòu)的組裝、營養(yǎng)物質(zhì)的獲取、細(xì)胞壁的合成與分裂、細(xì)菌粘附在環(huán)境表面等過程都離不開蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)[9]。對革蘭氏陽性菌而言，蛋白質(zhì)的分泌需跨越細(xì)胞膜，并在膜-細(xì)胞壁界面外部暴露的環(huán)境中完成蛋白質(zhì)折疊[10]。而PrsA作為一種細(xì)胞膜上的折疊酶，與多種生理表型有關(guān)，包括膜蛋白折疊、致病菌毒力、抗?jié)B透脅迫和極端pH、細(xì)胞壁完整性和細(xì)菌運(yùn)動性等[11]。單增李斯特菌有兩個已知的PrsA亞型，即PrsA1和PrsA2。PrsA2已被證實是單增李斯特菌維持運(yùn)動性、抗壓力、維持細(xì)胞壁完整性和毒力所必需的[12,13]。目前，PrsA1功能研究尚不明確。

利用生物信息學(xué)方法從數(shù)據(jù)庫中篩選得到單增李斯特菌prsA1基因具有種內(nèi)保守、種間特異的特點(diǎn)，另外PrsA1還具有良好的抗原表位，是預(yù)測的理想檢測靶標(biāo)。本實驗對prsA1進(jìn)行克隆和截短表達(dá)，并以重組蛋白Δ28PrsA1為免疫原制備多克隆抗體，對預(yù)測結(jié)果進(jìn)行免疫學(xué)驗證，旨在為單增李斯特菌檢測靶標(biāo)的篩選和免疫學(xué)檢測提供實踐基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

單增李斯特菌株(EGD-e)、質(zhì)粒pET30a、大腸桿菌DH5α由上海理工大學(xué)系統(tǒng)生物醫(yī)學(xué)研究中心提供；大腸桿菌BL21(DE3)購自天根生化科技(北京)有限公司；限制性內(nèi)切酶購自大連寶生物工程有限公司；高保真酶試劑盒(Phanta? Max Super-Fidelity DNA Polymerase)、一步克隆試劑盒(One Step Cloning Kit)購自南京諾唯贊生物科技有限公司；一步法細(xì)菌活性蛋白提取試劑盒(One Step Bacterial Active Protein Extraction Kit)、His標(biāo)簽純化柱(Ni-IDA-Sefinose Column)購自生工生物工程(上海)股份有限公司；瓊脂糖割膠回收試劑盒(BioSpin Gel Extraction Kit)、質(zhì)粒抽提試劑盒(BioSpin Plasmid DNA Extraction Kit)購自杭州博日科技生物有限責(zé)任公司。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；測序由上海華大基因科技有限公司完成。

1.2 生物信息學(xué)預(yù)測

運(yùn)行綜合性數(shù)據(jù)庫NCBI上的ORFfinder(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)工具分析prsA1開放閱讀框。運(yùn)行SignalP4.1 Server程序(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)預(yù)測PrsA1是否含有信號肽及其剪切位點(diǎn)[14,15]。運(yùn)行TMHMM Server V.2.0程序(http://www.cbs.dtu.dk/services/ TMHMM-2.0/)預(yù)測PrsA1是否為跨膜蛋白及其跨膜區(qū)域[16]。運(yùn)行SEPPA2.0程序預(yù)測PrsA1的空間抗原表位[17,18]。

