二氫楊梅素對(duì)順鉑體外抗乳腺癌作用的干預(yù)及其機(jī)制研究

胡蓉蓉 徐廣濤

乳腺癌是女性發(fā)病率最高的惡性腫瘤，而且乳腺癌具有早期轉(zhuǎn)移的特點(diǎn)。順鉑是一種廣譜抗腫瘤藥物，在乳腺癌的化療中具有重要的作用，它能與腫瘤細(xì)胞DNA 發(fā)生結(jié)合從而抑制DNA的合成、復(fù)制和轉(zhuǎn)錄并誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡[1-2]。然而順鉑長(zhǎng)期使用副反應(yīng)較大。研究[3]表明，腫瘤細(xì)胞沉默信息調(diào)節(jié)因子2相關(guān)酶1（SIRT1）的表達(dá)水平與其對(duì)順鉑治療的敏感性有關(guān)，SIRT1的過表達(dá)能提高腫瘤細(xì)胞對(duì)順鉑的抵抗性。然而，天然藥物輔助治療是否能以SIRT1為靶點(diǎn)促進(jìn)順鉑的抗腫瘤活性，至今仍很少報(bào)道。本文探討二氫楊梅素是否對(duì)順鉑有協(xié)同抗乳腺癌效應(yīng)并研究其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材 料 RPMI-1640培養(yǎng)基購(gòu)于美國(guó)Gibco（批號(hào) 11875093）。碘化丙啶（PI，批號(hào) P4170）、Annexin V-FITC凋亡檢測(cè)試劑盒（批號(hào)APOAF）、噻唑藍(lán)（MTT，批號(hào)M2128）、二氫乙啶（DHE，批號(hào)D7008）、二氫楊梅素（批號(hào) SML0295）、N-乙酰半胱氨酸（NAC，批號(hào) 1009005）和順鉑（批號(hào) 1134357）購(gòu)于美國(guó)Sigma-Aldrich。SIRT1抗體（批號(hào)8469）、活化型Caspase-9抗體（批號(hào)20750）、活化型Caspase-3抗體（批號(hào)9661）、磷酸化JNK抗體（批號(hào) 9251）和GAPDH抗體（批號(hào)5174）購(gòu)于美國(guó)Cell Signaling。增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光底物（ECL）試劑盒（貨號(hào)32106）購(gòu)于美國(guó) Pierce。脂質(zhì)體 2000（Lipofectamine 2000，批號(hào)11668019）購(gòu)于美國(guó)Invitrogen。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 人正常乳腺上皮細(xì)胞系MCF-10A，人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7、MDA-MB-231、MDA-MB-435購(gòu)于美國(guó)模式培養(yǎng)物保藏所（ATCC）。細(xì)胞培養(yǎng)在含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中，培養(yǎng)環(huán)境為37°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)并通入5%CO2。

1.3 質(zhì)粒構(gòu)建和轉(zhuǎn)染 將SIRT1基因的開放閱讀框架序列經(jīng)PCR擴(kuò)增后以分子克隆的方法與pcDNA3.1連接后構(gòu)建成SIRT1重組真核表達(dá)質(zhì)粒。SIRT1表達(dá)質(zhì)粒用Lipofectamine 2000按試劑操作說明書步驟進(jìn)行轉(zhuǎn)染，將2μg/mL SIRT1表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入MDA-MB-435細(xì)胞中。

1.4 細(xì)胞活力檢測(cè) 將MDA-MB-435細(xì)胞按5×103/孔接種在96孔板上，分為對(duì)照組、二氫楊梅素組、順鉑組、順鉑+二氫楊梅素組、順鉑+二氫楊梅素+NAC組和順鉑+二氫楊梅素+SIRT1質(zhì)粒組。對(duì)照組為MDA-MB-435細(xì)胞不加藥物培養(yǎng)48h，順鉑組為在MDA-MB-435細(xì)胞中加入2μmol/L的順鉑培養(yǎng)48h，二氫楊梅素組為在MDA-MB-435細(xì)胞中加入10μmol/L的二氫楊梅素培養(yǎng)48h，順鉑+二氫楊梅素組為在MDA-MB-435細(xì)胞中加入2μmol/L的順鉑和10μmol/L的二氫楊梅素培養(yǎng)48h，順鉑+二氫楊梅素+NAC組為在MDA-MB-435細(xì)胞中加入2μmol/L的順鉑、10μmol/L的二氫楊梅素和2mmol/L NAC培養(yǎng)48h，順鉑+二氫楊梅素+SIRT1質(zhì)粒組為先將2μg/mL的SIRT1表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入MDA-MB-435細(xì)胞中培養(yǎng)24h，之后更換培養(yǎng)基再加入2μmol/L的順鉑和10μmol/L的二氫楊梅素繼續(xù)培養(yǎng)48h。藥物處理完畢后在MDA-MB-435培養(yǎng)體系中加入20μL 5g/L MTT再培養(yǎng)4h，棄去上清，往孔中加入150μL二甲亞砜，充分震蕩后在570nm波長(zhǎng)下用酶標(biāo)儀檢測(cè)OD值，MDA-MB-435細(xì)胞活力抑制率用以下公式計(jì)算：抑制率=（OD對(duì)照組-OD藥物處理組）/OD對(duì)照組×100%。

