食品免疫快速檢測(cè)新方法及增敏技術(shù)研究

謝春花，柳雙，馬寧寧，游瀅瀅，張爽，宋洋

（天津師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院天津市動(dòng)植物抗性重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津300387）

食品安全問(wèn)題日益復(fù)雜，建立靈敏、高效、可現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)的免疫方法是食品快速檢測(cè)的發(fā)展趨勢(shì)。近些年來(lái)，免疫傳感器及其增敏技術(shù)、熒光免疫層析技術(shù)、可視化凝膠柱免疫檢測(cè)技術(shù)迅速發(fā)展，并應(yīng)用于食品檢測(cè)。制備可現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)的可視化便攜性小型儀器設(shè)備、研發(fā)新型標(biāo)記技術(shù)與標(biāo)記材料、探究新型分析形式是未來(lái)食品安全快速檢測(cè)的重要發(fā)展方向。本文綜述了新型免疫檢測(cè)方法以及結(jié)合納米顆粒[1]、親和素體系[2]、納米磁性材料[3]、量子點(diǎn)[4]等標(biāo)記技術(shù)達(dá)到的增敏效應(yīng)，采用仿生抗體等新型的標(biāo)記技術(shù)為食品安全快速檢測(cè)技術(shù)的研究提供文獻(xiàn)支持。

1 免疫傳感器

免疫傳感器是根據(jù)抗原（抗體）對(duì)抗體（抗原）的特異性識(shí)別而制成的[5]。它使檢測(cè)的靈敏度得到了提高，而且使用的檢測(cè)設(shè)備小且方便，測(cè)量過(guò)程自動(dòng)化，同時(shí)使分析過(guò)程簡(jiǎn)單化，從而減少了分析時(shí)間。目前已經(jīng)開始用免疫傳感器來(lái)檢測(cè)食品中的毒素和細(xì)菌、毒品和藥物的濫用、殘留的農(nóng)藥量以及脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）光纖等[6]。2013 年Yang Song等[7]利用偶聯(lián)完全抗原的自主裝芯片對(duì)水果及果汁中的亞胺硫磷進(jìn)行了痕量檢測(cè)，其檢測(cè)限達(dá)到ng/L級(jí)，檢測(cè)時(shí)間縮短為30 min，其活化的芯片可對(duì)30個(gè)樣品進(jìn)行反復(fù)測(cè)定。其研究結(jié)果與同源抗體建立的直接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫吸附（direc-competition enzyme linked immunosorbent assay，CD-ELISA）方法進(jìn)行比對(duì)，在檢測(cè)時(shí)間、靈敏度、準(zhǔn)確度方面均有提高，為表面等離子體共振（surface plasmon resonance，SPR）在食品中的快速現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)提供了一定的技術(shù)支撐。2014年Yang Lu等[8]研發(fā)了一種基于抑制形式的敏感和穩(wěn)定的SPR免疫傳感器，用于檢測(cè)奶制品和寵物食品中的三聚氰胺（melamine，MEL）。所提出的MEL方法的靈敏度和檢測(cè)限（limit of detection，LOD）分別為 2.32×10-2μg/mL和1.4×10-3μg/mL，該測(cè)定法驗(yàn)證了全奶油牛奶，脫脂奶粉，嬰兒配方奶粉，狗食和貓食中的MEL的檢測(cè)，每種樣品的檢測(cè)靈敏度分別為 2.57×10-2、2.32×10-2、2.51×10-2、2.66×10-2、2.68×10-2μg/kg，遠(yuǎn)低于 MEL 的最大殘留量（maximum residue，MRL）。該方法由于可重復(fù)使用性，高靈敏度，短檢測(cè)時(shí)間和簡(jiǎn)單的樣品制備過(guò)程等諸多優(yōu)點(diǎn)，可用于痕量殘留檢測(cè)。