1.3 Δ84prsA1的擴(kuò)增與克隆

根據(jù)NCBI上公布的李斯特菌prsA1(Gene ID: 986457)基因序列(全長885 bp)，考慮到跨膜區(qū)會阻礙原核表達(dá)，根據(jù)跨膜區(qū)預(yù)測結(jié)果，運(yùn)用Primer 3.0設(shè)計1對特異性引物F1-R1用于擴(kuò)增prsA1非跨膜區(qū)基因片段，即缺少第1個至第84個核苷酸的基因片段，Δ84prsA1其編碼的蛋白為Δ28PrsA1。引物信息如下：F1：5′-ACATGGACAGCCCAGATCTGAAAACAGATGCAGGAAGTGT-3′；R1：5′-TGGTGGTGGTGGTGCTCGAGTTAGTTAGATGTAGTCGTTG-3′(劃線部分分別為BglⅡ和XhoⅠ酶切位點(diǎn))。PCR反應(yīng)程序為：95℃ 3 min；95℃ 15 s，56℃ 15 s，72℃ 45 s，35個循環(huán)；72℃ 5 min。割膠回收PCR產(chǎn)物后連接至pET30a載體上，把重組質(zhì)粒pET30a-Δ84prsA1導(dǎo)入大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中。提取質(zhì)粒送測序，將測序正確的質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，采用菌落PCR鑒定[19]。

1.4 Δ28PrsA1的原核表達(dá)與鑒定

將陽性克隆菌落過夜培養(yǎng)，次日，1∶100轉(zhuǎn)接至新培養(yǎng)基(卡那霉素終濃度25 μg/mL)中繼續(xù)培養(yǎng)至OD600為0.6時，加入IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，終濃度0.1 mmol/L，誘導(dǎo)表達(dá)6 h，然后采用一步法細(xì)菌活性蛋白提取試劑盒提取可溶性蛋白，用8 mol/L尿素變性包涵體，最后經(jīng)SDS-PAGE分析Δ28PrsA1表達(dá)情況及可溶性。將目的蛋白從膠上切下，送北京華大蛋白質(zhì)研發(fā)中心有限公司進(jìn)行質(zhì)譜鑒定[20]。

1.5 Δ28PrsA1的純化

誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)束后離心收集菌體，PBS重懸后使用超聲破碎儀破碎菌體，離心棄上清，6 mol/L鹽酸胍處理包涵體，參照Ni-IDA純化柱說明書純化重組蛋白Δ28PrsA1，SDS-PAGE電泳分析蛋白純化效果。

1.6 多克隆抗體的制備及純化

新西蘭大耳兔適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后進(jìn)行動物免疫[21]。首次免疫時弗氏完全佐劑與純化的Δ28PrsA1等體積混合，充分乳化后皮下多點(diǎn)免疫。加強(qiáng)免疫時弗氏不完全佐劑與純化的Δ28PrsA1等體積混合，充分乳化后免疫。每次免疫劑量為1 mg Δ28PrsA1，間隔2周，加強(qiáng)免疫3次。末次免疫一周后，心臟取血，分離血清，飽和硫酸銨沉淀法粗提多克隆抗體，然后利用Protein A親和層析柱純化多抗，-20℃冷凍保存。

1.7 多克隆抗體的效價測定

第3次免疫后一周耳邊緣取血，采用間接ELISA方法檢測兔血清中抗體水平[22]，具體操作：以純化的Δ28PrsA1(3 μg/孔)包被酶標(biāo)板，3%(m/V)脫脂奶粉封閉，以梯度稀釋的兔血清為一抗(1∶1 000～1∶128 000)，以HRP標(biāo)記的山羊抗兔抗體為二抗，TMB顯色后加終止液終止顯色反應(yīng)，測定OD450。

1.8 Western blotting法檢測單增李斯特菌

按溶菌酶-超聲破碎-TCA-丙酮沉淀法提取單增李斯特蛋白[23]，經(jīng)SDS-PAGE電泳并轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，以兔多抗為一抗，以熒光標(biāo)記的山羊抗兔抗體為二抗，使用雙色紅外熒光成像系統(tǒng)Odyssey掃描NC膜。Western blotting分析該多克隆抗體與單增李斯特菌提取PrsA1蛋白的結(jié)合能力。

2 結(jié)果與分析

2.1 PrsA1的信號肽預(yù)測

信號肽預(yù)測結(jié)果顯示信號肽分值S的平均值>0.5，表明PrsA1的N端存在信號肽，該信號肽負(fù)責(zé)將PrsA1靶向細(xì)菌表面，屬于分泌蛋白，剪切位點(diǎn)處于第26個氨基酸和第27個氨基酸間，如圖1(彩圖見圖版二)、表1所示。

圖1 PrsA1的信號肽預(yù)測Fig.1 Prediction of PrsA1 signal peptide.(彩圖見圖版二)

表1 PrsA1信號肽預(yù)測的數(shù)值信息Table 1 The numerical information of PrsA1 signal peptide prediction.

