檸檬苦素抑制PM2.5吸入誘導(dǎo)的大鼠氣道炎性反應(yīng)及黏液高分泌狀態(tài)

劉美花，周向東

(海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 呼吸內(nèi)科，海南 ?？?570102)

黏液高分泌是慢性氣道炎性反應(yīng)疾病最突出的病理表象，過量分泌的黏液既阻礙正常黏液纖毛清除機(jī)制，又易潴留于氣道，引起細(xì)菌定植，導(dǎo)致反復(fù)感染和頑固性炎性反應(yīng)[1]。目前針對(duì)黏液高分泌的治療已獲得一定的臨床效果，但許多治療藥物存在作用靶點(diǎn)分布廣、缺乏組織特異性等問題，因而找到一種肺組織特異性的干預(yù)靶分子對(duì)其治療具特殊意義。近些年研究發(fā)現(xiàn)肺組織表達(dá)一種與感知苦味質(zhì)密切相關(guān)的苦味受體(bitter taste receptors, TAS2Rs)[2- 3]，目前對(duì)TAS2Rs的研究主要聚焦其支氣管舒張作用，而對(duì)其在氣道黏液分泌中的作用涉及甚少，基于對(duì)氣道具有舒張作用的物質(zhì)對(duì)氣道黏液的分泌也具有不同程度的作用，采用中藥陳皮中的苦味組分檸檬苦素為干預(yù)因素，觀察氣道TAS2Rs的激活表達(dá)對(duì)氣道黏蛋白分泌的影響及機(jī)制，藉此為氣道黏液高分泌的靶向治療提供新的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

SPF級(jí)Wistar大鼠，雌雄不限，4～6周齡，體質(zhì)量(200±20)g[廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(粵)2013- 0002]；中藥單體化合物：檸檬苦素(陳皮提取物，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.5%，西安開來生物工程有限公司)；TH- 150C型大容量大氣總顆粒物智能采樣器(Andersen公司)；石英纖維膜(Whatman公司)；兔抗鼠β-Actin抗體(碧云天生物技術(shù)有限公司)；兔抗鼠TAS2R14多克隆抗體、HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG、兔抗鼠IL- 1β抗體(Abcam公司)；兔抗鼠MUC5AC、MUC5B單克隆抗體(北京博奧森生物公司)；GAPDH(Sigma公司)；兔抗大鼠中性粒細(xì)胞趨化因子(CINC- 1)抗體(Assay Designs公司)；MUC5AC、MUC5B ELISA試劑盒(名勁生物科技有限公司)；RT-PCR試劑盒、RNA抽提試劑盒(TaKaRa公司)；RIPA裂解液(博士德生物)；所有引物均由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 PM2.5 的采集及懸浮液的制作: 到建筑工地附近，用智能采樣器采集空氣中的PM2.5顆粒物，將顆粒物采集在30 cm×20 cm的石英纖維濾膜上，連續(xù)采樣24 h，采集連續(xù)1個(gè)月，剪短吸附PM2.5的石英纖維濾紙，將濾紙對(duì)折后侵入超純水，以超聲波低溫振蕩30 min，再用紗布過濾洗脫液，將濾液置于4 ℃、10 000 r/min下離心3次，每次20 min，棄上清并稱質(zhì)量后，保存于-20 ℃冰箱，用0.9%氯化鈉溶液配成40 μg/mL顆粒物懸液，超生振蕩20 min后混合均勻，保存于4℃冰箱備用。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組: 將大鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組、PM2.5組[以PM2.5的顆粒物懸液(40 μg/mL)6 mL經(jīng)超聲霧化吸入進(jìn)行毒染，約30 min/次，1次/d，染毒溫度37 ℃，染毒時(shí)間持續(xù)4周，制成慢性氣道炎性反應(yīng)的動(dòng)物模型]和PM2.5+檸檬苦素組(在給予PM2.5毒染1 h后給予霧化吸入20 μmol/L的檸檬苦素溶液6 mL，約30 min/次，1次/d)，每組10只。于第28天處死，均在末次染毒實(shí)驗(yàn)處理結(jié)束24 h后處死，分別經(jīng)氣管插管收集肺泡灌洗液，剝離氣管和肺臟，將其收集于-80 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 ELISA檢測BALF中MUC5AC、MUC5B的含量: 所有大鼠腹腔麻醉后，收集BALF，回收量不少于5 mL，經(jīng) 1000 r/min離心10 min，取BALF上清液備用。按試劑盒說明書進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋和加樣。加樣：分別設(shè)3個(gè)復(fù)孔，分別取BALF上清液100 μL包被酶標(biāo)板，于4℃冰箱過夜，采用含1%牛血清白蛋白的PBS-Tween 20于37 ℃下封閉60 min，MUC5AC、MUC5B一抗以l∶500倍稀釋，分別取100μL，37 ℃孵育60 min，HRP標(biāo)記羊抗鼠IgG以1∶1 000稀釋，取100 μL，37 ℃孵育60 min，底物溶液100 μL，于37 ℃顯色15 min后停止反應(yīng)。最后于492 nm處測吸光度作為MUC5AC、MUC5B含量的相對(duì)值(A值)。

