落地生根總黃酮提取工藝及其清除自由基作用的研究

劉德勝，劉琳琳，劉為忠

（濱州醫(yī)學(xué)院，山東 煙臺(tái) 264003）

落地生根是景天科植物落地生根Bryophyllum pinnatum(L.f.)Oken的全草及根，別名打不死、花蝴蝶等，以全草入藥，全年可采，收錄于《中華本草》；民間多用于創(chuàng)傷出血、癰疽、喉風(fēng)腫痛及中耳炎等。本研究室前期研究發(fā)現(xiàn)其提取物有增強(qiáng)小鼠免疫功能及血液凝固作用［1-2］。

落地生根中含有豐富的黃酮類物質(zhì)［3］。有研究表明，黃酮類化合物具有抗腫瘤、抗心腦血管疾病、抗炎鎮(zhèn)痛、抗氧化以及抗輻射等廣泛的藥理活性［4-8］。落地生根的藥用價(jià)值很大程度上與其含有的黃酮類成分有關(guān)。

自由基具有高度的化學(xué)反應(yīng)活性，其過(guò)多或清除過(guò)慢，都會(huì)加速機(jī)體衰老，并且會(huì)誘發(fā)多種疾病。黃酮類化合物的酚羥基可與自由基反應(yīng)，從而實(shí)現(xiàn)抗氧化作用。利用黃酮類物質(zhì)開(kāi)發(fā)自由基清除劑是目前國(guó)內(nèi)外十分關(guān)注的問(wèn)題［9］。至今尚無(wú)適宜的生產(chǎn)工藝從落地生根中提取高含有量黃酮類化合物的研究報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)采用單因素試驗(yàn)和正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)法篩選醇提取落地生根中總黃酮的最佳工藝條件及其清除OH·和O－2·能力進(jìn)行評(píng)價(jià)，為深入研究落地生根的藥理作用和質(zhì)量控制提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器和試藥

1.1 儀器及軟件 紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) (TU—1901，北京普析通用儀器有限公司)；FA1604s電子天平；超聲波清洗器 (KQ—50E型，昆山市超聲儀器有限公司)；臺(tái)式高速冷凍離心機(jī) (Biofuge Primo)；高速粉碎機(jī) (HY—0413，環(huán)亞天元機(jī)械技術(shù)有限公司)。

1.2 藥品與試劑 蘆丁對(duì)照品由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供 (批號(hào):100080-200707)；落地生根 (采自山東煙臺(tái)，經(jīng)濱州醫(yī)學(xué)院中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院劉孟安教授鑒定為景天科植物落地生根 Bryophyllum pinnatum(L.f.)Oken的全草，50℃干燥，粉碎后過(guò)60目篩，備用；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼 (純度＞96%，由阿拉丁試劑公司提供)；乙醇為分析純；水 (娃哈哈純凈水)；FeSO4、H2O2、鄰苯三酚、濃鹽酸、AlCl3、Tris等試劑等均為分析純。

2 試驗(yàn)方法

2.1 落地生根藥材總黃酮的提取 精稱落地生根粉末約0.5 g，按照1∶15的比例加入石油醚 (30～60℃)，超聲處理30 min，取出后放冷，過(guò)濾，棄去石油醚，待藥渣揮干石油醚后，加入適量的一定體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液中，超聲 (功率80 w，頻率50 kHz)輔助下設(shè)定溫度、料液比，一定時(shí)間后過(guò)濾，合并濾液至100 mL量瓶中，藥渣用一定體積分?jǐn)?shù)乙醇洗滌，2～3次，濾液合并到量瓶中，用乙醇定容，搖勻，待用。

2.2 總黃酮含有量的測(cè)定 以蘆丁為標(biāo)樣，采用文獻(xiàn)［10］所述方法測(cè)定落地生根中的總黃酮含有量；提取率(mg/g)按照每克 (g)藥材中含有的總黃酮量 (mg)計(jì)。

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備 精密稱取蘆丁對(duì)照品 (120℃干燥至恒質(zhì)量)1.4 mg，用乙醇溶解并定容至10 mL量瓶中，得質(zhì)量濃度為140.0 μg/mL的蘆丁對(duì)照品溶液。

2.2.2 顯色劑溶液的制備 精密稱取AlCl31.0 g，用水溶解并定容至100 mL量瓶中，得質(zhì)量濃度為10.0 mg/mL的顯色劑溶液。

2.2.3 測(cè)定波長(zhǎng)的選擇 精密吸取對(duì)照品溶液1 mL，供試品溶液1 mL，分別置于10 mL量瓶中，各加質(zhì)量濃度為10.0 mg/mL的AlCl3溶液0.5 mL，用乙醇定容至10 mL，放置30 min顯色后，以乙醇為空白參比液，在300～700 nm波長(zhǎng)范圍測(cè)定絡(luò)合物的吸光度，絡(luò)合物于425 nm波長(zhǎng)處有最大吸收，故測(cè)定時(shí)選用此波長(zhǎng)。