注：Name=Sequence, SP=“YES”，剪切位點(diǎn)介于pos.26 and 27, SSA-VI D=0.626, D-cutoff=0.450, Networks=SignalP-TM. C值：剪切位點(diǎn)分值；S值：信號肽分值；Y值：綜合剪切點(diǎn)分值；D值：辨別率分值。

2.2 PrsA1的跨膜區(qū)域預(yù)測

跨膜區(qū)域預(yù)測結(jié)果顯示PrsA1的N端第7個到第28個氨基酸形成一個跨膜區(qū)，如圖2(彩圖見圖版二)、表2所示?？缒^(qū)氨基酸殘基主要是疏水性的，并且α螺旋結(jié)構(gòu)規(guī)則且不易變形，阻礙蛋白的原核表達(dá)，所以設(shè)計一對特異性引物擴(kuò)增PrsA1的非跨膜區(qū)，并構(gòu)建重組質(zhì)粒用于原核表達(dá)。

圖2 PrsA1的跨膜區(qū)預(yù)測Fig.2 Prediction of PrsA1 transmembrane region.(彩圖見圖版二)

表2 PrsA1跨膜區(qū)域預(yù)測的數(shù)值信息Table 2 The numerical information of PrsA1 transmembrane region prediction.

注：WEBSEQUENCE Number of predicted TMHs: 1。

2.3 PrsA1的空間抗原表位預(yù)測

將PrsA1的空間結(jié)構(gòu)信息提交至SEPPA 2.0預(yù)測空間抗原表位，0～1表示氨基酸打分閾值，分值越高顏色越紅則表示該氨基酸形成抗原表位的可能性越大。如圖3(彩圖見圖版二)所示，紅色區(qū)域裸露在外側(cè)且分布相對集中，表明PrsA1上存在良好的空間抗原表位。

2.4 Δ84prsA1的擴(kuò)增與pET30a-Δ84prsA1的PCR鑒定

PCR反應(yīng)結(jié)束后經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測可見在801 bp左右出現(xiàn)亮白條帶，與預(yù)期片段大小一致，表明成功獲得Δ84prsA1片段，如圖4所示。 將測序正確的重組質(zhì)粒pET30a-Δ84prsA1導(dǎo)入大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，菌落PCR鑒定結(jié)果如圖5所示，在801 bp左右出現(xiàn)條帶，表明Δ84prsA1片段已連接至pET30a載體上并成功轉(zhuǎn)化至大腸桿菌中。測序結(jié)果與NCBI數(shù)據(jù)庫公布的prsA1序列比對，同源性達(dá)到100%。

圖3 PrsA1的空間抗原表位預(yù)測Fig.3 Prediction of PrsA1 spatial epitope.(彩圖見圖版二)

圖4 Δ84prsA1片段的擴(kuò)增Fig.4 Amplification of Δ84prsA1M：DL1000 DNA Marker; 1，2：Δ84PrsA1片段。

圖5 pET30a-Δ84prsA1的PCR鑒定Fig.5 Identification of pET30a-Δ84prsA1 by PCR.M. DL1000 DNA Marker; 1. 陰性對照; 2～10. 9個單菌落。