1.2.4 RT-PCR檢測支氣管肺組織中TAS2R14、IL- 1β、CINC- 1、MUC5AC和MUC5B的mRNA含量： 采用Trizol法提取各組肺組織的總RNA，用分光光度計(jì)測定總RNA濃度及在260 nm和280 nm的吸光度(A)值，樣品A260/A280比值均介于1.6～1.8，樣品總RNA初步定量，-20 ℃保存?zhèn)溆?。兩步法進(jìn)行RT-PCR。參照cDNA合成試劑盒說明書合成cDNA第一鏈。引物序列見表1。滅菌PCR管中依次加入MgCl：(25 mmoL/L)4.0 μL、10×PCR反應(yīng)緩沖液5.0 μL、上下游引物各1.0 μL、dNTP 4.0 μL、cDNA 2.0 μL、Taq酶(5×106U/L) 0.5 μL，用ddH2O定容至50.0 μL，輕輕混勻離心后于PCR儀行PCR擴(kuò)增。于94 ℃預(yù)變性3 min，后緊隨35個(gè)循環(huán)，循環(huán)參數(shù)：94 ℃ 30 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，后72 ℃延伸5 min補(bǔ)齊末端。產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，電泳結(jié)果經(jīng)吸光度面積積分分析，以與管家基因GAPDH mRNA的比值，作為目的基因mRNA的相對(duì)值。

1.2.5 Western blot檢測TAS2R14、IL- 1β、CINC- 1、MUC5AC和MUC5B蛋白含量： 稱取0.1 g各實(shí)驗(yàn)大鼠的肺和氣管組織，加入1 mL RIPA裂解液勻漿10 min，置于冰上裂解10 min后，4 ℃12 000 r/min離心10 min，取上清液，用蛋白定量試劑盒對(duì)上清液進(jìn)行蛋白定量，分裝后，置于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。各組蛋白樣品經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳分離，將蛋白印跡轉(zhuǎn)移至PVDF膜，將PVDF膜于5%脫脂牛乳(PBS稀釋)中封閉l h，加入兔抗鼠TAS2R14多克隆抗體(稀釋倍數(shù)為1∶500)，IL- 1β、CINC- 1、MUC5AC、MUC5B和β-actin抗體(稀釋倍數(shù)均為1∶1 000)，置于4 ℃冰箱孵育過夜，次日取出于室溫下孵育1 h，不斷搖晃，洗滌3次后加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG(1∶2 000)，室溫下孵育1 h。充分洗滌后經(jīng)ECL顯色，加入底物與反應(yīng)液，于暗室內(nèi)曝光5 min。結(jié)果經(jīng)吸光度值分析，以與內(nèi)參照β-actin產(chǎn)物條帶的比值作為相對(duì)含量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 ELISA檢測BALF中MUC5AC、MUC5B蛋白分泌情況

