高效液相色譜法測(cè)定車前草中大車前苷和車前苷的含量

朱冰 張勇

關(guān)鍵詞：車前草;大車前苷;車前苷;高效液相色譜

中圖分類號(hào)：R917

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

車前草藥源豐富，價(jià)格低廉，具有清熱利尿、祛痰、涼血、解毒等功效，為車前科植物車前（Planttago asiatica）或平車前（P. depressa）的干燥全草?！吨腥A人民共和國(guó)藥典》規(guī)定車前草的專屬性成分大車前苷為其主要藥用有效成分及其含量標(biāo)準(zhǔn)。大車前苷為苯乙醇苷類化合物，藥理研究表明苯乙醇苷類化合物具有利尿、抗炎、解痙等功效，與車前草的功效吻合。迄今為止，從車前草中分離鑒定的化合物還包括黃酮類、環(huán)烯醚萜類、三萜類、多糖等。黃酮類化合物是車前草中另一主要活性成分，已建立了高效液相色譜法分析車前草中槲皮素、木犀草素、黃芩素等黃酮苷元的含量。車前苷具有抗氧化、蛋白激酶抑制等活性，是從車前草中分離并鑒定的一個(gè)黃酮類化合物，但尚未見(jiàn)其含量測(cè)定的研究報(bào)道。鑒于苯乙醇苷類和黃酮類化合物對(duì)車前草質(zhì)量評(píng)價(jià)和后繼開發(fā)利用的重要性，應(yīng)建立高效液相色譜法測(cè)定車前草中大車前苷和車前苷的含量，為車前草藥材及其臨床產(chǎn)品的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供參考，為車前草的進(jìn)一步合理開發(fā)提供依據(jù)。

一、實(shí)驗(yàn)部分

1. 儀器與試劑

安捷倫1260高效液相色譜儀（Agilent Technologies，Santa Clara，CA），包括四元泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、恒溫箱和二極管陣列檢測(cè)器。

車前草購(gòu)于本地藥店，大車前苷標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自上海同田生物有限公司，車前苷標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自南京安美科技有限公司。色譜純甲醇和醋酸購(gòu)自美國(guó)Fisher公司，其他分析純?cè)噭┚?gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，水為超純水。

2.色譜條件

色譜柱：Waters Symmetry C18色譜

柱（250 mm × 4.6 mm i.d.）;預(yù)柱：菲

羅門C18 （4.0 mm×3.0 mm，Phenomenex，

Torrance，CA）。流動(dòng)相：溶劑A（0.4%醋酸水溶液）和溶劑B（甲醇），梯度洗脫過(guò)程為0～30 min，35%～45% B;流速：0.7 mL/min;柱溫：25℃;檢測(cè)波長(zhǎng)：330 nm;進(jìn)樣量：20 μL。

3.車前草提取物溶液的制備

將車前草粉碎，精密稱取樣品100.00 g至圓底燒瓶中，用100 mL 70%的乙醇85℃回流提取三次，每次2 h，合并濾液過(guò)濾后旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮成浸膏，得到7.40 g粗提物。精密稱取0.5 g 粗提物，用甲醇溶解并定容至10 mL容量瓶中，用0.45 μm濾膜過(guò)濾得供試品溶液（50.0 mg/mL）。

二、 結(jié)果與討論

1.色譜條件的選擇及優(yōu)化

大車前苷為苯乙醇苷類化合物，其紫外掃描最大吸收波長(zhǎng)為254，300sh，330 nm;車前苷為黃酮類化合物，其紫外掃描最大吸收波長(zhǎng)為285，332 nm。為了同時(shí)靈敏地檢測(cè)大車前苷和車前苷，選擇檢測(cè)波長(zhǎng)為330 nm。

在測(cè)定大車前苷和車前苷時(shí)，考慮到兩種目標(biāo)化合物為多酚類化合物，在流動(dòng)相中加入醋酸抑制酚羥基的離解。以甲醇–0.4%醋酸水、乙腈–0.4%醋酸水作為流動(dòng)相，在不同梯度洗脫程序下的HPLC譜圖發(fā)現(xiàn)，以乙腈–0.4%醋酸水作為流動(dòng)相梯度洗脫時(shí)，目標(biāo)化合物與相鄰物質(zhì)基本分開，且目標(biāo)化合物峰形對(duì)稱性高。因此，在流速為0.7 mL/min時(shí)，選用0.4%醋酸水溶液（A）和甲醇溶液（B）為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫： 0～30 min，35～45% B。色譜圖見(jiàn)下圖。通過(guò)與標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間對(duì)比分析，主要化合物1和2被鑒定為大車前苷和車前苷。

2. 方法的線性范圍與檢出限

將大車前苷和車前苷的混合對(duì)照品儲(chǔ)備液用甲醇稀釋成5個(gè)濃度系列的混合對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)工作液，在上述色譜條件下進(jìn)行HPLC分析，記錄峰面積，以對(duì)照品濃度X （μg/mL）對(duì)其峰面積的平均積分值（Y）進(jìn)行線性回歸，得回歸方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)以及檢出限（S/N =3）（表1）。結(jié)果表明：大車前苷和車前苷因在5.0～250.0 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

3. 方法的精密度、穩(wěn)定性、重現(xiàn)性和回收率

對(duì)同一混合對(duì)照品溶液重復(fù)測(cè)定6次，每次進(jìn)樣20 μL，測(cè)定峰面積，然后得大車前苷和車前苷的RSD分別為0.29 %、0.45 %，表明精密度良好;連續(xù)重復(fù)測(cè)定3天，大車前苷和車前苷峰面積的RSD分別為0.93 %、0.78 %，這說(shuō)明對(duì)照品溶液在3天內(nèi)穩(wěn)定性良好;對(duì)同批樣品分別制備混合對(duì)照品，測(cè)定大車前苷和車前苷峰面積的RSD分別為0.38 %和0.41%，這表明同批次樣品重現(xiàn)性良好。

經(jīng)過(guò)測(cè)定，取綠原酸和咖啡因含量分別為38.51 μg/mL和52.83 μg/mL的車前草溶液3份，每份各1 mL，分別加入濃度為200.00 μg/mL的混合對(duì)照品溶液1 mL，混合的2 mL溶液，分別進(jìn)樣20 μL（結(jié)果見(jiàn)表2），回收率95.31%～104.70%，說(shuō)明加標(biāo)回收率良好，準(zhǔn)確度高。

4. 樣品檢測(cè)

測(cè)定樣品3次，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出大車前苷和車前苷的含量分別為2.85 ± 0.11mg/g和3.91 ± 0.18 mg/g。

三、結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)首次建立了HPLC法同時(shí)測(cè)定車前草中車前苷和車前苷含量的方法，所建立的測(cè)定方法簡(jiǎn)便、重復(fù)性好、精密度高，為車前草的質(zhì)量控制提供了參考依據(jù)。

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