2.5 Δ28PrsA1的原核表達(dá)與鑒定

重組質(zhì)粒pET30a-Δ84prsA1經(jīng)IPTG誘導(dǎo)可表達(dá)出重組蛋白，在33 kDa處有明顯條帶(Δ28PrsA1的分子量大小為29 kDa。His標(biāo)簽的分子量大小為4 kDa)，與預(yù)期大小一致?？蛰d體不表達(dá)該蛋白，重組質(zhì)粒不經(jīng)IPTG誘導(dǎo)不表達(dá)該蛋白(泳道5、泳道7所示)，泳道6和泳道8分別為誘導(dǎo)表達(dá)上清、誘導(dǎo)表達(dá)包涵體，可見誘導(dǎo)表達(dá)的重組蛋白以包涵體的形式存在，如圖6A所示。重組蛋白條帶的質(zhì)譜鑒定結(jié)果如圖6B所示，數(shù)據(jù)經(jīng)Mascot檢索分析可知，蛋白匹配度為61%(下劃線表示質(zhì)譜結(jié)果能與NCBI中氨基酸序列匹配上的氨基酸)，確定其為Δ28PrsA1。

圖6 Δ28PrsA1的表達(dá)與鑒定Fig.6 Induced expression and identification of Δ28PrsA1.A. SDS-PAGE鑒定結(jié)果; M. 彩色預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)(10～180 kDa); 1. 空載體未誘導(dǎo)上清; 2. 空載體誘導(dǎo)上清; 3. 空載體未誘導(dǎo)包涵體; 4. 空載體誘導(dǎo)包涵體; 5. 重組質(zhì)粒未誘導(dǎo)上清; 6. 重組質(zhì)粒誘導(dǎo)上清; 7. 重組質(zhì)粒未誘導(dǎo)包涵體; 8. 重組質(zhì)粒誘導(dǎo)包涵體; B.重組蛋白的質(zhì)譜鑒定結(jié)果。

2.6 Δ28PrsA1的純化

利用重組蛋白的His標(biāo)簽采用Ni-IDA-Sefinose 純化柱對其進(jìn)行純化，SDS-PAGE結(jié)果如圖7所示，泳道2為純化后的Δ28PrsA1，在泳道2上33 kDa處有明顯的蛋白條帶，幾乎沒有雜蛋白條帶，表明該蛋白確實是原核表達(dá)的Δ28PrsA1蛋白，并且純化的蛋白具有較高的純度。

圖7 Δ28PrsA1的純化Fig.7 Purification of Δ28PrsA1.M.彩色預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)(10～180 kDa); 1.純化前的Δ28PrsA1; 2.純化后的Δ28PrsA1。

2.7 多克隆抗體的效價測定

間接ELISA法檢測兔血清中特異性抗體水平，OD450吸光值大于陰性血清的2.1倍即可確定為最終效價。由圖8可知，該蛋白能較好地引起兔子的免疫反應(yīng)，具有較好的免疫原性，該多抗效價高達(dá)1∶128 000。

圖8 多克隆抗體的效價測定Fig.8 Determination of the polyclonal antibody titer.

2.8 多克隆抗體的純化

由圖9所示，泳道1為飽和硫酸銨沉淀法粗提的抗體，泳道2為親和層析柱純化過程中的穿透液，在55 kDa左右沒有蛋白條帶，表明在純化過程中抗體沒有丟失，泳道3為洗脫的抗體，在55 kDa左右有一明顯條帶，為抗體的重鏈，在26 kDa左右有彌散條帶，為抗體輕鏈，除此之外沒有雜帶，表明純化后抗體純度較高。

圖9 多克隆抗體的純化Fig.9 Purification of the polyclonal antibody.M. 彩色預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)(10～180 kDa)；1.純化前的抗體；2. 穿透液；3.純化后的抗體.