PM2.5刺激組MUC5AC、MUC5B蛋白分泌水平顯著高于對(duì)照組(P<0.01)；檸檬苦素干預(yù)組的MUC5AC、MUC5B蛋白分泌水平進(jìn)一步升高(P<0.05)(表2)。

表1 RT-PCR各目的基因引物序列Table 1 The primer sequenc of target genes for RT-PCR

表2 各組的黏蛋白分泌表達(dá)

*P<0.01 compared with the control group;#P<0.05 compared with PM2.5 group.

2.2 RT-PCR檢測支氣管/肺組織TAS2R14、IL- 1β、CINC- 1、MUC5AC、MUC5B mRNA的轉(zhuǎn)錄情況

PM2.5刺激組中，IL- 1β、CINC- 1、MUC5AC和MUC5B mRNA表達(dá)水平均高于對(duì)照組(P<0.05)；檸檬苦素干預(yù)組的TAS2R14 mRNA表達(dá)水平比PM2.5刺激組明顯增加(P<0.05)，而IL- 1β、CINC- 1、MUC5AC和MUC5B的mRNA表達(dá)水平則降低(P<0.05)(圖1，表3)。

1.control group； 2.PM2.5 group；3.PM2.5+ limonin group圖1 各組黏蛋白、炎性反應(yīng)因子和苦味受體的 mRNA表達(dá)水平Fig 1 The mRNA expression levels of mucins, inflammatory cytokines and bitter taste receptor in each group

2.3 Western blot法檢測大鼠支氣管/肺組織中TAS2R14、IL- 1β、CINC- 1、MUC5AC、MUC5B蛋白表達(dá)情況

與對(duì)照組相比較，PM2.5組中的IL- 1β、CINC- 1、MUC5AC、MUC5B蛋白含量明顯升高(P<0.05)；與PM2.5組相比，檸檬苦素干預(yù)組的IL- 1β、CINC- 1蛋白表達(dá)水平減少(P<0.05)，MUC5AC、MUC5B蛋白表達(dá)也降低(P<0.05)，但TAS2R14蛋白表達(dá)水

平則明顯升高(圖2，表4)。

3 討論

氣道黏液高分泌是慢性氣道炎性反應(yīng)疾病的病理特征之一，目前已被視為慢性阻塞性肺疾病和哮喘發(fā)病率及病死率升高的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[4]。黏蛋白是構(gòu)成氣道黏液的主要成分，目前已發(fā)現(xiàn)21種MUC基因， 其中MUC5AC和MUC5B是氣道中主要的分泌型，MUC5AC/MUC5B的比值對(duì)維持黏液性狀有突出作用。臨床上針對(duì)黏液高分泌的惡心類祛痰藥物的作用機(jī)制便是通過促進(jìn)漿液性的MUC5B分泌而使黏液稀釋易于纖毛排出[5]。

1.control group；2.PM2.5 group；3.PM2.5+ limonin group圖2 各組黏蛋白、炎性反應(yīng)因子和苦味受體的蛋白水平Fig 2 Protein levels of mucins, inflammatory cytokines and bitter taste receptor in each group

groupMUC5ACMUC5BIL?1βCINC?1TAS2R14control023±004022±007028±005027±011025±009PM25056±009?050±011?069±004?058±006?027±007PM25+limonin041±012#043±002#045±010#041±003#053±007#

*P<0.05 compared with the control group;#P<0.05 compared with PM2.5 group.

表4 各組的黏蛋白、炎性反應(yīng)因子及苦味受體蛋白表達(dá)Table 4 Protein expression results of mucins, inflammatory cytokines and bitter taste receptor in each

*P<0.05 compared with the control group;#P<0.05 compared with PM2.5 group.