1.5 細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn) 將MDA-MB-435細(xì)胞按2×106/孔接種在6孔板上，按上述進(jìn)行分組處理。處理完畢后按照凋亡試劑盒說明書步驟將PI和Annexin-V加入細(xì)胞中暗室孵育20min，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)MDA-MB-435細(xì)胞的凋亡，凋亡率用Annexin-V陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)的百分比表示。

1.6 活性氧簇（ROS）測(cè)定 將細(xì)胞按2×106/孔接種在6孔板上，按上述進(jìn)行分組處理。藥物處理完畢后在MDA-MB-435細(xì)胞中加入5μmol/L DHE暗室孵育20min，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)MDA-MB-435細(xì)胞ROS的水平。紅色熒光越強(qiáng)則ROS水平越高[4]。

1.7 Western blot實(shí)驗(yàn) 將細(xì)胞按2×106/孔接種在6孔板上，按上述進(jìn)行分組處理。藥物處理完畢后將細(xì)胞用蛋白提取液提取總蛋白質(zhì)。之后將提取的總蛋白質(zhì)用12%SDS-PAGE進(jìn)行電泳分離。分離完畢后通過電轉(zhuǎn)方法將蛋白質(zhì)從分離膠上轉(zhuǎn)到PVDF膜上，用SIRT1抗體、活化型Caspase-9抗體、活化型Caspase-3抗體、磷酸化JNK抗體或GAPDH抗體孵育過夜，之后再用帶辣根過氧化物酶的二抗孵育2h，蛋白條帶用ECL試劑盒顯色發(fā)光。

2 結(jié)果

2.1 二氫楊梅素增強(qiáng)順鉑對(duì)MDA-MB-435細(xì)胞殺傷活性 MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，順鉑+二氫楊梅素組MDA-MB-435細(xì)胞的細(xì)胞活力抑制率顯著高于順鉑組、二氫楊梅素組和和二氫楊梅素+順鉑+SIRT1質(zhì)粒組（P均＜0.05），流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，順鉑+二氫楊梅素組MDA-MB-435細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)率顯著高于順鉑組和二氫楊梅素組（P＜0.05）。順鉑+二氫楊梅素+SIRT1組MDA-MB-435的細(xì)胞活力抑制率和凋亡誘導(dǎo)率顯著低于順鉑聯(lián)合二氫楊梅素組（P＜0.05）。見表 1。

表1 各組細(xì)胞活力抑制率、凋亡誘導(dǎo)率比較（%，±s）

表1 各組細(xì)胞活力抑制率、凋亡誘導(dǎo)率比較（%，±s）

注：與順鉑組比較，△P＜0.05；與二氫楊梅素組比較，▲P＜0.05；與順鉑+二氫楊梅素組比較，*P＜0.05

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2.2 二氫楊梅素通過抑制SIRT1表達(dá)水平增強(qiáng)順鉑對(duì)MDA-MB-435細(xì)胞殺傷活性 Western blot結(jié)果顯示，與人正常乳腺癌上皮細(xì)胞MCF-10A比較，SIRT1在乳腺癌細(xì)胞系均發(fā)生過表達(dá)。二氫楊梅素處理后MDA-MB-435細(xì)胞SIRT1表達(dá)水平顯著下調(diào)，而順鉑對(duì)SIRT1的表達(dá)無影響。為了判斷二氫楊梅素發(fā)揮協(xié)同作用的機(jī)制是否與SIRT1下調(diào)有關(guān)，在MDA-MB-435細(xì)胞轉(zhuǎn)染SIRT1表達(dá)質(zhì)粒使SIRT1蛋白強(qiáng)制表達(dá)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染SIRT1質(zhì)粒能顯著減弱二氫楊梅素聯(lián)合順鉑對(duì)MDA-MB-435細(xì)胞活力的抑制和凋亡的誘導(dǎo)，表明二氫楊梅素可能通過抑制SIRT1表達(dá)水平增強(qiáng)順鉑對(duì)MDA-MB-435細(xì)胞的殺傷活性。見圖1（封二）。