但無(wú)論是SPR傳感器還是電化學(xué)傳感，都是基于物理信號(hào)輸出的分析技術(shù)，不能檢測(cè)到極小的信號(hào)的變化，并且容易受到非特異性吸附的信號(hào)干擾[9]，這就阻礙了其在超靈敏檢測(cè)中的應(yīng)用。為了提高檢測(cè)的靈敏度和準(zhǔn)確性，可以采用傳感器結(jié)合增敏技術(shù)的方法，如將免疫傳感器與納米顆粒結(jié)合，2013年Xia Sun等[10]采用納米金粒子（au nanoparticles，AuNPs）和聚苯胺/羧基化多壁碳納米管-殼聚糖納米復(fù)合物的新型多層膜構(gòu)建高靈敏度的檢測(cè)毒死蜱的免疫傳感器，用于檢測(cè)白菜，小菜，生菜和韭菜中的毒死婢，檢出限為0.06×10-6mg/mL。2014年Liu等[11]將SPR傳感器技術(shù)與與抗原特異性抗體結(jié)合的Fe3O4磁性納米粒子（magnetic nanoparticles，MNPs）分析方法相結(jié)合，開發(fā)了一種新的方法，用于大豆溴氰菊酯的直接檢測(cè)。這兩種方法的結(jié)合使檢測(cè)的靈敏度提高了4個(gè)數(shù)量級(jí)，最低可測(cè)濃度為0.01 ng/mL。2015年中國(guó)科學(xué)院電子學(xué)研究所傳感技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室的鄧紹立[12]及其團(tuán)隊(duì)以納米金為媒介將三聚氰胺（MEL）連接到SPR傳感芯片表面，優(yōu)化最佳抗體用量和再生條件，測(cè)試芯片穩(wěn)定性和方法的準(zhǔn)確性。在無(wú)污染的牛乳中添加系列質(zhì)量濃度的MEL，采用競(jìng)爭(zhēng)抑制法建立抑制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并對(duì)實(shí)際樣品進(jìn)行檢測(cè)，該方法檢測(cè)限為3.24 ng/mL，遠(yuǎn)低于國(guó)際食品法典委員會(huì)和國(guó)家有關(guān)部門規(guī)定的殘留量，同時(shí)相比于之前的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，檢測(cè)限更低。該方法在30 min內(nèi)完成樣品的前處理和檢測(cè)，適合牛乳生產(chǎn)現(xiàn)場(chǎng)快速定量檢測(cè)，而且芯片制備方法簡(jiǎn)單、造價(jià)極其低廉、無(wú)毒無(wú)污染、便于推廣、再生性能好、可多次重復(fù)使用。

同時(shí)免疫傳感器還可以與親和素相結(jié)合。生物素與親和素是自然界中親和力最強(qiáng)的化合物，其親和力可以達(dá)到1014。2013年南開大學(xué)信息技術(shù)科學(xué)學(xué)院劉儒平等[13]基于SPR傳感器的基礎(chǔ)上，通過(guò)親和素固定生物素標(biāo)記的二抗，一抗與二抗反應(yīng)固定于傳感器CM5芯片上，從而達(dá)到了對(duì)低濃度大腸桿菌ATCC25922的快速檢測(cè)，同時(shí)該方法通過(guò)一抗和二抗的質(zhì)量擴(kuò)增效應(yīng)和生物素-親和素的多級(jí)放大效應(yīng)，提高了SPR傳感器靈敏度，檢測(cè)下限為1.5×102CFU/mL，檢測(cè)時(shí)間約為35 min。利用生物素-親和素體系與抗原抗體的偶聯(lián)達(dá)到信號(hào)放大的目的，可有效降低非特異性吸附，提高檢測(cè)的信號(hào)，從而可縮短檢測(cè)時(shí)間并使得檢測(cè)限和靈敏度得到提高。