TAS2Rs是哺乳動(dòng)物體內(nèi)感知苦味的一種味覺感受器[6]，對(duì)氣道TAS2Rs研究表明苦味刺激會(huì)激活TAS2Rs，產(chǎn)生平滑肌舒張和支氣管擴(kuò)張效應(yīng)[7- 8]，表達(dá)于氣道上皮細(xì)胞運(yùn)動(dòng)纖毛的TAS2Rs可加快纖毛擺動(dòng)頻率[9]，甚至有稱TAS2Rs活化可誘導(dǎo)細(xì)胞抗菌肽分泌而具有抗菌作用[10- 11]。鑒于臨床上的惡心類祛痰劑諸如陳皮、桔梗、前胡等中藥的藥用組分多數(shù)帶有苦味，故而認(rèn)為氣道TAS2Rs的激活對(duì)黏液的分泌也具有一定作用。

本實(shí)驗(yàn)選取肺組織高表達(dá)的TAS2R14為靶分子研究其對(duì)氣道黏液高分泌的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：PM2.5組的氣道炎性反應(yīng)因子IL- 1β和CINC- 1、黏蛋白MUC5AC和MUC5B的轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)水平均升高，形成氣道炎性反應(yīng)和黏液高分泌狀態(tài)，從ELISA檢測結(jié)果看，分泌的黏蛋白以黏液性的MUC5AC為主。而檸檬苦素干預(yù)組的MUC5AC和MUC5B的產(chǎn)生表達(dá)較PM2.5組均有所減少，表明檸檬苦素具抑制氣道黏液合成作用。檸檬苦素刺激后TAS2R14的表達(dá)明顯增加，與黏蛋白及炎性反應(yīng)因子的表達(dá)呈反比關(guān)系，提示TAS2R14對(duì)氣道黏蛋白的產(chǎn)生具抑制效應(yīng)，此效應(yīng)與炎性因子IL- 1β、CINC- 1產(chǎn)生減少有關(guān)。IL- 1β是慢性炎性氣道上侵潤的主要炎性細(xì)胞因子之一，IL- 1β可通過激活PKC信號(hào)通路及p38MAPK信號(hào)傳導(dǎo)通路介導(dǎo)MUC5AC基因的表達(dá)并促進(jìn)MUC的分泌[12]。CINC- 1則是炎性反應(yīng)過程中產(chǎn)生的趨化因子，是大鼠體內(nèi)起白介素- 8作用的類似物，主要介導(dǎo)中性粒細(xì)胞的趨化[13]，而后者釋放的彈性蛋白酶是目前巳知的最強(qiáng)促黏液分泌因子，具使MUC合成增加及導(dǎo)致氣道上皮杯狀細(xì)胞化生等多種氣道損害作用[13]。肺組織TAS2R14的激活可抑制IL- 1β和CINC- 1介導(dǎo)的炎性反應(yīng)細(xì)胞趨化作用，進(jìn)而阻止由炎性反應(yīng)因子釋放誘導(dǎo)的黏液高分泌。此外，TAS2R14激活后，灌洗液中MUC5AC和MUC5B的分泌量均增多，且以漿液性MUC5B增加為主，這與惡心類祛痰劑陳皮、桔梗等中藥通過促進(jìn)漿液性的MUC5B分泌而使黏液稀釋的機(jī)制相符合。

目前已知呼吸道TAS2Rs的激活可舒張支氣管、降低氣道阻力和增加黏液纖毛清除效率。本實(shí)驗(yàn)則表明，在氣道炎性黏液高分泌形成過程中，TAS2Rs的激活還具有抑制炎性因子及黏蛋白產(chǎn)生和促進(jìn)黏蛋白分泌的作用，提示TAS2Rs對(duì)慢性氣道炎性疾病的治療具多種有益效應(yīng)。這為臨床研究炎性氣道的黏液高分泌治療藥物提供新的干預(yù)靶點(diǎn)和理論依據(jù)。

