牛奶中殘留麻保沙星的微生物學檢測方法

陳秀金， 任國艷， 許凱旋， 崔 璨，張永麗， 侯玉澤， 胥傳來， 李 根

（1.河南科技大學 食品與生物工程學院，河南 洛陽 471023；2.江南大學 食品學院，江蘇 無錫214122）

麻保沙星 （Marbofloxacin，CAS 號：115550-35-1），其化學名為 9-氟-2，3-二氫-3-甲基-10-（4-甲基-1-哌嗪）-7-氧-7H-吡啶-[3，2，1-ij][4，1，2]-苯并噁二嗪-6-羧酸，為動物專用的一種新型氟喹諾酮類抗菌藥，因抑制細菌DNA復制中所需要的拓樸異構(gòu)酶而表現(xiàn)出殺菌活性，具有抗菌譜廣、抗菌活性強、生物利用度高、毒性低、對其他抗菌物無交叉耐藥性等優(yōu)點[1-4]。然而，由于經(jīng)濟利益的驅(qū)使 ，一些養(yǎng)殖戶不合理地使用和濫用麻保沙星，如在休藥期出售和屠宰畜禽[5]，從而導致了動物性源食品中的麻保沙星殘留超標。長期食用超標的動物源性食品，易使人體內(nèi)的敏感菌產(chǎn)生耐藥性，嚴重時導致人體長期腹瀉或營養(yǎng)不良，還可能會引起皮疹、過敏性休克等不良反應(yīng)[6]。因此，建立牛奶中殘留麻保沙星的有效的檢測方法是目前的當務(wù)之急。

用于檢測麻保沙星殘留的方法有高效液相色譜法[7]、高效毛細管電泳法[8]和免疫分析法[9-11]，其中高效液相色譜法和毛細管電泳法檢測限低，但設(shè)備昂貴，不易推廣。免疫法雖然簡便快速，但抗體制備周期長。微生物法檢測樣品成本低，簡便可靠，不需要特殊設(shè)備，適用于麻保沙星殘留大量樣品的初步篩選。為了更好對麻保沙星殘留進行質(zhì)量監(jiān)控，作者選擇金黃色葡萄球菌為工作菌，建立麻保沙星在牛奶中殘留的微生物學檢測方法，為牛奶中麻保沙星殘留的檢測提供了一種簡便、可行的方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種 金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus subsp.aureus，ATCC 27217），購自中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心。

1.1.2 試驗材料 純牛奶：市售。

1.1.3 主要試劑 麻保沙星標準品：購自上海楚定分析儀器有限公司；酵母粉、蛋白胨、瓊脂粉、牛肉膏：購自深圳市科天化玻儀器有限公司。

1.1.4 麻保沙星標品貯備液的配制 準確稱取麻保沙星標準品50.0 mg，采用無菌的磷酸鹽緩沖溶液（0.05 moL/L，pH 7.2）溶解后，用 50 mL 容量瓶定容，得到質(zhì)量濃度為1 000 μg/mL麻保沙星標準品儲備液，4℃下保存2周。

1.1.5 培養(yǎng)基 培養(yǎng)基I、培養(yǎng)基II和培養(yǎng)基III按照參考文獻[12]進行配制。

1.2 儀器設(shè)備 超凈工作臺：蘇州凈化設(shè)備有限公司產(chǎn)品；生化培養(yǎng)箱：上海博迅有限公司醫(yī)療設(shè)備產(chǎn)品；水平型電子數(shù)顯搖床：上海雙旭電子有限公司產(chǎn)品。

1.3 菌懸液的制備

將實驗室保存的金黃色葡萄球菌斜面轉(zhuǎn)接到新制備的營養(yǎng)瓊脂斜面上，在37℃下恒溫培養(yǎng)20 h，完成活化過程。然后將活化過的斜面菌種用接種針接種到液體培養(yǎng)基中，振蕩混勻，同時以未接種的液體培養(yǎng)基作為空白對照，在37℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，采用可見分光光度儀測定不同培養(yǎng)時間下菌懸液在560 nm波長下的透光率，選擇透光率為20%時的菌懸液進行涂布[13]。

