紫色番茄花青素提取條件篩選及穩(wěn)定性分析

張艷暉， 劉 娜， 朱為民， 郭世榮

（1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院，江蘇 南京 210095；2.上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院 園藝研究所/上海市設(shè)施園藝技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 201106）

花青素（Cmthocyanin）是源于苯丙烷代謝生化途徑的多酚類化合物，屬于植物次生代謝產(chǎn)物黃酮類[1-2]，與脂溶性的胡蘿卜素共同決定花朵和果實(shí)的顏色?；ㄇ嗨貥O具營養(yǎng)和藥理價(jià)值，能清除自由基、且清除能力大于VC和蘆丁。因此，植物中花青素受到人們越來越多的關(guān)注[3-6]。

紫色番茄是番茄的一個特色品種，果肉呈紫紅色，具有獨(dú)特的外觀和較高的營養(yǎng)價(jià)值。紫色番茄不僅含有普通番茄所具有的營養(yǎng)物質(zhì)，而且富含具有強(qiáng)抗氧化能力的花青素和醛類、醇類、酮類、酯類等多種揮發(fā)性物質(zhì)[7-9]。花青素已成為紫色番茄一個重要的品質(zhì)指標(biāo)。

作者采用傳統(tǒng)的有機(jī)溶劑提取法對紫色番茄果實(shí)中花青素進(jìn)行提取，并通過單因素和正交試驗(yàn)確定其最佳提取條件，以便找到更為簡便、精確的提取方式，通過穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)測定了紫番茄花青素對光、溫度、酸堿度和一些金屬離子的反應(yīng)情況，以期為紫色番茄果實(shí)中花青素提取保存以及開發(fā)利用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料由上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院番茄課題組提供的綜合性狀較好的紫色番茄，品種編號為D15-156-15。

1.2 方法

1.2.1 花青素的提取與測定 參照Mehrtens等的方法進(jìn)行，略有改動[10-11]。在避光條件下稱取番茄果實(shí)鮮樣0.5 g，加入7 mL不同體積分?jǐn)?shù)的鹽酸甲醇溶液（A），于研缽快速研磨，并完全轉(zhuǎn)移至15 mL離心管中，于不同溫度（B）、不同時間條件下浸提（C），然后置于振蕩培養(yǎng)箱中，180 r/min振蕩，8 000離心10 min，取0.4 mL上清，加入鹽酸甲醇0.6 mL，混勻，用分光光度計(jì)分別測量提取液在波長525 nm和657 nm處的吸收值。

1.2.2 甲醇體積分?jǐn)?shù)的篩選 樣品分別用體積分?jǐn)?shù) 0、20%、40%、60%、80%、100%相同酸度的酸化甲醇于20℃條件下浸提2 h后，測定花青素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，篩選最佳甲醇體積分?jǐn)?shù)。

1.2.3 浸提溫度的篩選 利用得到的最佳甲醇體積分?jǐn)?shù)， 樣品分別在 20、30、40、50、60 ℃溫度條件下于鹽酸甲醇溶液中浸提2 h后測定花青素的相對含量，篩選最佳浸提溫度。

1.2.4 浸提時間的篩選 利用得到的最佳甲醇體積分?jǐn)?shù)和浸提溫度，樣品分別震蕩浸提1、2、4、6、8 h后測定花青素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，篩選最佳浸提時間。

1.2.5 設(shè)計(jì)正交試驗(yàn) 選擇主要影響因素甲醇體積分?jǐn)?shù)（A）、提取溫度（B）和提取時間（C）為研究對象，以花青素質(zhì)量分?jǐn)?shù)為指標(biāo)，采用三因素三水平正交試驗(yàn)優(yōu)化紫色番茄果實(shí)花青素提取條件。

