腹腔神經(jīng)叢阻滯對(duì)GK大鼠胰島素受體底物的影響

任 堯, 牛 楊, 李 軍, 葛方蘭, 楊 蕓, 李 維, 楊永芝, 文冬梅

(1. 四川師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院, 四川 成都 610101; 2. 綿陽市中心醫(yī)院 麻醉科, 四川 綿陽621000; 3. 四川大學(xué) 生物治療國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 四川 成都 610064)

隨著社會(huì)生產(chǎn)力的發(fā)展和人們物質(zhì)生活的豐富,糖尿病的患病人數(shù)逐年增加,其中2型糖尿病(NIDDM)患病人數(shù)增長迅速.胰島素抵抗(IR)和胰島細(xì)胞功能障礙導(dǎo)致的胰島素分泌不足是2型糖尿病的2個(gè)主要病理生理特點(diǎn).減輕和防治IR所致的代謝異常,是提高其療效的重要措施,因此改善IR對(duì)2型糖尿病治療具有重大意義[1].2型糖尿病的發(fā)病機(jī)制與炎癥過程密切相關(guān),炎性細(xì)胞因子對(duì)IR的發(fā)生發(fā)展具有重要作用[2-3].研究發(fā)現(xiàn)頸交感神經(jīng)阻滯(SB)能夠有效地對(duì)嚴(yán)重創(chuàng)傷動(dòng)物產(chǎn)生保護(hù)效應(yīng),其效應(yīng)主要是減少嚴(yán)重創(chuàng)傷后炎癥細(xì)胞因子的釋放[4].腹腔神經(jīng)叢作為人體最大的自主神經(jīng)叢,腹腔神經(jīng)叢阻滯(NCPB)主要用于緩解腫瘤等疾病引起的疼痛[5],是一種對(duì)內(nèi)臟病理相關(guān)的慢性腹痛有效的輔助治療手段,一旦阻滯成功,既可以減輕疼痛,又能減少阿片類藥物的用量,同時(shí)還能降低阿片類藥物相關(guān)的副作用和并發(fā)癥發(fā)生率[6].前期研究發(fā)現(xiàn),NCPB可減輕70%肝部分切除術(shù)大鼠創(chuàng)傷后IR的程度,其機(jī)制可能是其對(duì)嚴(yán)重創(chuàng)傷后全身炎癥反應(yīng)綜合癥(SIRS)的發(fā)生發(fā)展也具有抑制作用,可減少炎性細(xì)胞因子的釋放(待發(fā)表).GK大鼠是一種自發(fā)性NIDDM大鼠,是目前公認(rèn)的NIDDM模型[7-8],為了進(jìn)一步探討NCPB是否也能減輕NIDDM的IR程度,本實(shí)驗(yàn)利用GK大鼠,觀察NCPB對(duì)GK大鼠OGTT實(shí)驗(yàn)的影響,以及胰島素受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的關(guān)鍵蛋白IRS-1、IRS-2的蛋白表達(dá)及IRS-1的磷酸化情況.

1 材料與方法

1.1主要儀器和試劑Heraeus超速低溫離心機(jī)(德國),BeckmanDU640分光光度儀,Biorad電泳儀和半干轉(zhuǎn)印儀,雅培“安妥超越”血糖儀,UVP凝膠成像系統(tǒng)(美國),SANYO超低溫冰箱(日本).組織蛋白提取液(Pierce),鼠抗GAPDH單克隆抗體IgG(上海),兔抗IRS-1多克隆抗體IgG,兔抗IRS-2多克隆抗體IgG,兔抗p-IRS-1多克隆抗體IgG(SantaCruz),辣根酶標(biāo)記兔抗鼠IgG(H+L),辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(H+L),ECL顯色液(北京中杉).

1.2方法

1.2.1GK大鼠NIDDM模型構(gòu)建 健康清潔級(jí)GK雄性大鼠,3月齡,購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司(動(dòng)物證:SCXK2007-0005).高脂高糖飼料喂養(yǎng)2周,禁食和水18h后試紙法每周監(jiān)測尾靜脈空腹血糖,以空腹血糖高于9mmol/L表示糖尿病構(gòu)模成功[9].經(jīng)過2周的高脂高糖飼料(質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為:豬油18%、蛋黃3%、蔗糖20%、基礎(chǔ)飼料59%,由第三軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心配制)喂養(yǎng),所有GK大鼠尾靜脈空腹血糖濃度均高于9mmol/L.

1.2.2GK大鼠口服糖耐量實(shí)驗(yàn)(OGTT)及分組 25只NIDDM構(gòu)模成功的雄性GK大鼠,4月齡,體質(zhì)量(328.6±17.1)g,空腹血糖(13.5±2.7)mmol/L.為了解NIDDM構(gòu)模是否成功,以及GK大鼠的基礎(chǔ)狀況,隨機(jī)抽取5只GK大鼠,以“NCPB前”表示該組.先進(jìn)行OGTT實(shí)驗(yàn),然后斷頭處死采取肝組織.OGTT實(shí)驗(yàn)具體操作如下:配制500g/L葡萄糖,使用灌胃針按2g/kg體質(zhì)量灌胃,并分別于0、60和120min在乙醚麻醉下采眼眶靜脈血0.5mL,測定血糖和血清胰島素.其余20只GK大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組和NCPB組,每組10只.NCPB組給予雙側(cè)質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%利多卡因經(jīng)皮NCPB,1mL/側(cè),1次/天,而對(duì)照組以質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.9%生理鹽水替換.