1.4 菌液平板的制備

試驗采用混菌雙層平板法進行抑菌試驗。首先向直徑為90 mm的平皿中加入融化的固體培養(yǎng)基II 7.0～8.0 mL，左右晃動后，放置在超凈臺上凝固；帶培養(yǎng)基完全凝固后，另取固體培養(yǎng)基II適量加熱溶化，冷卻至50℃，一般每100 mL培養(yǎng)基中加入1 mL透光率為20%的菌懸液，搖勻，在每一平皿中分別加入7.0～8.0 mL左右，左右晃動使其鋪滿平皿作為菌層。待平皿中的培養(yǎng)基完全凝固后，采用無菌操作用鑷子將滅菌的試紙片放到菌層上，對每個平皿進行標記，每個試驗做3次平行。

1.5 麻保沙星標準曲線的建立

1.5.1 基于磷酸鹽緩沖溶液的麻保沙星標準曲線繪制 采用0.05 moL/L，pH 7.2無菌磷酸鹽緩沖溶液將麻保沙星的標準貯備液稀釋為0.1，0.2，0.4，0.8，1.6 μg/mL，然后量取不同濃度的麻保沙星標準液滴加到平板的濾紙片上，每個濃度做3個平行試驗，每個濾紙片上麻保沙星的添加體積為100 μL。標記每個平板后，將其小心平移至4℃冰箱中，放置4 h，而后轉(zhuǎn)入37℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20 h。再用游標卡尺測定每個抑菌圈的直徑，計算平均值，以抑菌圈直徑的平均值為橫坐標，麻保沙星濃度的對數(shù)值為縱坐標，采用origin 8.5軟件進行線性回歸擬合，得到測定麻保沙星的標準曲線和回歸方程。

1.5.2 空白牛奶的測定 采用混菌雙層平板法進行抑菌試驗，其中濾紙片上僅添加牛奶樣品，經(jīng)培養(yǎng)后，依據(jù)平板上是否產(chǎn)生抑菌圈，判斷牛奶中是否含有抑制金黃色色葡萄球菌的抗生素（包括麻保沙星）。若平板上無抑菌圈產(chǎn)生，則可以選作空白奶樣。

1.5.3 牛奶基質(zhì)的麻保沙星標準曲線的繪制 采用空白牛奶將麻保沙星的標準貯備液稀釋為0.1，0.2，0.4，0.8，1.6 μg/mL，其他試驗步驟參照 1.5.1 方法進行，繪制牛奶基質(zhì)的麻保沙星標準曲線。1.6 添加回收試驗

從100 μg/mL的麻保沙星標品儲備液中準確移取30，60，120 μL加到一定體積奶樣中，總體積為10 mL，得到添加麻保沙星終濃度的水平分別為0.3，0.6，1.2 μg/mL， 每個濃度分別設(shè)置 3 個平行試驗，回收率按照1.5.3方法建立的標準曲線進行計算。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌懸液濃度的確定

按照1.3的方法，測定不同培養(yǎng)時間菌懸液在560 nm處透光率。隨著培養(yǎng)時間的延長，菌懸液濃度不斷增加，透光率將不斷變小。通常選擇菌懸液在560 nm波長下透光率為20%的培養(yǎng)時間。同時對透光率為20%的菌懸液涂平板，37℃下恒溫培養(yǎng)20 h，觀察菌落的生長狀態(tài)。通過抑菌試驗得出，培養(yǎng)時間為10.5 h時，菌懸液濃度可以產(chǎn)生清晰的抑菌圈。

