HIPK3基因3′UTR 雙熒光素酶報告質(zhì)粒的構(gòu)建及其與靶向miR- 146的驗(yàn)證

楊開雯，強(qiáng) 鄭，靳文雨，劉 昉

(桂林醫(yī)學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 人體解剖學(xué)教研室， 廣西 桂林 541004)

微小RNA(miRNAs)是一種長度為18～25個核苷酸的小分子，通過作用于靶基因3′端非編碼區(qū)(untranslated regions，UTR)的特定序列，切割降解靶基因的mRNA分子，調(diào)節(jié)靶基因的翻譯，從而發(fā)揮調(diào)節(jié)效應(yīng)[1]。有數(shù)據(jù)顯示，miRNAs參與30%～50%基因的表達(dá)調(diào)控[2]。因而 miRNA 靶標(biāo)的檢測逐漸成為研究 miRNA 功能的重要環(huán)節(jié)。同源性的蛋白質(zhì)激酶3(homeodomain-interacting protein kinases，HIPK3)是一種已知的胰島素分泌調(diào)節(jié)劑，與人類2型糖尿病有關(guān)聯(lián)[3]。同時，發(fā)現(xiàn)在HIPK3敲除小鼠中出現(xiàn)胰島素分泌受損[4]。先前在糖尿病心肌病實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭袡z測到小鼠心臟的miR- 146水平顯著降低，HIPK3的mRNA水平顯著升高。比對miRDB 數(shù)據(jù)庫和DIANA TOOLS數(shù)據(jù)庫預(yù)測結(jié)果顯示，miR- 146與HIPK3基因 3′UTR可能存在互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)。因此，推測，HIPK3有可能是miR- 146的靶基因。本研究通過構(gòu)建HIPK3基因3′UTR野生型和突變型雙熒光素酶報告載體，分析miR- 146a mimics和miR- 146b mimics對含有野生型和突變型HIPK3基因3′UTR的雙熒光素酶報告載體活性的影響，為后續(xù)深入探討miR- 146及HIPK3在糖尿病心肌病發(fā)病機(jī)制中的作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試劑及材料

miR- 146a mimic、miR- 146b mimic、NC片段和PCR引物 (廣州銳博公司)；人胚胎腎上皮細(xì)胞系- 293T細(xì)胞(上海銳賽公司)；psicheck2質(zhì)粒、DMEM和轉(zhuǎn)染試劑POLO3000(上海銳賽公司)；Trizol、T4 DNA連接酶及限制性內(nèi)切酶(TaKaRa公司)；反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Fermentas公司)；SYBR Green mix(諾維贊公司)；雙熒光素酶檢測試劑盒(Promega公司)。

1.2 方法

1.2.1 靶基因預(yù)測：miRDB 數(shù)據(jù)庫和DIANA TOOLS數(shù)據(jù)庫預(yù)測交叉結(jié)果顯示，預(yù)測miR- 146與HIPK3可能的靶向結(jié)合位點(diǎn)，預(yù)測結(jié)果取交集。

1.2.2 熒光素酶報告載體的構(gòu)建：根據(jù)HIPK3基因的3UTR區(qū)序列設(shè)計并合成PCR 引物，HIPK3-XhoⅠ-F：5′-TCAGctcgagATACACTGCAAGGTGTAG GAAGATT-3′，HIPK3-PmeⅠ-R：5′-AGTGCgtttaaacTT TGCCGCAATATATATATTTTAATTC-3′，下劃線標(biāo)記為XhoⅠ、PmeⅠ的酶切位點(diǎn)序列，預(yù)計擴(kuò)增片段長度396 bp?；蛉L的PCR擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳分離PCR產(chǎn)物，并用AXGGEN膠回收試劑盒回收目的片段。將目的基因PCR產(chǎn)物和目的載體用XhoⅠ和PmeⅠ分別37 ℃酶切4～5 h后，電泳分離酶切片段，切膠回收目的片段。T4 DNA ligase 連接酶切后的PCR產(chǎn)物及目的載體，并將10 μL連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含抗性的LB平皿，37 ℃培養(yǎng)過夜。次日，挑取單菌落進(jìn)行菌落PCR，將PCR鑒定呈陽性的克隆接種到LB液體培養(yǎng)基中，搖菌過夜，次日抽提質(zhì)粒。應(yīng)用引物(Fm:5′-AGTATTTCTCTCTGTGATTTAAATGTGAC-3′；Rm：5′-CACATTTAAATCACAGAGAGAAATACTATCG-3′)獲得突變質(zhì)粒。將菌落PCR呈陽性的克隆送上海銳賽公司測序，并進(jìn)行序列比對，將測序正確的重組質(zhì)粒分別命名為HIPK3-WT(野生型)，HIPK3-MU(突變型)。