2.3 二氫楊梅素通過SIRT1/ROS/JNK途徑增強(qiáng)順鉑對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞殺傷活性 流式細(xì)胞結(jié)果顯示，二氫楊梅素能顯著增強(qiáng)順鉑對(duì)MDA-MB-435細(xì)胞活性氧簇（ROS）的誘導(dǎo)產(chǎn)生，但轉(zhuǎn)染SIRT1質(zhì)粒后，二氫楊梅素不能促進(jìn)ROS的產(chǎn)生。Western blot結(jié)果顯示，二氫楊梅素聯(lián)合順鉑顯著誘導(dǎo)MDAMB-435細(xì)胞JNK蛋白的磷酸化，但用ROS清除劑NAC[5]處理后，二氫楊梅素不能增強(qiáng)順鉑依賴的MDA-MB-435細(xì)胞的凋亡和JNK蛋白的磷酸化。同時(shí)，二氫楊梅素聯(lián)合順鉑能顯著誘導(dǎo)MDA-MB-435細(xì)胞Caspase-9和Caspase-3活化，而轉(zhuǎn)染SIRT1質(zhì)?；虿捎肗AC處理均能抑制這些Caspases的活化，表明二氫楊梅素可能通過SIRT1/ROS/JNK途徑增強(qiáng)順鉑對(duì)乳腺癌細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)。見圖2～3（封二）。

3 討論

二氫楊梅素提取自葡萄科蛇葡萄屬的木質(zhì)藤本植物，是一種天然黃酮類有效成分，具有抗氧化、抗血栓和抗炎作用。近期的研究發(fā)現(xiàn)二氫楊梅素還具有一定的抗腫瘤活性，能抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移[4-6]，然而其對(duì)化療藥物的協(xié)同抗乳腺癌活性至今仍很少報(bào)道。

SIRT1屬于組蛋白去乙?；傅鞍准易宄蓡T。研究表明，SIRT1的表達(dá)水平與腫瘤細(xì)胞對(duì)化療的敏感性有關(guān)，腫瘤組織SIRT1表達(dá)越高則化療的療效和患者的預(yù)后越差，因此SIRT1基因已成為腫瘤治療的一個(gè)重要靶點(diǎn)[7-9]。在SIRT1信號(hào)通路中，ROS發(fā)揮了重要作用。SIRT1能清除細(xì)胞中的ROS[10-11]，因此腫瘤細(xì)胞SIRT1高度表達(dá)能抑制化療藥物對(duì)ROS的誘導(dǎo)生成。有文獻(xiàn)表明，ROS能介導(dǎo)JNK的磷酸化，而活化的JNK能增加促凋亡蛋白的表達(dá)并抑制Bcl-2抗凋亡蛋白的功能從而誘導(dǎo)凋亡的發(fā)生[12-13]。這些研究提示腫瘤細(xì)胞中SIRT1的抑制能增加化療藥物誘導(dǎo)的ROS在腫瘤細(xì)胞中積累，而大量的ROS又通過誘導(dǎo)JNK的活化從而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡。此外，已有學(xué)者發(fā)現(xiàn)SIRT1/ROS通路介導(dǎo)順鉑對(duì)口腔鱗癌的殺傷活性[14]，然而SIRT1/ROS及其下游JNK通路是否影響順鉑對(duì)乳腺癌的抗腫瘤活性，至今仍少有報(bào)道。在本研究發(fā)現(xiàn)二氫楊梅素在乳腺癌細(xì)胞中的直接靶點(diǎn)是SIRT1蛋白，二氫楊梅素輔助治療能顯著降低腫瘤細(xì)胞SIRT1表達(dá)水平，當(dāng)在細(xì)胞中轉(zhuǎn)染SIRT1質(zhì)粒強(qiáng)制增加它的表達(dá)水平后，二氫楊梅素對(duì)順鉑的協(xié)同抗乳腺癌活性受到明顯抑制。另外，還發(fā)現(xiàn)SIRT1過表達(dá)能明顯抑制二氫楊梅素聯(lián)合順鉑對(duì)乳腺癌細(xì)胞ROS的產(chǎn)生，同時(shí)NAC（ROS清除劑）處理能抑制JNK的活化，表明二氫楊梅素發(fā)揮對(duì)順鉑協(xié)同效應(yīng)的機(jī)制可能與SIRT1/ROS/JNK途徑的變化有關(guān)。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示，二氫楊梅素對(duì)順鉑有協(xié)同抗乳腺癌效應(yīng)。其機(jī)制可能是二氫楊梅素通過下調(diào)SIRT1表達(dá)促進(jìn)順鉑對(duì)乳腺癌細(xì)胞Caspase依賴的凋亡。

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