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新聞點(diǎn)擊

止痛藥和抗憂郁藥男女使用效果有別

據(jù)美國WebMD醫(yī)學(xué)新聞網(wǎng)(2016- 09- 27)報(bào)道，一般人在服用止痛藥或抗憂郁藥前大多不會(huì)思考藥效可能男女有別?？d于CellMetabolism的一篇研究顯示，科學(xué)家發(fā)現(xiàn)這些藥物的藥效不僅會(huì)因劑量及服藥時(shí)間而有所不同，還會(huì)因?yàn)樾詣e而有所差異。

過去多數(shù)研究者在研究藥物時(shí)，多假設(shè)藥物的效果在男女身上同樣適用，很多止痛藥及抗憂郁藥的研究也是如此。但是最近越來越多科學(xué)家指出，激素及染色體會(huì)影響藥效；女性服用后的結(jié)果可能與男性不同。

有研究發(fā)現(xiàn)解熱鎮(zhèn)痛劑布洛芬(ibuprofen)對(duì)男性較有效，但對(duì)女性而言，使用鴉片類止痛藥(opioid painkillers)才能帶來較明顯的止痛效果。而在抗憂郁藥方面，女性服用SSRI抗抑郁藥的反應(yīng)較好，男性服用三環(huán)類抗憂郁藥(tricyclics)獲得的效果較好。

錫安山醫(yī)學(xué)中心的教授Deborah Clegg認(rèn)為，現(xiàn)在民眾所取得的處方藥可能從未在女性身上試驗(yàn)過，這是因?yàn)閹缀跛谢A(chǔ)研究(不論研究對(duì)象為動(dòng)物或人類)的研究對(duì)象主要都是男性。而有這種現(xiàn)象是因?yàn)檠芯空叨技僭O(shè)男女生理上沒有差異，并且女性經(jīng)期的激素變化會(huì)影響試驗(yàn)結(jié)果，因此研究者選擇男性作為研究對(duì)象。

寨卡病毒能由雌蚊傳給后代

據(jù)英國《BBC新聞》(BBCNEWS)2016- 08- 31報(bào)道，有研究發(fā)現(xiàn)，成年雌蚊可以將寨卡病毒(Zika virus)傳遞給后代。專家認(rèn)為，寨卡病毒會(huì)比以前認(rèn)為的更難控制。

該研究的共同作者、德州大學(xué)的泰敘博士(Robert Tesh)認(rèn)為，目前的防范方法是不夠的?！皣姙⒎椒ㄖ荒苡绊懗晌?，但這樣通常不能殺死蚊卵和孑孓(蚊子幼蟲)。噴灑滅蚊劑可降低傳播，但無法消除病毒。”

這一研究結(jié)果發(fā)表在《美國熱帶醫(yī)學(xué)和衛(wèi)生雜志》，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，寨卡、登革熱和黃熱病等病毒可從母蚊傳到蚊卵，而每290只幼蚊當(dāng)中，就有一只從雌蚊感染到寨卡病毒。泰敘博士認(rèn)為，病毒傳給下一代的比例雖然偏低，但一個(gè)熱帶城市中埃及伊蚊的數(shù)量足以令病毒留在一些城市內(nèi)，即使噴了殺蟲劑也不能消滅它。

雖然成人感染寨卡病毒只有輕微癥狀，卻會(huì)嚴(yán)重威脅懷孕婦女，一旦受到感染，出生的嬰兒會(huì)患有小頭癥和其他腦部異常的嚴(yán)重缺陷。

自2015年寨卡病毒在巴西爆發(fā)以來，已有超過1 800例小頭癥的病例報(bào)告，寨卡病毒及其引發(fā)的后遺癥已在美洲蔓延。