Lipofectamine2000降低 HeLa細胞系中DNMT1的表達

趙 丹，程易塵，吳曉明，羅 瑛，賈舒婷

(昆明理工大學 醫(yī)學院，云南 昆明 650500)

DNA甲基化是一種非常重要的表觀遺傳修飾，在基因的表達調(diào)控、基因組的穩(wěn)定性和發(fā)育過程中都發(fā)揮著重要的作用[1]。DNA甲基化的維持由DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶家族成員DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1(DNMT1)催化完成。DNA甲基化水平的改變，通常與DNMT1密切相關[3- 4]。而Lipofectamine2000是一種常用的陽離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑，廣泛地應用于特定基因的表達和敲低對細胞影響的研究。而陽離子脂質(zhì)體對細胞有一定的毒性作用[5]。轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine2000會影響細胞中DNMT1的表達，Lipofectamine2000對細胞的毒性作用可能是通過DNMT1實現(xiàn)的。因此本研究通對DNMT1在Lipofectamine2000處理Hela和395- 9B- 1(小鼠胚胎成纖維細胞)細胞不同時間后的表達情況進行檢測，并探討Lipofectamine2000對細胞的毒性作用。

1 材料與方法

1.1 材料:HeLa細胞、395- 9B- 1細胞、胎牛血清和胰蛋白酶(Amresco公司)；DMEM (Life Technologies公司)；Lipofectamine2000(Invitrogen公司)；5Aza(5-氮雜-2’-脫氧胞苷，Sigma公司)；DNMT1和beta-actin抗體(Santa Cruz公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)及處理:將細胞置于10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中,37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)HeLa和395- 9B- 1細胞，細胞覆蓋率為90%時傳代，達到70%～80%用Lipo2000處理。具體步驟為：將20 μL Lipofectamine2000加入3 mL OPti-DMEM培養(yǎng)基中室溫孵育25 min。吸除細胞培養(yǎng)液并用PBS清洗。將上述混合液加入培養(yǎng)皿中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。6 h后更換DMEM培養(yǎng)基終止處理，分別于處理后24、48及72 h和7 d收集細胞沉淀， -80 ℃保存?zhèn)溆谩?Aza處理細胞作為陽性對照。

1.2.2 RT-RCR檢測DNMT1的mRNA表達:收集細胞沉淀后，用Trizol提取總RNA，以Oligo-d(T)引物GoScriptTMReverse Transcription System試劑盒(Promega公司)進行反轉(zhuǎn)錄得到CDNA。實驗方法參照產(chǎn)品說明書。引物序列，DNMT1 正向引物5′-CCGTGGCTACGAGGAGAAC-3′，反向引物5′-TTGGGTTTCCGTTTAGTGGGG-3′；beta-actin正向引物5′-AGAGGGAAATCGTGCGTGAC-3′，反向引物5′-CAATAGTG ATGACCTGGCCGT-3′。

1.2.3 檢測DNMT1蛋白表達:取適量上述細胞沉淀提取蛋白，每孔加入15 μg蛋白進行SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白(電泳條件：恒壓140 V 1.5 h)。再用300 V、180 mA濕轉(zhuǎn)3.5 h至硝酸纖維素膜上，然后用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h。再加入相應一抗室溫反應3 h，用TBST緩沖液洗滌3次，每次5 min，后加入相應二抗，室溫反應2 h，用TBST洗滌6次，每次5 min。最后用顯影液處理1 min后用全自動洗片機進行顯影后的成像。

2 結果

2.1 Lipofectamine2000處理影響HeLa細胞的狀態(tài):Lipofectamine2000處理后24 h細胞變長，至72 h這一現(xiàn)象更加明顯，并且細胞外膜有向外延伸的狀態(tài)，而7 d后細胞形狀基本恢復到原先狀態(tài)(圖1)。

2.2 HeLa細胞中DNMT1的mRNA表達量:Lipofectamine2000處理HeLa細胞48 h后，DNMT1 mRNA降低；處理后7 d，DNMT1 mRNA明顯升高(圖2)。

2.3 Lipofectamine2000處理影響HeLa細胞中DNMT1蛋白的表達:經(jīng)Lipofectamine2000處理HeLa細胞48 h后DNMT1蛋白水平的表達顯著降低，72 h后有回升的趨勢(圖3)。

2.4 Lipo2000處理影響395- 9B- 1細胞中DNMT1的表達:用Lipo2000處理395- 9B- 1細胞后5 d，細胞中DNMT1蛋白有持續(xù)升高的趨勢(圖4)。

圖1 HeLa細胞形態(tài)圖Fig 1 The morphology of HeLa cells

*P<0.05 compared with control圖2 HeLa細胞中DNMT1的mRNA表達水平Fig 2 mRNA expression level of DNMT1 in HeLa