2.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 取蘆丁對(duì)照品溶液 (140.0 μg/mL)，用乙醇稀釋至質(zhì)量濃度分別為140.0、112.0、84.0、56.0、28.0、14.0 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照2.2.3項(xiàng)下樣品制備方法、于425 nm處測(cè)定吸光度，以吸光度A為縱坐標(biāo)，蘆丁質(zhì)量濃度C為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得回歸方程為A=0.0031C+0.0026(r2=0.9996)，表明在14.0～140.0 μg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，蘆丁的質(zhì)量濃度與吸光度線性關(guān)系良好。

2.2.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取同一質(zhì)量濃度蘆丁對(duì)照品溶液1.0 mL于10 mL的量瓶中，按照2.2.3項(xiàng)下樣品制備方法、于425 nm處測(cè)定吸光度，結(jié)果RSD為0.9%，表明儀器精密度良好。

2.2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取同一待測(cè)落地生根總黃酮提取液1.0 mL于10 mL的量瓶中，按照2.2.3項(xiàng)下樣品制備方法、于425 nm處測(cè)定吸光度，分別于 0、0.5、1.0、1.5、2.0 h進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果RSD為0.8%，表明供試品溶液在2.0 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 精密吸取同一待測(cè)落地生根總黃酮提取液1.0 mL各6份，置于10 mL量瓶中，按照2.2.3項(xiàng)下樣品制備方法、于425 nm處測(cè)定吸光度，結(jié)果RSD為1.2%，表明方法重復(fù)性良好。

2.2.8 加樣回收率試驗(yàn) 分別稱取落地生根粉末約0.5 g，精密稱定，平行6份，按照2.1項(xiàng)下處理方法處理后再加入一定量的蘆丁對(duì)照品，在2.2.3項(xiàng)下樣品制備方法制備樣品，在425 nm處測(cè)定吸光度，計(jì)算回收率為100.4%，RSD為2.7%。

2.2.9 樣品溶液中總黃酮的測(cè)定 精密量取樣品溶液1 mL于10 mL量瓶中，按2.2.4項(xiàng)方法進(jìn)行操作，在波長(zhǎng)425 nm處測(cè)定吸光度值，由回歸方程計(jì)算樣品中總黃酮。

2.3 單因素試驗(yàn) 選擇對(duì)總黃酮含有量有較大影響的乙醇量、料液比、超聲波輔助提取時(shí)間和提取溫度為考察因素進(jìn)行研究，每個(gè)因素的不同水平重復(fù)3次測(cè)定，取平均值。

2.3.1 料液比的篩選 0.5 g落地生根粉末，分別加入70%乙醇，40℃超聲輔助提取20 min，將料液比分別設(shè)定在1∶40、1∶50、1∶60、1∶70進(jìn)行試驗(yàn)，按照樣品制備方法制備樣品，測(cè)定吸光度，確定合適的料液比。

2.3.2 乙醇體積分?jǐn)?shù)的篩選 0.5 g落地生根粉末，40℃超聲輔助提取20 min，料液比為1∶60，分別用50%、60%、70%、80%的乙醇提取，按照樣品制備方法制備樣品，測(cè)定吸光度，確定合適的乙醇體積分?jǐn)?shù)。

2.3.3 提取時(shí)間的篩選 0.5 g落地生根粉末，40℃超聲輔助提取，料液比為1∶60，用70%的乙醇提取，選擇提取時(shí)間分別為30、60、90、120 min，按照樣品制備方法制備樣品，測(cè)定吸光度，確定合適的提取時(shí)間。

2.3.4 提取溫度的篩選 0.5 g落地生根粉末，料液比為1∶60，用70%的乙醇提取，超聲輔助提取20 min，設(shè)定提取溫度分別為50、60、70、80℃，按照樣品制備方法制備樣品，測(cè)定吸光度，確定合適的提取溫度。

2.4 正交試驗(yàn) 選用料液比、乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取溫度、提取時(shí)間4個(gè)因素、每個(gè)因素3個(gè)水平，以落地生根總黃酮含有量為考察指標(biāo)，按照L9(34)正交表 (見(jiàn)表1)設(shè)計(jì)方案進(jìn)行試驗(yàn)，優(yōu)化提取工藝。

表1 L9(34)正交試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)