1.2.3大鼠經(jīng)皮NCPB方法 參照文獻(xiàn)[10],大鼠乙醚麻醉后,確定穿刺點(diǎn):先捫及大鼠腰椎兩側(cè)橫突的尖端,然后向胸椎方向觸及到末肋,末肋根部下方的第一個(gè)骨性突起為第一腰椎橫突的尖端,即穿刺點(diǎn).乙醚麻醉后固定,針尖與水平方向垂直,先觸及橫突尖端,然后轉(zhuǎn)向椎體側(cè),調(diào)整針干與水平成70°～80°,滑過橫突尖端的外側(cè)緣繼續(xù)進(jìn)針,有突破感后停針注射.

1.3主要觀察指標(biāo)

1.3.1OGTT實(shí)驗(yàn) 在NCPB處理14和28次后,分別取對(duì)照組和NCPB組各5只GK大鼠進(jìn)行OGTT實(shí)驗(yàn).OGTT實(shí)驗(yàn)2h后斷頭處死取肝組織-80 ℃保存.血糖采用酶法檢測,血清胰島素采用放免法測定,均按操作說明進(jìn)行.

1.3.2肝組織IRS-1、IRS-2、p-IRS-1Westernblot分析 按組織總蛋白提取液使用說明分離肝組織總蛋白.采用Bradford法測定蛋白濃度.各取蛋白50μg進(jìn)行質(zhì)量分?jǐn)?shù)6%SDS-PAGE,電泳結(jié)束后半干轉(zhuǎn)印1h至PVDF膜.PVDF膜在封閉液(質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%BSA、0.01mol/LPBS)內(nèi)封閉1h,分別加入鼠抗GAPDH單克隆抗體(稀釋5 000倍)、兔抗IRS-1多克隆抗體(稀釋500倍)、兔抗IRS-2多克隆抗體(稀釋500倍)和兔抗p-IRS-1多克隆抗體(稀釋800倍),質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%孵育過夜.PBST(0.01mol/LPBS、質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.02%吐溫)洗膜3次,每次5min,再相應(yīng)加入辣根酶標(biāo)記兔抗鼠或辣根酶標(biāo)記山羊抗兔(稀釋倍數(shù)400),37 ℃孵育1h,加入ECL顯色液暗室進(jìn)行顯色反應(yīng).于UVP凝膠成像儀上成像,并分析各條帶OD值×面積(Int×mm2).

2 結(jié)果

2.1GK大鼠OGTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果OGTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1.可見對(duì)照組在0、60和120min時(shí)的血糖和血清胰島素水平與NCPB前相比相差不顯著.NCPB組在14次NCPB處理后,在0、60和120min時(shí)的血糖均顯著低于NCPB前(P<0.05或P<0.01)和對(duì)照組(P<0.01),而血清胰島素水平除120min時(shí)低于NCPB前(P<0.05)外,其余均與NCPB前和對(duì)照組相差不顯著;在28次NCPB處理后,在0、60和120min時(shí)的血糖除60min時(shí)與NCPB前相差不顯著外,其余均顯著低于NCPB前和對(duì)照組(P<0.01),血清胰島素在0和60min時(shí)與NCPB前和對(duì)照組相差不顯著,而在120min顯著低于NCPB前(P<0.01)和對(duì)照組(P<0.05).

表 1 不同治療時(shí)間對(duì)3組GK大鼠的OGTT結(jié)果的影響

注：與NCPB前相比,a表示P<0.05,b表示P<0.01;與對(duì)照組相比,c表示P<0.05,d表示P<0.01.

2.2GK大鼠肝組織IRS-1和IRS-2的蛋白表達(dá)Westernblot分析結(jié)果見圖1.通過凝膠成像分析系統(tǒng)分析,可見各樣本內(nèi)參甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)的表達(dá)量沒有顯著差別,表明各樣本上樣量是一致的.結(jié)果可見對(duì)照組肝組織IRS-1和IRS-2蛋白表達(dá)水平在14和28次NCPB時(shí)與NCPB前相差不顯著,而NCPB組與NCPB前相比均顯著增加(P<0.01),在相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)并顯著高于

1-2:對(duì)照組28、14次NCPB;3:NCPB前;4-5:NCPB組14、28次NCPB.

對(duì)照組(P<0.01)(表2).

2.3GK大鼠肝組織IRS-1絲氨酸307殘基的磷酸化水平各樣本內(nèi)參照GAPDH水平?jīng)]有顯著差別.結(jié)果可見對(duì)照組的肝組織IRS-1絲氨酸307殘基的磷酸化水平在14和28次NCPB時(shí)與NCPB前均有所上調(diào)(P<0.05),而NCPB組恰恰相反,在相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)絲氨酸307殘基的磷酸化程度均較NCPB前顯著下降(P<0.01),且均顯著低于對(duì)照組(P<0.01)(見圖2和表2).