2.9 Western blotting法檢測單增李斯特菌

在單增李斯特菌中，prsA1編碼的PrsA1的分子量大約為33 kDa。由圖10可知，在大約33 kDa處呈現(xiàn)出蛋白印跡，與預(yù)測大小相符，該多抗可與天然PrsA1特異性結(jié)合，表明已成功制備單增李斯特菌PrsA1多抗，抗體特異性較好，但與其他蛋白存在一定交叉性。

圖10 Western blotting法檢測單增李斯特菌Fig.10 Detection of Listeria monocytogenes by Western blotting.M: 彩色預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)(10～180 kDa); 1:單增李斯特菌提取蛋白。

3 討論

單增李斯特菌是一種常見的食源性致病菌，由其引發(fā)的食品安全事件層出不窮[24]，因此開發(fā)對單增李斯特菌快捷靈敏、準(zhǔn)確高效的檢測方法是目前的研究熱點(diǎn)。免疫學(xué)方法檢測單增李斯特菌是利用抗體能夠高親和力特異性地結(jié)合表面蛋白或菌體，具有簡便快捷的優(yōu)勢，使得免疫學(xué)檢測方法成為大樣本快速篩選的首選。如免疫層析試紙條等檢測產(chǎn)品具有攜帶方便、檢測快速、適合現(xiàn)場檢測等優(yōu)點(diǎn)使其成為有效的篩查工具，具有巨大的潛在市場和應(yīng)用價值[25]。所以，高質(zhì)量的抗體對實現(xiàn)單增李斯特菌的快速檢測是很有必要的。

生物信息學(xué)地迅速發(fā)展使其成為了解蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的有力工具。研究中利用生物信息學(xué)方法在數(shù)據(jù)庫中篩選出單增李斯特菌種內(nèi)保守、種間特異的基因即prsA1。利用SEPPA 2.0程序預(yù)測PrsA1的空間抗原表位，結(jié)果顯示PrsA1的非跨膜區(qū)具有良好的空間抗原表位，理論上具有良好的免疫原性。分別利用SignalP 4.1 Server程序和TMHMM Server V.2.0程序預(yù)測PrsA1的信號肽段、跨膜區(qū)域，預(yù)測結(jié)果顯示PrsA1是分泌蛋白，在它的N端存在信號肽，對蛋白定位起重要作用，主要是將它靶向細(xì)胞膜；此外，它具有跨膜結(jié)構(gòu)，跨膜區(qū)主要是把它錨定在細(xì)胞膜上，非跨膜區(qū)作為主要的酶結(jié)構(gòu)域，參與重要的酶催化活動。前期原核表達(dá)PrsA1效果不佳，優(yōu)化誘導(dǎo)表達(dá)條件也不能提高蛋白表達(dá)量，這可能與N端存在跨膜區(qū)相關(guān)?？缒さ鞍滓环矫嬗捎诮Y(jié)構(gòu)復(fù)雜性，鑲嵌在膜中的蛋白質(zhì)呈α螺旋結(jié)構(gòu)，結(jié)構(gòu)相對復(fù)雜；另一方面由于功能多樣性，膜蛋白作為離子通道具有一定的轉(zhuǎn)運(yùn)功能和傳遞信號的功能，可作為信號分子，為維持細(xì)胞內(nèi)部穩(wěn)定平衡，膜蛋白的合成可能受到嚴(yán)格調(diào)控[26,27]。PrsA1的信號肽序列在信號肽酶的作用下被切除，跨膜區(qū)氨基酸嵌入膜結(jié)構(gòu)未暴露出來不易形成抗原表位結(jié)構(gòu)。所以，在此基礎(chǔ)上，原核表達(dá)非跨膜區(qū)片段Δ84prsA1，并對Δ28PrsA1進(jìn)行免疫學(xué)驗證，以純化的Δ28PrsA1制備多克隆抗體，抗體的效價高達(dá)1∶128 000，并且該多抗能較好地與單增李斯特菌中天然PrsA1蛋白結(jié)合。本研究利用生物信息學(xué)篩選檢測靶標(biāo)并分析抗原表位結(jié)構(gòu)，最后成功制備多克隆抗體，為單增李斯特菌檢測靶標(biāo)的篩選和免疫學(xué)檢測提供了實踐基礎(chǔ)。

參 考 文 獻(xiàn)

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