2.5 優(yōu)化工藝的驗(yàn)證試驗(yàn) 為進(jìn)一步考察正交試驗(yàn)所得最佳工藝的穩(wěn)定性和合理性，按優(yōu)化工藝條件進(jìn)行試驗(yàn)，3次重復(fù)，求平均值。

2.6 落地生根總黃酮抗氧化試驗(yàn)

2.6.1 對(duì)OH·的清除能力 采用文獻(xiàn)［11］所述水楊酸捕獲法測(cè)定試樣液的清除OH·能力。

2.6.2 對(duì)超氧自由基的清除能力 采用文獻(xiàn)［12］所述鄰苯三酚自氧化法測(cè)定落地生根總黃酮清除超氧負(fù)離子的能力。

2.6.3 對(duì)有機(jī)自由基 (DPPH)的清除作用 按照文獻(xiàn)［13］所述方法測(cè)定落地生根總黃酮清除有機(jī)自由基的能力。

3 結(jié)果與分析

3.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

3.1.1 料液比對(duì)落地生根總黃酮提取率的影響 由圖1可知，隨著料液比的增大，提取效率逐漸增大，但料液比為1∶60和1∶70時(shí)相差不大，從節(jié)省提取試劑方面考慮，優(yōu)先考慮料液比為1∶60。

圖1 料液比對(duì)提取效果的影響

3.1.2 含乙醇量對(duì)落地生根總黃酮提取率的影響 由圖2可知，含乙醇量為70%時(shí)，提取效率最高。

圖2 含乙醇量對(duì)提取效果的影響

3.1.3 提取溫度對(duì)落地生根總黃酮提取率的影響 由圖3可知，提取溫度為70℃時(shí)，提取效率最高。

圖3 提取溫度對(duì)提取效果的影響

3.1.4 提取時(shí)間對(duì)落地生根總黃酮提取率的影響 由圖4可知，提取時(shí)間為120 min時(shí)，提取效率最高。

圖4 提取時(shí)間對(duì)提取效果的影響

3.2 正交試驗(yàn)結(jié)果 在單因素設(shè)計(jì)試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇對(duì)總黃酮提取率影響較大的料液比、含乙醇量、提取時(shí)間和提取溫度，并設(shè)計(jì)各因素水平，按照表1設(shè)計(jì)方案進(jìn)行試驗(yàn)，以總黃酮提取率為考察指標(biāo)，結(jié)果見(jiàn)表2；方差分析見(jiàn)表3。

表2 優(yōu)化提取條件正交試驗(yàn)結(jié)果與分析

表3 正交試驗(yàn)方差分析結(jié)果

由表2可知，4種因素對(duì)落地生根總黃酮提取的影響從大到小依次為A＞B＞D＞C，表明料液比對(duì)黃酮含有量的影響是最大的，極差分析結(jié)果表明，落地生根總黃酮的提取最佳工藝為A3B2C1D3，即料液比為1∶70、含乙醇量為70%、提取溫度為60℃、提取時(shí)間為120 min時(shí)提取效果較好。

由表2極差分析結(jié)果表明，4種因素對(duì)落地生根總黃酮提取的影響從大到小依次為A＞D＞B＞C，即料液比對(duì)黃酮含有量的影響最大，提取時(shí)間、甲醇濃度次之，提取溫度影響最小。由表3方差分析結(jié)果可知，料液比 (A)、含乙醇量 (B)、提取時(shí)間 (D)對(duì)落地生根中總黃酮含有量提取率的影響顯著，而提取溫度 (C)的影響不顯著。因此，落地生根總黃酮的提取最佳工藝為A3B2C1D3，即料液比為1∶70、含乙醇量為70%、提取溫度為60℃、提取時(shí)間為120 min時(shí)提取效果較好。

3.3 驗(yàn)證性試驗(yàn)結(jié)果 準(zhǔn)確稱取3份干燥的落地生根粉約0.5 g，按最佳工藝條件平行操作，測(cè)吸光度，根據(jù)回歸方程得出落地生根中總黃酮量，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 最佳工藝驗(yàn)證結(jié)果(n=3)

3.4 抗氧化活性試驗(yàn)結(jié)果

3.4.1 落地生根總黃酮對(duì)羥自由基的清除率 由圖5可知，落地生根中黃酮對(duì)羥自由基清除率隨濃度的增大而增高，當(dāng)質(zhì)量濃度為100.5 μg/mL時(shí)，清除率能達(dá)到96.8%。