2 熒光免疫層析

熒光免疫層析技術(shù)是基于抗原抗體特異性免疫反應(yīng)的新型膜檢測(cè)技術(shù)。該技術(shù)以固定有檢測(cè)線（包被抗體或包被抗原）和質(zhì)控線（抗抗體）的條狀纖維層析材料為固定相，測(cè)試液為流動(dòng)相，熒光標(biāo)記抗體或抗原固定于連接墊，通過(guò)毛細(xì)管作用使待分析物在層析條上移動(dòng)[14-17]。對(duì)于帶有多個(gè)抗原決定簇的大分子抗原（蛋白、病毒、致病菌等），通常采用“三明治”型雙抗夾心免疫層析方法，即待測(cè)物在流動(dòng)相作用下先與熒光標(biāo)記抗體結(jié)合，當(dāng)?shù)竭_(dá)檢測(cè)線時(shí)再與包被抗體結(jié)合形成雙抗夾心的“三明治”型。對(duì)于只具有單一抗原表位的小分子抗原（農(nóng)獸藥、違禁藥物等），待測(cè)小分子抗原與熒光標(biāo)記抗體結(jié)合后，由于空間位阻作用難以再與檢測(cè)線上的包被抗體結(jié)合。所以，一般用競(jìng)爭(zhēng)免疫層析法來(lái)檢測(cè)具有單一抗原表位的小分子物質(zhì)[18]。2015年張金艷等[19]利用偶聯(lián)反應(yīng)物CdTe-抗克倫特羅抗體（CdTe-Anti clenbuterol Polyclonal，CdTe-Anti CLE pAb）作為熒光標(biāo)記物，組裝出一種用于檢測(cè)克倫特羅的熒光免疫試紙條，最低檢測(cè)限達(dá)0.5 μg/L（目前市場(chǎng)上廣泛引用的膠體金試紙條的檢出限為1.0 μg/L～3.0 μg/L），為瘦肉精市場(chǎng)監(jiān)督提供了一個(gè)新的熒光試紙條。使用量子點(diǎn)的優(yōu)勢(shì)在于量子點(diǎn)的激發(fā)光譜寬、發(fā)射光譜窄、熒光強(qiáng)度高、穩(wěn)定性強(qiáng)，生物兼容性好等特點(diǎn)，在偶聯(lián)劑的作用下，可以與抗體相連接，形成特異性的偶合物，特別是用這種偶合物作為標(biāo)記物，可以顯著降低檢測(cè)方法的檢測(cè)限。同年李靜宇等[20]采用熒光膠乳微粒為標(biāo)記物制備了克隆特羅熒光免疫層析試紙條。最佳制備條件：抗原包被濃度2.00 mg/mL，膜干燥時(shí)間5 d，混勻反應(yīng)時(shí)間1 min，反應(yīng)溫度25℃，層析時(shí)間15 min。評(píng)價(jià)結(jié)果顯示，試紙條檢測(cè)限可達(dá)0.35 μg/L。該方法在食品安全檢測(cè)應(yīng)用方面的研究已有報(bào)道，且其靈敏度是膠體金法的5倍～10倍。