1.2.6 紫番茄花青素的光穩(wěn)定性 取等量紫番茄花青素浸提液分為4個組，第1組放置于光照培養(yǎng)箱中黑暗處理、第2組置于光照培養(yǎng)箱中光照強(qiáng)度為50%（約10 000 Lx）、第3組置于光照培養(yǎng)箱中光照強(qiáng)度為 100%（約 20 000 Lx）， 測定 0、12、24、36、48 h的吸光度。第4組實(shí)驗(yàn)室自然光下進(jìn)行，夜晚不進(jìn)行補(bǔ)光處理。

1.2.7 紫番茄花青素的熱穩(wěn)定性 取等量紫番茄花青素浸提液，置于恒溫水浴鍋中，分別在0、10、20、30、40、50、60、70、80 ℃條件下保存 1 h （遮光處理），冷卻至室溫后，在最大吸收波長處測定吸光度。1.2.8 紫番茄花青素的酸堿度穩(wěn)定性 用0.1 mol/L HCl溶液和0.1 mol/L NaOH溶液分別調(diào)節(jié)浸提液 pH 1、3、5、7、9、11、13，靜置 30 min 后測吸光值。1.2.9 紫番茄花青素的金屬離子穩(wěn)定性 取等量紫番茄花青素浸提液，分別加入質(zhì)量濃度為0.5 g/L的 NaCl、CaCl2、MgCl2、ZnSO4、AlCl3、CuSO4、MnSO4溶液，放置48 h后測定吸光度。

1.3 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析 采用Excel軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和制圖，用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行正交試驗(yàn)的設(shè)計(jì)和后續(xù)數(shù)據(jù)的處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 甲醇體積分?jǐn)?shù)的篩選 將無水甲醇與蒸餾水以不同比例混勻，得到體積分?jǐn)?shù)為0、20%、40%、60%、80%、100%的甲醇溶液，用酸化的這些甲醇溶液浸提紫番茄中的花青素，結(jié)果如圖2，花青素質(zhì)量分?jǐn)?shù)整體呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢，說明加入甲醇溶劑，可明顯提高浸提效率。當(dāng)甲醇體積分?jǐn)?shù)在60%～100%之間，花青素質(zhì)量分?jǐn)?shù)下降，這說明水在花青素提取過程中也起著不可或缺的作用。綜合分析發(fā)現(xiàn)60%的甲醇浸提液效果最好，花青素質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到0.365 FW/g。

圖1 甲醇體積分?jǐn)?shù)對花青素提取的影響Fig.1 Methanol extracts of different concentrations of anthocyanin content

2.1.2 浸提溫度篩選結(jié)果 在篩選得到的體積分?jǐn)?shù)為60%的甲醇溶液中，2 h的浸提處理，由圖3可以看出花青素質(zhì)量分?jǐn)?shù)隨溫度變化非常顯著，呈現(xiàn)出先上升再下降的趨勢，在30℃時達(dá)到峰值，在20℃時，花青素質(zhì)量分?jǐn)?shù)最低，且在20～30℃之間花青素質(zhì)量分?jǐn)?shù)上升幅度很大。

圖2 溫度對花青素提取的影響Fig.2 At different temperatures anthocyanin extraction conditions

2.1.3 浸提時間篩選結(jié)果 在篩選得到的體積分?jǐn)?shù)為60%的甲醇溶液和最佳浸提溫度30℃條件下，分別采用 1、2、4、6、8 h 浸提紫色番茄勻漿，由圖4可見，花青素質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢。

圖3 時間對花青素提取的影響Fig.3 Under different circumstances time anthocyanin extraction

2.2 正交試驗(yàn)篩選結(jié)果

分析表4可以看出，在紫番茄花青素提取過程中，3個因素均達(dá)到了顯著水平，且因素影響順序?yàn)锳＞B＞C，即甲醇體積分?jǐn)?shù)對提取效果影響最大，提取時間影響最小，提取溫度影響居中。

通過分析表3，以甲醇為溶劑紫色番茄花青素提取過程中，由3個因素的均值分析得到最佳組合為 A2B2C1，即甲醇體積分?jǐn)?shù)為80%，浸提溫度為30℃，時間為2 h，花青素達(dá)到最高值。綜合考慮提取成本等各方面因素，最終選用 A2B2C1為最優(yōu)化的提取方式。