1.2.3 細(xì)胞培養(yǎng)及miR- 146a mimic、miR- 146b mimic瞬時轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞：用DMEM高糖培養(yǎng)基進(jìn)行293T細(xì)胞培養(yǎng)及傳代。轉(zhuǎn)染前24 h，利用胰蛋白酶消化細(xì)胞，接入6孔板中培養(yǎng)，待細(xì)胞增值至70%～80%匯合度時進(jìn)行轉(zhuǎn)染。配制轉(zhuǎn)染試劑混合物：A管：取miR- 146a mimic(5 nmol/L)+ miR- 146b mimic(5 nmol/L)2 μL與100 μL基本培養(yǎng)基混勻；B管：6 μL轉(zhuǎn)染試劑與100 μL基本培養(yǎng)基混勻。將B管溶液加入A組各管中，混勻，分別均勻滴加到培養(yǎng)板的細(xì)胞中， 37 ℃培養(yǎng)箱中孵育。轉(zhuǎn)染24 h后，熒光顯微鏡觀察細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率。從轉(zhuǎn)染的目的細(xì)胞中提取總RNA，根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板進(jìn)行熒光定量PCR，用2-△△Ct法計算各基因的表達(dá)相對定量。

1.2.4 海腎熒光目的質(zhì)粒、螢火蟲熒光內(nèi)參質(zhì)粒共轉(zhuǎn)293T目的細(xì)胞：轉(zhuǎn)染前24 h，利用胰蛋白酶消化293T細(xì)胞，接入24孔板中培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染當(dāng)天，從細(xì)胞中移除培養(yǎng)基，換上新鮮的不含抗生素完全培養(yǎng)基，37 ℃孵育。配制轉(zhuǎn)染試劑混合物：A管：取HIPK3-WT質(zhì)粒(250 ng)和HIPK3-MU質(zhì)粒(250 ng)總量0.5 μg與 25 μL基本培養(yǎng)基混勻；B管：3 μL轉(zhuǎn)染試劑與25 μL基本培養(yǎng)基混勻。將B管溶液加入A組各管中，混勻，取上述轉(zhuǎn)染混合液分別均勻滴加到培養(yǎng)板的細(xì)胞中，37 ℃培養(yǎng)箱中孵育。轉(zhuǎn)染48 h后，熒光顯微鏡觀察細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率，收取檢測樣。各實(shí)驗(yàn)組設(shè)3個復(fù)孔，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。轉(zhuǎn)染細(xì)胞分組如下： 1)HIPK3-WT + NC陰性對照；2)HIPK3-WT+miR- 146a mimics；3)HIPK3-WT+miR- 146b mimics；4)HIPK3-MU+NC陰性對照；5)HIPK3-MU+miR- 146a mimics；6)HIPK3-MU+miR- 146b mimics。各轉(zhuǎn)染組反應(yīng)48 h后，消化細(xì)胞，對各組的熒光素酶活性進(jìn)行檢測。

1.2.5 雙熒光素酶活性的檢測：按照雙熒光素酶檢測試劑盒提供的操作方法，依次加入螢火蟲熒光素酶及海腎熒光素酶底物，進(jìn)行熒火蟲熒光素酶(firefly luc)及內(nèi)對照海腎素?zé)晒馑孛?renilla luc)熒光強(qiáng)度檢測，計算firefly luc/renilla luc的比值，并以HIPK3-WT或HIPK3-MU與NC共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞作對照。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 miR- 146與HIPK3靶點(diǎn)預(yù)測

miR- 146家族有兩個成員，分別是miR- 146a和miR- 146b，二者在3′端非種子區(qū)有兩個不同堿基。通過miRDB和DIANA TOOLS兩個數(shù)據(jù)庫的查詢比對，發(fā)現(xiàn)miR- 146a和miR- 146b都可能靶向HIPK3基因，它們的可能結(jié)合位點(diǎn)都一樣(圖1)。這提示HIPK3極有可能是miR- 146a和miR- 146b的靶基因。