2017年丁喬棋等[21]以羧基化CdTe/ZnSe量子點(diǎn)熒光微球?yàn)闃?biāo)記物，通過(guò)1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亞胺/N-羥基琥珀酰亞胺（1-Ethyl-3-（3’-dimethylaminopropyl）carbodiimide/N-Hydroxysuccinimide，EDC/NHS） 活化法將氯霉素（chloramphenicol，CAP）單克隆抗體與量子點(diǎn)熒光微球偶聯(lián)制備熒光探針。氯霉素全抗原（chloramphenicol-succinic anhydride-albumin from bovine serum，CAP-HS-BSA） 及羊抗鼠二抗分別噴涂硝酸纖維素膜，組裝成新型氯霉素量子點(diǎn)熒光微球免疫層析試紙條，建立了快速、定量檢測(cè)牛奶中CAP的方法。開發(fā)的量子點(diǎn)熒光微球試紙條可在15 min內(nèi)完成牛奶樣品中CAP的定量檢測(cè)，線性范圍為 0.10 μg/L～100.00 μg/L，檢出限為 0.1 μg/L。該試紙條在兩周內(nèi)的穩(wěn)定性良好。2017年張世偉等[22]于抗體親和位點(diǎn)保護(hù)標(biāo)記方法制備抗河鲀毒素抗體偶聯(lián)熒光微球，方法簡(jiǎn)單穩(wěn)定，所有結(jié)合分離步驟均在親和柱中完成，避免了親和位點(diǎn)被破壞而且熒光信號(hào)更強(qiáng)，將檢測(cè)靈敏度提高至原來(lái)的8倍左右。研究了熒光抗體稀釋液配方，使熒光標(biāo)記抗體一體式組裝在測(cè)試卡上6個(gè)月熒光衰減小于30%，從而使該技術(shù)能夠以測(cè)試卡的形式商品化應(yīng)用，所建立的河鲀毒素檢測(cè)方法靈敏度為18.4 ng/mL，檢測(cè)河鲀樣本的最低檢出限為10.00 μg/kg。該方法適用于熱加工樣品的檢測(cè)，該檢測(cè)過(guò)程非常迅速，所用時(shí)間僅15 min，且不需要用大型設(shè)備，為河鲀餐前速測(cè)提供了一定技術(shù)手段。

3 凝膠柱免疫可視化檢測(cè)

現(xiàn)在的檢測(cè)技術(shù)已經(jīng)越來(lái)越多，但快速、可視化、普遍、實(shí)用的技術(shù)更受歡迎，而凝膠柱免疫可視化檢測(cè)技術(shù)就可以達(dá)到這種要求。2012年Meng Yuan等[23]開發(fā)了一種基于凝膠的非儀器性免疫親和試驗(yàn)，用于快速篩查氯霉素（CAP）。免疫親和力測(cè)試柱（immunoaffinity test column，IATC）由含有抗CAP抗體偶聯(lián)凝膠的測(cè)試層和含有辣根過(guò)氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）抗體偶聯(lián)凝膠的對(duì)照層組成?；谥苯痈?jìng)爭(zhēng)性免疫反應(yīng)和辣根過(guò)氧化物酶酶促反應(yīng)，可以直觀地評(píng)估測(cè)試結(jié)果。顏色的變化可代表檢測(cè)結(jié)果。結(jié)果表明，牛奶中氯霉素最低檢測(cè)量為1 μg/L、奶粉中的氯霉素最低檢測(cè)量為6 μg/L、蜂蜜中的氯霉素最低檢測(cè)量為4 μg/L、魚和蝦中的氯霉素最低檢測(cè)量均為2 μg/L。該測(cè)定方法幾乎不需要樣品預(yù)處理，整個(gè)過(guò)程在10 min內(nèi)即可完成?；谀z的免疫親和測(cè)試是一種簡(jiǎn)單、快速且有前途的檢測(cè)方法，可用于食品樣品中CAP殘留物的可視化快速檢測(cè)且無(wú)需儀器設(shè)備。