2.2 麻保沙星對金黃色葡萄球菌的抑菌結(jié)果

按照1.5.1方法測定金黃色葡萄球菌對麻保沙星（質(zhì)量濃度：0.4 μg/mL）的敏感性，結(jié)果見圖1。

圖1 麻保沙星抑菌結(jié)果Fig.1 Inhibition result of marbofloxacin

由圖1可見，在長滿金黃色葡萄球菌的平板上，僅濾紙片的周圍形成了明顯的抑菌圈，說明麻保沙星對金黃色葡萄球菌具有抑菌作用。因此，選擇金黃色葡萄球菌作為敏感菌。

2.3 麻保沙星標準曲線的繪制

2.3.1 空白牛奶的測定結(jié)果 按照1.5.2的方法對牛奶樣品抑菌效果進行測定，結(jié)果見圖2。

圖2 空白牛奶的測定結(jié)果Fig.2 Detection result of control milk samples

由圖2可見，在濾紙片周圍沒有產(chǎn)生抑菌圈，說明牛奶中不含有對金黃色葡萄球菌有抑制作用的藥物 （包括麻保沙星），故可以選其作為空白樣品。

2.3.2 麻保沙星標準曲線的繪制 對不同麻保沙星質(zhì)量濃度按照1.5的方法進行抑菌試驗，以麻保沙星質(zhì)量濃度c對數(shù)為橫坐標，以抑菌圈直徑為縱坐標，繪制基于磷酸鹽緩沖溶液和牛奶基質(zhì)的麻保沙星標準曲線，結(jié)果見圖3。

圖3 測定麻保沙星的標準曲線Fig.3 Standard curve of marbofloxacin determination

在磷酸鹽緩沖溶液的麻保沙星標準曲線基礎(chǔ)上，建立了基于牛奶基質(zhì)的麻保沙星標準曲線。以磷酸鹽緩沖溶液和伊利純牛奶為基質(zhì)的麻保沙星標準曲線線性回歸方程分別為Y=0.053X-1.052和Y=0.061X-1.05；相關(guān)系數(shù)都在0.99以上；在抑菌圈直徑和麻保沙星質(zhì)量濃度對數(shù)之間存在著良好的線性關(guān)系，在此范圍內(nèi)測定麻保沙星的結(jié)果較接近真實值。

2.4 添加回收試驗

按照1.6方法測定添加陽性奶樣中麻保沙星含量，基于牛奶基質(zhì)麻保沙星標準曲線的回歸方程計算回收率，其中抑菌圈的直徑是減去濾紙片直徑（d=13 mm）后的數(shù)據(jù)，結(jié)果見表1和圖4。

表1 添加回收試驗結(jié)果Table 1 Result of spiked test

圖4 麻保沙星的抑菌結(jié)果Fig.4 Inhibition result of marbofloxacin in milk sample

由表1和圖4可見，作者建立的方法對牛奶中麻保沙星的平均回收率在77.3%～93.3%之間，說明該方法具有較好的可靠性。重復性試驗的變異系數(shù)在2.69%～4.05%之間，批間試驗的變異系數(shù)5.27%～7.26%變化，說明該方法批內(nèi)和批間的穩(wěn)定性較好。

3 結(jié) 語

1）作者首次選擇金黃色葡萄球菌為敏感菌種，建立了牛奶中麻保沙星殘留的微生物學檢測方法。

2）通過試驗表明，采用分光光度法不僅有效地節(jié)省了試驗時間，而且減少不同批次培養(yǎng)菌懸液造成的濃度波動，有效地保證了該方法的穩(wěn)定性。

3）試驗過程必須嚴格執(zhí)行無菌操作，盡可能地避免平板污染現(xiàn)象發(fā)生。另外，作者還研究了濾紙片上麻保沙星添加體積對結(jié)果的影響，每個濾紙片上的添加體積以100 μL為宜。在添加麻保沙星標液后，一定要將平板緩慢地平移至冰箱。

4）目前，用于檢測麻保沙星的各種儀器分析方法存在前處理復雜和檢測成本高的缺點，不適合對日常大量樣品的初篩，難以實現(xiàn)在基層的普及應(yīng)用。而作者建立的方法操作簡單、成本低和不需要前處理，完全能用于牛奶中殘留麻保沙星的初篩，并為制定其標準的檢測技術(shù)提供依據(jù)。

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