2.2 野生型及突變型重組雙熒光素酶報告載體的構(gòu)建

目的片段的PCR擴(kuò)增得到長度為396 bp的HIPK3基因的3′UTR序列(圖2)，連入載體，獲得重組質(zhì)粒，PCR驗(yàn)證與預(yù)期大小相符(圖3)。HIPK3-WT重組載體進(jìn)行測序，與DIANA TOOLS中HIPK3基因與miR- 146結(jié)合位點(diǎn)序列一致(圖4)。HIPK3-MU重組載體進(jìn)行測序可見HIPK3與miR- 146結(jié)合位點(diǎn)缺失(圖5)。

2.3 驗(yàn)證miR- 146a mimic和miR- 146b mimic細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率

轉(zhuǎn)染了miR- 146a mimic和miR- 146b mimic的細(xì)胞中，miR- 146a和miR- 146b表達(dá)顯著升高，說明轉(zhuǎn)染成功(圖6)。

2.5 野生型和突變型重組報告載體的活性分析

各組轉(zhuǎn)染細(xì)胞相對熒光素酶活性(表1)，共轉(zhuǎn)染miR- 146b mimic和HIPK3-WT(t=4.175，P<0.05)的熒光素酶活性下降，而共轉(zhuǎn)染miR- 146a mimic和野生型HIPK3-WT的熒光素酶活性無明顯變化；另外，共轉(zhuǎn)染miR- 146a mimic和HIPK3-MU的熒光素酶活性與共轉(zhuǎn)染miR- 146b mimic和HIPK3-MU的熒光素酶活性都沒有出現(xiàn)明顯變化。

A.prediction of the binding site of HIPK3 with miR- 146a; B.prediction of the binding site of HIPK3 with miR- 146b圖1 miR- 146與HIPK3結(jié)合位點(diǎn)的預(yù)測Fig 1 Prediction of the binding site of HIPK3 with miR- 146

1.marker-DL2000; 2-4.HIPK3 3′UTR PCR amplifiction圖2 HIPK3 3′-UTR PCR擴(kuò)增電泳結(jié)果Fig 2 The results of the HIPK3 3′-UTR PCR amplifiction electrophoresis

1-10.wild type recombinant PCR amplification;11.marker-DL2000圖3 重組野生型載體菌落PCR鑒定Fig 3 Wild type recombinant plasmid colony PCR identification

A.contrast of sequencing between the wild type vector and the target fragment; B.partial sequencing analysisdiagram of wild type vector

A.contrast of sequencing between the mutant vector and the target fragment; B.partial sequencing analysisdiagram of mutation vector

圖6 qPCR 檢測轉(zhuǎn)染后細(xì)胞內(nèi)miR- 146a和miR- 146b的表達(dá)Fig 6 qPCR detects the expression of miR- 146a and miR- 146b after transfection

groupsratiooffluorescenceintensityWT+NC 0881±0026MU+NC 0870±0075WT+miR?146a 0815±0073MU+miR?146a 0740±0051WT+miR?146b 0630±0054?MU+miR?146b 0671±0059

*P<0.05 compared with WT+NC group.

3 討論

miRNAs 是通過對靶基因表達(dá)的調(diào)節(jié)并引發(fā)下游一系列的節(jié)聯(lián)反應(yīng)導(dǎo)致疾病的發(fā)生發(fā)展。miR- 146家族有miR- 146a和miR- 146b兩種，二者位于不同的染色體，序列僅在3’端“非種子區(qū)”有兩個不同堿基。miR- 146在2型糖尿病患者血清中表達(dá)減少是慢性炎性反應(yīng)的標(biāo)志[5]；miR- 146a在糖尿病腎[6]和糖尿病患者的血漿和角膜上皮組織[7- 8]表達(dá)增加，在糖尿病大鼠的坐骨神經(jīng)[9]中下調(diào)；miR- 146b在糖尿病視網(wǎng)膜炎性反應(yīng)患者中表達(dá)降低[10]，而在人和小鼠的心肌炎[11]、自發(fā)性心肌肥大、心力衰竭小鼠[12]的心臟中表達(dá)明顯上調(diào)。這些研究都顯示出，miR- 146與糖尿病及心血管疾病的發(fā)生發(fā)展有很大聯(lián)系。