2016年生威等[24]采用活化酯法制備恩諾沙星與辣根過(guò)氧化物酶（HRP）的偶聯(lián)物作為酶標(biāo)抗原。整個(gè)檢測(cè)在一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的1 mL固相萃取柱（solid phase extraction column，SPE）中進(jìn)行，柱中包含兩層：一個(gè)結(jié)合了恩諾沙星特異性抗體的凝膠檢測(cè)層和一個(gè)結(jié)合了HRP抗體的凝膠質(zhì)控層。將樣品提取液與酶標(biāo)抗原預(yù)混合后加入到檢測(cè)柱中，基于抗原抗體的競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合反應(yīng)和辣根過(guò)氧化物酶的酶促反應(yīng)，根據(jù)檢測(cè)柱的檢測(cè)層顏色的深淺和有無(wú)來(lái)定性半定量檢測(cè)恩諾沙星的含量。該凝膠檢測(cè)柱的檢測(cè)限為5 μg/L，整個(gè)檢測(cè)過(guò)程可以在10 min內(nèi)完成，豬肉、牛肉、雞肉、魚肉、蝦肉和牛奶等動(dòng)物源性食品中恩諾沙星檢測(cè)限為100 μg/kg。該方法具有準(zhǔn)確、靈敏、特異性好、操作簡(jiǎn)便快速、成本低等優(yōu)勢(shì)，適合動(dòng)物源性食品中恩諾沙星殘留的快速篩查。而在2017年生威等[25]又采用類似的方法半定量檢測(cè)呋喃它酮代謝物的含量。整個(gè)檢測(cè)過(guò)程可以在10 min內(nèi)完成，該凝膠檢測(cè)柱的檢測(cè)限為20 μg/L；牛肉、鯛魚、雞肉、蝦肉、豬肉、魷魚、雞肝和黃花魚等動(dòng)物源性食品中呋喃它酮代謝物的檢測(cè)限為3 μg/kg。同年齊玉杰等[26]采用活化酯法制備三聚氰胺酶標(biāo)抗原，將三聚氰胺抗體、過(guò)氧化物酶抗體分別與溴化氰活化的瓊脂糖凝膠偶聯(lián)制備相應(yīng)的抗體膠作為檢測(cè)層和質(zhì)控層，方法檢測(cè)限為200 μg/L。對(duì)牛奶、奶粉、發(fā)酵乳等乳制品進(jìn)行檢測(cè)，測(cè)得所檢樣品中三聚氰胺的檢測(cè)限為1 mg/kg。該檢測(cè)方法操作簡(jiǎn)便，結(jié)果易判斷，整個(gè)檢測(cè)過(guò)程約15 min，是三聚氰胺現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)的有效手段。

4 仿生免疫檢測(cè)

免疫檢測(cè)方法多數(shù)具有穩(wěn)定性不好的缺陷，而仿生抗體便可以解決這個(gè)難題。仿生免疫檢測(cè)是指分子印跡聚合物（molecular imprinting polymer，MIP）具有的可以特異性識(shí)別待測(cè)物質(zhì)的位點(diǎn)，與待測(cè)物質(zhì)特異性結(jié)合，類似于抗原抗體識(shí)別反應(yīng)。利用仿生免疫方法進(jìn)行分析的方法稱為仿生免疫分析。仿生抗體可以與不同的檢測(cè)方法結(jié)合，從而達(dá)到不同的效果，目前國(guó)內(nèi)外已經(jīng)有很多相關(guān)的研究。

4.1 仿生抗體用于酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)