圖5 落地生根總黃酮對(duì)羥自由基的清除率

3.4.2 落地生根總黃酮對(duì)陰負(fù)離子的清除率 由圖6可知，落地生根中黃酮對(duì)陰負(fù)離子清除率隨濃度的增大而增大，當(dāng)質(zhì)量濃度為100.5 μg/mL時(shí)，清除率能達(dá)到26.0%。

圖6 落地生根中黃酮對(duì)陰負(fù)離子的清除率

4 討論

本實(shí)驗(yàn)所建立并超聲波輔助提取落地生根總黃酮的方法是可行的。有文獻(xiàn)［14］認(rèn)為落地生根中總黃酮含有量測(cè)定應(yīng)該使用三波長(zhǎng)-分光光度法測(cè)定；但在前期研究中應(yīng)用HPLC定量測(cè)定落地生根中黃酮類成分含有量時(shí)發(fā)現(xiàn)，僅槲皮素和山柰酚兩種黃酮含有量已經(jīng)超過(guò)了文獻(xiàn)所述總黃酮含有量，所以本研究采用了先除色素及蛋白后再利用文獻(xiàn)［10］方法進(jìn)行總黃酮的定量測(cè)定。

驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)結(jié)果中，平均產(chǎn)率達(dá)到了9.35 mg/g，其中2個(gè)樣品的質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定超過(guò)9.27 mg/g，說(shuō)明本研究所建立的最佳實(shí)驗(yàn)方案是可行的。

在抗氧化性活性試驗(yàn)結(jié)果表明，落地生根總黃酮具有一定的抗氧化能力，且黃酮類化合物的添加量在實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)與其抗氧化性呈正相關(guān)。黃酮質(zhì)量濃度在100.5 μg/mL時(shí)，對(duì)羥基自由基、超氧自由基的清除作用分別為96.8%、26.0%相差較大，說(shuō)明落地生根總黃酮對(duì)不同類型的自由基清除能力不一致。

［1］徐慶榮，胡學(xué)梅，邱世翠，等.落地生根對(duì)小鼠免疫功能的影響［J］.中國(guó)臨床藥理學(xué)與治療學(xué)，2002，7(4):317-319.

［2］徐慶榮，胡營(yíng)濱.中藥落地生根對(duì)小鼠血液系統(tǒng)及免疫功能的調(diào)節(jié)作用［J］.中國(guó)臨床康復(fù)，2006，10(15):138-140.

［3］曹 宏，夏 杰，徐殿勝，等.落地生根葉中黃酮的分離與鑒定［J］.中藥材，2005，28(11):988-990.

［4］龔金炎，張 英，吳曉琴.黃酮類化合物體外抗病毒活性的研究進(jìn)展［J］.中草藥，2008，39(4):623-627.

［5］龔金炎，洪 輝，吳曉琴，等.黃酮類化合物的促氧化作用及其細(xì)胞毒性研究進(jìn)展［J］.中草藥，2008，39(12):1905-1909.

［6］龔金炎，吳曉琴，毛建衛(wèi)，等.黃酮類化合物抗抑郁作用的研究進(jìn)展［J］.中草藥，2011，42(1):195-199.

［7］楊 帆，劉艾林，杜冠華.黃酮類化合物對(duì)腫瘤多藥耐藥調(diào)節(jié)作用的研究進(jìn)展［J］.中國(guó)新藥雜志，2010，19(2):109-113.

［8］Akinsulire O R，Aibinu I E，Adenipekun T，et al.In vitro antimicrobial activity of crude extracts from plants Bryophyllum Pinnatum and Alanchoe Crenata［J］.Afr J Tradit Complement Altern Med，2007，4(3):338-344.

［9］孫國(guó)強(qiáng)，趙豐麗，劉哲瑜，等.白骨壤葉黃酮提取及抗氧化活性研究［J］.中國(guó)釀造，2010(11):95-100.

［10］馬陶陶，張群林，李 俊，等.三氯化鋁比色法測(cè)定中藥總黃酮方法的探討［J］.時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2008，19(1):54-56.

［11］鐵 梅，趙素云，馬 勇，等.富硒蛹蟲草的抗氧化活性研究［J］.分析科學(xué)學(xué)報(bào)，2009，25(3):285-289.

［12］張 娜，楊保求，王 倩，等.棗核黃酮類物質(zhì)的抗氧化性研究［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，38(35):20037-20039.

［13］周 萍，王麗萍，鄧 勵(lì)，等.西歸黃酮體外抗氧化活性的研究［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，39(3):1359-1360.

［14］慶偉霞，王 勇，姚素梅，等.三波長(zhǎng)-分光光度法測(cè)定大葉落地生根中總黃酮的含量［J］.分析實(shí)驗(yàn)室，2010，29(10):90-92.