表1 紅熟期正交試驗(yàn)結(jié)果Table 1 Results of the orthogonal test in red ripe stage

表2 紅熟期方差分析Table 2 Analysis of variance in red ripe stage

2.3 花青素的穩(wěn)定性

2.3.1 光照對紫番茄花青素的影響 光處理實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4，避光條件下，花青素質(zhì)量分?jǐn)?shù)幾乎不下降，只由開始的0.402 FW/g，48 h后最終降為0.387 FW/g，降解率只有3.7%。在100%（約為20 000 Lx）強(qiáng)光照射下，花青素含量降低最多，最終降為0.321 FW/g。50%的弱光照射和實(shí)驗(yàn)室自然光處理兩條折線幾乎重合，但是自然光處理比50%的弱光處理結(jié)果變化波動性更大一些。

圖4 紫番茄花青素的光穩(wěn)定性Fig.4 Light stability of anthocyanin in purple tomato

圖5 紫番茄花青素的熱穩(wěn)定性Fig.5 Temperatures stability of anthocyanin in purple tomato

圖6 紫番茄花青素的pH穩(wěn)定性Fig.6 pH value stability of anthocyanin in purple tomato

2.3.4 金屬離子對紫番茄花青素的影響 如圖7所示，各類金屬離子也能夠影響浸提液中花青素的含量。與對照相比，Mg2+對浸提液的增色作用非常明顯，最高可達(dá)到 0.489 FW/g。 Ca2+、Al3+、Na+、Mn2+對浸提液也具有一定的增色護(hù)色作用，而Zn2+、Cu2+能夠降低花青素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，尤其是Cu2+，可使花青素質(zhì)量分?jǐn)?shù)低至0.113 FW/g。

2.3.2 溫度對紫番茄花青素的影響 溫度對花青素的影響也很顯著，除0到10℃之間花青素質(zhì)量分?jǐn)?shù)不降低以外，總體看來花青素質(zhì)量分?jǐn)?shù)與水浴溫度呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)，即隨水浴溫度的增高呈現(xiàn)出下降趨勢，且溫度越高，花青素質(zhì)量分?jǐn)?shù)降低幅度越大，溫度高于60℃以后，下降幅度尤為明顯。但是在60℃以下，尤其是低于40℃時，花青素質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化幅度很小，只從初始的0.402 FW/g降低為0.380 FW/g。

2.3.3 酸堿度對紫番茄花青素的影響 酸堿度度對花青素浸提液的影響也很大，在pH=3時，花青素質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高為0.397 FW/g，在pH=5時略微降低至 0.388 FW/g，其次是pH=1時0.381 FW/g。在pH=13時，花青素質(zhì)量分?jǐn)?shù)低至0.122 FW/g（如圖6）。

3 結(jié) 語

綜合考慮各因素對提取花青素影響的大小，以及各因素之間的交互作用等方面，選擇正交試驗(yàn)結(jié)果作為紫番茄花青素最優(yōu)提取條件，即30℃下，用80%的酸化鹽酸甲醇溶液處理2 h。

作者通過穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)光、溫度、pH值、某些金屬離子均能對花青素浸提液產(chǎn)生顯著影響。其中花青素隨著光強(qiáng)的增強(qiáng)，呈現(xiàn)出明顯的下降趨勢。這可能是因?yàn)閺?qiáng)光能夠破壞花青素的穩(wěn)定機(jī)構(gòu)，所以在花青素的提取過程中盡量避光保存。溫度對花青素的影響也很顯著，在40℃以下，花青素質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化不大，在60℃以上，花青素質(zhì)量分?jǐn)?shù)下降幅度劇增。因此，花青素的提取和存放溫度最好是在40℃以下。堿度與花青素含量呈現(xiàn)區(qū)間性，即在pH＜3，對花青素的提取有促進(jìn)作用。Mg2+、Ca2+、Al3+、Na+、Mn2+這些金屬離子對花青素的提取起到促進(jìn)作用。

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