2015年ChenShi等[27]描述了一種新的直接競(jìng)爭(zhēng)性酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定方法，其中親水印跡膜作為用于測(cè)定多農(nóng)藥殘留物的仿生抗體。使用4-（二甲氧基硫代硫代氨基）丁酸作為模板分子，直接在96孔板的表面上合成可選擇性識(shí)別敵百蟲和乙酰甲胺磷的印跡膜。該膜具有抗體樣識(shí)別能力，快速吸附-解吸動(dòng)力學(xué)和良好的穩(wěn)定性。該方法適用于蘆筍和黃瓜樣品中敵百蟲和乙酰甲胺磷的測(cè)定，其中敵百蟲的回收率為72.1%～92.0%，乙酰甲胺磷為70.0%～85.0%。該測(cè)得所取韭蔥樣品中的乙酰甲胺磷水平為（2.15±0.08）mg/kg，高于日本肯定列表系統(tǒng)的最大殘留限量（MRLs，0.1 μg/mL）。因此，應(yīng)該加大力度控制農(nóng)產(chǎn)品中的農(nóng)藥殘留。與傳統(tǒng)的酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）和色譜方法相比，該方法的操作程序更簡(jiǎn)單，并且不需要大量的儀器。由于MIP的高選擇性和不需要SPE等預(yù)處理程序，因此仿生酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法（bionic enzyme-linked immunosorbent assay，BELISA）方法的基質(zhì)效應(yīng)很小。此外，BELISA方法可以選擇性識(shí)別和檢測(cè)敵百蟲和乙酰甲胺磷，更重要的是，該方法可以重復(fù)使用超過(guò)10次并保持靈敏度。2017年Lu Li等[28]利用分子印跡聚合物（MIP）膜作為仿生抗體，開發(fā)了具有高度選擇性和高靈敏度的ELISA，可用于檢測(cè)孔雀石綠（MalachiteGreen oxalate，MG）。多巴胺的自聚合MIP膜附著在96孔微板的表面上，在水溶液中可對(duì)MG特殊識(shí)別。通過(guò)該方法建立的直接競(jìng)爭(zhēng)ELISA，靈敏度達(dá)到了10.31 μg/L，其檢出限為0.30 μg/L。通過(guò)該法對(duì)水、魚樣品進(jìn)行檢測(cè)，加標(biāo)回收率為87.8%～94.6%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于3.6%。結(jié)果說(shuō)明該方法可用于樣品的快速，準(zhǔn)確的檢測(cè)。2018年Zhang等[29]開發(fā)了基于具有特定識(shí)別的紙上分子印跡聚合物（MIPs-paper）的BELISA。BELISA的作用原理是利用3-（甲基丙烯酰氧）丙基三甲氧基硅烷（3-（methacryloxy）propyltrimethoxysilane，γ -MAPS）水解作用對(duì)紙張表面進(jìn)行改性，并通過(guò)共聚將其固定在γ-MAPS改性紙上以構(gòu)建人工抗體。通過(guò)一系列實(shí)驗(yàn)和驗(yàn)證，成功獲得了MIPs，并建立了一種基于MIPspaper的BELISA法，該法可簡(jiǎn)單有效的檢測(cè)西維因且具有成本低、準(zhǔn)備簡(jiǎn)單、準(zhǔn)備時(shí)間短、重復(fù)性好、經(jīng)濟(jì)實(shí)惠等優(yōu)點(diǎn)。該法的靈敏度和檢測(cè)限分別為0.116 mg/L和0.007 mg/L，而中國(guó)國(guó)家食品安全標(biāo)準(zhǔn)（2014）宣布食品中西維因的最高殘留限量為1 mg/kg，該方法的靈敏度和檢測(cè)限遠(yuǎn)低于國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)。基于MIPs-paper分析方法的高選擇性，該方法成功應(yīng)用于分析水稻和大白菜樣品中的西維因，并測(cè)得其添加回收率在67.2%～119%之間。該方法不僅可以為食品安全領(lǐng)域快速檢測(cè)提供技術(shù)支持，還可為西維因快速高效檢測(cè)提供便利工具。