1-2:對(duì)照組28、14次NCPB;3:NCPB前; 4-5:NCPB組14、28次NCPB.

圖 2 GK大鼠肝組織p-IRS-1 western blot分析

注：與NCPB前相比,b表示P<0.01;與對(duì)照組相比,d表示P<0.01.

3 討論

根據(jù)WHO公布的數(shù)據(jù)顯示,糖尿病特別是NIDDM及其并發(fā)癥已成為繼癌癥和心腦血管疾病之后第三大疾患,嚴(yán)重威脅著人類健康,糖尿病防治工作已成為一項(xiàng)全球亟待解決的課題.研究證實(shí),糖尿病和各種炎性因子之間必然存在著聯(lián)系[11].而炎性細(xì)胞因子與NIDDM的IR發(fā)生發(fā)展有關(guān),炎性因子濃度的增加是NIDDM的重要促進(jìn)因子,炎癥反應(yīng)是NIDDM發(fā)病的傳感器[12-13].因此,采取有效措施減少炎性細(xì)胞因子的分泌和釋放,抑制機(jī)體炎癥反應(yīng)程度,可能是防治NIDDM的重要環(huán)節(jié).

前期研究證實(shí),NCPB可通過減少70%肝部分切除術(shù)大鼠的炎性細(xì)胞因子釋放,從而減輕嚴(yán)重創(chuàng)傷后大鼠的IR程度(待發(fā)表).既然如此,那么NCPB是否也能通過抑制NIDDM機(jī)體的炎癥反應(yīng)程度,從而減緩NIDDM的IR進(jìn)程呢？為了探討NCPB對(duì)NIDDM的IR程度的影響,本實(shí)驗(yàn)觀察了NCPB前后GK大鼠OGTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果的動(dòng)態(tài)變化,結(jié)果發(fā)現(xiàn)14和28次質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%利多卡因NCPB處理后,在0、60和120 min時(shí)的血糖均不同程度地低于NCPB前和對(duì)照組,而血清胰島素水平除120 min時(shí)顯著低于NCPB前和對(duì)照組外,其余均相差不顯著,表明NCPB處理在早期可能具有降低GK大鼠的空腹血糖,并可緩解GK大鼠糖耐量受損的程度,提示NCPB處理可能減輕NIDDM的IR程度.

IR發(fā)生發(fā)展過程中,IRS是胰島素信號(hào)傳遞的重要介質(zhì),其中IRS-1和IRS-2在肝胰島素受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的作用尤為重要[14].本實(shí)驗(yàn)檢測NCPB前后的肝組織IRS-1與IRS-2蛋白表達(dá)變化,結(jié)果發(fā)現(xiàn)在14和28次NCPB處理后顯著高于NCPB前和對(duì)照組,表明NCPB治療緩解IR可能與增加了IRS-1與IRS-2表達(dá)水平有關(guān).

生理情況下,胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程需要IRS的酪氨酸磷酸化,IRS-1的酪氨酸磷酸化是胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的中心環(huán)節(jié).炎性細(xì)胞因子激活的一系列酶會(huì)導(dǎo)致IRS的絲氨酸/蘇氨酸磷酸化,可阻礙IRS正常的酪氨酸磷酸化,從而干擾胰島素信號(hào)通路的下傳,引起IR.研究發(fā)現(xiàn),TNF-α通過不同通路活化絲氨酸激酶,使IRS-1絲氨酸磷酸化,從而抑制IRS-1的酪氨酸磷酸化,絲氨酸307可能是IRS-1中JNK磷酸化的主要位點(diǎn)[15-17].通過Western blot分析發(fā)現(xiàn)對(duì)照組的肝組織IRS-1絲氨酸307殘基的磷酸化水平在14和28次質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.9%生理鹽水NCPB處理后與NCPB前均有所上調(diào),而質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%利多卡因NCPB處理后恰恰相反,在相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)絲氨酸307殘基的磷酸化程度均較顯著低于NCPB前和對(duì)照組,表明質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%利多卡因NCPB處理緩解IR可能與其抑制炎癥反應(yīng)而降低IRS-1絲氨酸磷酸化程度有關(guān).

綜上所述,我們的研究顯示了NCPB可降低GK大鼠的空腹血糖,并且能減輕GK大鼠糖耐量受損的程度,進(jìn)一步的機(jī)制探索也表明了NCPB很可能通過提高胰島素受體底物的蛋白表達(dá)和抑制其絲氨酸磷酸化,進(jìn)而對(duì)NIDDM的發(fā)病進(jìn)程起到一定的抑制作用.未來的研究希望能夠進(jìn)一步將上述研究成果聯(lián)系到NIDDM機(jī)體的炎癥反應(yīng),從而深入了解NCPB減緩NIDDM中IR進(jìn)程的具體原因.

致謝四川師范大學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)項(xiàng)目(SYJS2016007)對(duì)本文給予了資助,謹(jǐn)致謝意.

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