圖4 395- 9B- 1細胞中DNMT1蛋白表達變化Fig 4 The protein expression of DNMT1 in 395- 9B- 1 cells

A.Western blot results; B.quantitative chart of Western blot;*P<0.05 compared with control；△P<0.05 compared with 48 hours

3 討論

HeLa細胞是實驗中最常用的一種人源模式細胞，廣泛的應用于各種研究。Lipofectamine2000對細胞是有一定毒性的，而其具體的原因目前還不是很清楚。本研究發(fā)現(xiàn)這一毒性在Hela細胞中可能是通過對DNMT1蛋白水平的短期抑制改變細胞的表觀遺傳修飾來實現(xiàn)。小鼠胚胎成纖維細胞的實驗結果表明，Lipofectamine2000對細胞DNNT1表達的影響可能具有普遍性，為Lipofectamine2000的細胞毒性研究提供一個新的視角。

[1] Lorincz MC, Dickerson DR, Schmitt M,etal. Intragenic DNA methylation alters chromatin structure and elongation efficiency in mammalian cells[J]. Nat Struct Mol Biol, 2004, 11: 1068- 1075.

[2] Goll MG, Bestor TH. Eukaryotic cytosine methyltrans-ferases[J]. Annu Rev Biochem, 2005, 74:481- 514.

[3] Rhee I, Bachman KE, Park BH,etal. DNMT1 and DNMT3b cooperate to silence genes in human cancer cells[J]. Nature, 2002, 416: 552- 556.

[4] Zhi D, Zhang S, Cui S,etal. The headgroup evolution of cationic lipids for gene delivery[J]. Bioconjugate Chem, 2013, 24: 487- 519.

新聞點擊

出汗過多影響心理健康

據(jù)美國WebMD醫(yī)學新聞網(wǎng)(2016- 12- 14)報道，一項新研究指出，多汗癥(出汗過多癥狀)伴發(fā)有焦慮癥與憂郁癥的比例似乎也比一般人高一些。

研究發(fā)現(xiàn)，多汗癥篩檢陽性的人罹患焦慮癥與憂郁癥的概率分別為21%和27%，而其他患者檢出率分別為7.5%和10%以下。

這個研究結果并未證明多汗癥會導致哪些心理健康問題，因此，這個結果并不代表將多汗癥控制得較好會舒緩人們憂郁癥或焦慮癥的情況。但皮膚科醫(yī)生應該了解，這些患者有焦慮癥或憂郁癥的概率較高。

然而，有多汗癥的人通常會有自我意識避免社交活動，甚至像在課堂上舉手這些平凡的事情。

研究人員建議，多汗癥患者應該與醫(yī)生討論心理健康的問題。

該研究結果刊登在2016年12月《美國皮膚科學會雜志》。

低糖飲食對代謝有益

據(jù)美國WebMD醫(yī)學新聞網(wǎng)(2016- 12- 09)報道，有篇小型研究指出，吃低糖餐會對女性的代謝健康有益，若吃高糖餐則不會有這種改變。

研究人員發(fā)現(xiàn)，運動時間對代謝的益處起了很大的作用。

這篇研究顯示，當人們24 h內(nèi)的三餐只含有30%的碳水化合物時，他們的餐后胰島素抵抗以及胰島素含量會降低30%。

當人們在24 h內(nèi)的三餐含有60%碳水化合物，胰島素抵抗或胰島素含量就沒有降低這么多。

正常來說，運動被認為有助于降低胰島素抵抗，降低血糖值；但這篇研究結果顯示，在吃東西以前運動確實增加女性夜間血糖值。

Borer解釋，運動時需要能量，誘發(fā)激素作用，讓肝糖元釋放出來。身體大部分出現(xiàn)組織胰島素抵抗，允許大腦以及肌肉使用多余的糖類。如果組織沒有使用完所有的糖類，血糖就會維持在很高的狀態(tài)。

然而，吃飯后運動消耗的熱量就是餐點所提供的能量，而不是由肝臟提供；建議在吃完飯后40 min內(nèi)運動。

Borer指出，這篇研究的對象只是健康的女性，而且研究是短期的，不能評價低糖飲食以及運動是如何影響某些糖尿病前期或2型糖尿病患者。