2012年任蕾[30]以苯磺隆為模板分子，甲基丙烯酸為功能單體，乙二醇二甲基丙烯酸酯為交聯(lián)劑，采用本體聚合法在96孔酶標(biāo)板上直接合成了對(duì)苯磺隆具有高選擇識(shí)別能力的分子印跡聚合物膜，苯磺隆分子印跡聚合物膜具有較高的特異性和較快的傳質(zhì)速度。在相同的實(shí)驗(yàn)條件下，印跡聚合物膜的飽和吸附容量最高可達(dá)到非印跡聚合物膜飽和吸附容量的1.28倍。在最適條件下，所建立仿生酶聯(lián)免疫方法的靈敏度即IC50為 15.77 μg/L，最低檢出限即 IC15為 0.01 μg/L，遠(yuǎn)低于歐盟規(guī)定的苯磺隆的最大殘留限量0.05 mg/L。2015年李鴻英[31]采用本體聚合方法以3，5-二羥基-2-萘甲酸為假模板分子，甲基丙烯酸為功能單體，乙二醇二甲基丙烯酸酯為交聯(lián)劑，在酶標(biāo)板孔表面直接紫外引發(fā)合成了對(duì)桔霉素分子印跡聚合物膜，成功將分子印跡技術(shù)應(yīng)用于免疫分析中，建立了一種食品中桔霉素分子印跡仿生酶聯(lián)免疫吸附法。印跡膜飽和吸附容量達(dá)到1.07 μg/well，明顯高于非印跡聚合物膜（0.213 μg/well）。此方法被成功地應(yīng)用于米飯，玉米，米醋三種樣品中的桔霉素的分析檢測(cè)，測(cè)得米飯的最低檢出限為 40 μg/kg、玉米的最低檢出限為 60 μg/kg、米醋的最低檢出限為20 μg/kg，3個(gè)添加濃度下的回收率分別達(dá)到73.2%～89.9%，64.3%～86.2%和82.3%～92.8%。但該法也存在一定的局限性：如可供選擇的親水性功能單體比較單一，從而對(duì)生物抗體的選擇性和專一性造成了影響。2017年呂春暉等[32]在聚苯乙烯酶標(biāo)板表面直接合成對(duì)恩諾沙星具有特異性識(shí)別吸附能力的分子印跡聚合物，將其作為仿生抗體代替生物抗體，建立直接競(jìng)爭(zhēng)仿生酶聯(lián)免疫分析法（ELISA）進(jìn)行恩諾沙星的檢測(cè)。最適條件下仿生酶聯(lián)免疫方法的最低檢出限（IC15） 為 0.80 μg/L，靈敏度（IC50）為65.93 μg/L。該方法對(duì)雞肉組織和豬尿兩種樣品的添加回收實(shí)驗(yàn)中（雞肉加標(biāo)量分別為 2.5、15、75 μg/kg；豬尿加標(biāo)量分別為 5、30、150 μg/kg），有較高的回收率（雞肉：97.30%～103.56%；豬尿：94.48%～96.53%）。該仿生ELISA法準(zhǔn)確度、精密度及特異性均較高，步驟簡(jiǎn)單，與傳統(tǒng)ELISA方法相比省時(shí)經(jīng)濟(jì)，可以應(yīng)用于實(shí)際樣品中恩諾沙星殘留的快速檢測(cè)。