HIPK3在糖尿病小鼠的胰島中高表達(dá)[4]。在前期的實(shí)驗(yàn)中，HIPK3在糖尿病心肌病實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷谋磉_(dá)明顯升高，miR- 146表達(dá)下降，呈現(xiàn)出一種負(fù)相關(guān)關(guān)系。這說明，HIPK3在糖尿病以及其并發(fā)癥的發(fā)病過程中具有重要作用。但是，HIPK3作用于miR- 146的具體靶點(diǎn)還需要實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探索。生物信息學(xué)軟件預(yù)測HIPK3有可能是miR- 146的下游靶基因，設(shè)計構(gòu)建野生型和突變型HIPK3基因雙熒光素酶報告載體實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，共轉(zhuǎn)染miR- 146a mimic和HIPK3-WT組的熒光素酶活性無顯著變化，表明miR- 146a與HIPK3基因不具有靶向關(guān)系；共轉(zhuǎn)染miR- 146b mimic和HIPK3-WT組的熒光素酶活性下降，說明miR- 146b能與HIPK3結(jié)合，從而抑制熒光素酶活性。也就是說miR- 146b可以特異性作用于HIPK3基因的 3′UTR位置的 313～320序列，說明miR- 146b對HIPK3基因有調(diào)控作用。這一結(jié)果為進(jìn)一步研究 miR- 146b在糖尿病心肌病中的作用提供了部分參考。

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新聞點(diǎn)擊

嬰幼兒使用抗生素過敏癥風(fēng)險增加

據(jù)英國《BBC新聞》(BBCNEWS)2016- 09- 09報道，荷蘭最新研究發(fā)現(xiàn)，兩歲以下嬰幼兒服用抗生素會增加罹患濕疹和花粉癥等過敏問題的風(fēng)險。

研究人員重新檢視了1966至2015年的22項相關(guān)研究，分析了近40萬患者的數(shù)據(jù)，以尋找抗生素使用與花粉熱、濕疹等過敏癥之間的聯(lián)系。

在英國倫敦舉行的歐洲呼吸學(xué)會(European Respiratory Society)年度會議上發(fā)表的研究結(jié)論是，嬰幼兒時期使用抗生素的人患濕疹的風(fēng)險較其他人增加15%～41%，患花粉癥的風(fēng)險則增加14%～56%。接受的抗生素療程時間越長，罹上述疾病風(fēng)險越高。

參與研究的荷蘭Utrecht大學(xué)首席研究員法里巴·阿瑪?shù)显?Fariba Ahmadizar)認(rèn)為，其原因可能在于抗生素會擾亂人體免疫系統(tǒng)、破壞正常腸道菌群，導(dǎo)致日后接觸無害外來物質(zhì)時易發(fā)生過敏；此外，抗生素也會直接削弱人體免疫反應(yīng)。

曾有研究者想找出低齡人群使用抗生素與過敏癥之間的關(guān)聯(lián)，但未能得出一致結(jié)論。學(xué)術(shù)界一直對發(fā)達(dá)國家人口的過敏率飆升不解，很多人提出可能是童年接觸不同細(xì)菌所致，但確切的發(fā)病機(jī)制尚不清楚。

未參與研究的英國布里斯托爾大學(xué)(University of Bristol)兒科教授亞當(dāng)·芬恩(Adam Finn)認(rèn)為，這一發(fā)現(xiàn)進(jìn)一步證實(shí)了使用抗生素會有長期的不良反應(yīng)，醫(yī)學(xué)界之前就對濫用抗生素導(dǎo)致的抗生素抗藥性表示憂慮。

而另一方面，鑒于抗生素能有效對抗細(xì)菌感染，挽救了無數(shù)人的生命，芬恩和其他專家也表示，醫(yī)生在使用抗生素時還須權(quán)衡利弊。