4.2 仿生抗體與SPR結(jié)合

2013年Gui-Hong Yao等[33]將表面等離子體共振（SPR）光譜整合并將其與表面分子印跡識(shí)別系統(tǒng)結(jié)合，同時(shí)利用磁性分子印跡聚合物即納米粒子放大SPR的響應(yīng)值，從而提高了檢測(cè)的靈敏度。磁性分子印跡聚合物是在模板毒死蜱（chlorpyrifos，CPF）的基礎(chǔ)上弱堿性水溶液中Fe3O4納米粒子（Fe3O4nanoparticles，F(xiàn)e3O4NPs）表面上的多巴胺自聚合而設(shè)計(jì)的。通過(guò)傅立葉變換紅外光譜，紫外可見吸收光譜和透射電子顯微鏡表征印跡的Fe3O4@聚多巴胺（polydopamine，PDA）納米粒子。在 0.001 μmol/L～10 μmol/L 的范圍內(nèi)，生物傳感器的SPR角度變化與毒死蜱濃度呈良好的線性關(guān)系，檢測(cè)限為0.76 nmol/L。因此，通過(guò)使用印跡Fe3O4@PDA納米粒子作為放大器可以顯著提高靈敏度，同時(shí)，印跡Fe3O4@PDA納米粒子對(duì)毒死蜱的識(shí)別能力優(yōu)于其他殺蟲劑。設(shè)計(jì)的生物傳感器具有卓越的靈敏度和選擇性以及高度的穩(wěn)定性，并對(duì)蘋果樣品進(jìn)行了測(cè)定，獲得了93%～104%的回收率，說(shuō)明該方法在實(shí)際樣品中使用具有良好的準(zhǔn)確性和實(shí)用性。2015年Mehmet等[34]通過(guò)在金片表面制備烯丙基硫醇的自組裝單層，形成用于選擇性測(cè)定牛奶中的催產(chǎn)素的分子印跡表面等離子體共振傳感器，該方法新穎且靈敏的。然后，在烯丙基硫醇修飾的芯片上進(jìn)行催產(chǎn)素（Oxytocin，OXT）印跡的聚（2-羥乙基甲基丙烯酸酯-甲基丙烯酰胺基谷氨酸）納米膜。通過(guò)傅里葉變換紅外光譜、原子力顯微鏡、橢偏儀、掃描電子顯微鏡和接觸角測(cè)量對(duì)未改性和改性表面進(jìn)行表征?；诒砻娴入x子體共振的分子印跡傳感器也成功應(yīng)用于牛奶樣品中催產(chǎn)素的測(cè)定，檢測(cè)極限為0.003 0 ng/mL。催產(chǎn)素印跡表面等離子體共振傳感器良好的重復(fù)性為以后傳感器的研究提供了參考。2018年Onac等[35]利用碳納米管包裹聚合物膜開發(fā)了用于測(cè)定三聚氰胺的表面等離子體共振的方法。它可以通過(guò)分子印跡聚合物膜測(cè)定三聚氰胺，并具有操作簡(jiǎn)單、高選擇性、高靈敏度、低成本的優(yōu)點(diǎn)。為此，開發(fā)了用于測(cè)定奶樣中三聚氰胺的分子印跡傳感器。該研究分3個(gè)階段完成。在第一階段，三聚氰胺由新一代碳納米管膜轉(zhuǎn)移，通過(guò)添加納米材料而得到改善。在第二階段，生產(chǎn)印刷的生物傳感器芯片用于測(cè)定三聚氰胺。在最后階段，制備的生物傳感器芯片被用于表面等離子體共振系統(tǒng)中三聚氰胺的測(cè)定和動(dòng)力學(xué)分析。在10 d結(jié)束時(shí)，牛奶樣品中的三聚氰胺以82.87%的效率運(yùn)輸。通過(guò)在SPR傳感器芯片的表面上制備三聚氰胺印刷聚合物納米薄膜層，以高度敏感，選擇性和簡(jiǎn)單的方式實(shí)現(xiàn)了三聚氰胺的測(cè)定。通過(guò)使用新一代碳納米管膜（碳納米管聚合物（carbon nanotube polymer，CNT/PIM），開發(fā)了納米增強(qiáng)膜，其包括高滲透性和抗污染的機(jī)械強(qiáng)度，并且實(shí)現(xiàn)膜的活性層被最小化。制備的生物傳感器具有與傳統(tǒng)分析技術(shù)相比有許多特點(diǎn)，如快速實(shí)時(shí)識(shí)別，低成本，便攜性，簡(jiǎn)單處理和樣品制備的簡(jiǎn)易性。

5 食品檢測(cè)增敏技術(shù)的發(fā)展前景

食品安全作為重要的公共衛(wèi)生問(wèn)題，受到普遍關(guān)注。食品中殘留或存在的有害物質(zhì)與人類的健康息息相關(guān)，因此高效、簡(jiǎn)單、方便、廉價(jià)、普遍性高、靈敏度高的檢測(cè)方法成為檢測(cè)食品安全的重要目標(biāo)，而新型標(biāo)記技術(shù)與標(biāo)記材料、新型分析形式是食品檢測(cè)新的發(fā)展方向。對(duì)國(guó)內(nèi)外可視化、可現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)、普遍性的食品安全檢測(cè)方法以及與之結(jié)合的增敏技術(shù)作出綜述，希望為我國(guó)食品質(zhì)量安全的快速、高效檢測(cè)技術(shù)的提高提供理論支持。

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