Box-Benhnken響應面法優(yōu)化超聲輔助提取川續(xù)斷揮發(fā)油及GC-MS分析

李 濤， 蘇 趁

(四川大學 華西藥學院， 四川 成都 610041)

川續(xù)斷為川續(xù)斷科植物川續(xù)斷Dipsacus asperoides C.Y.Cheng et T.M.Ai的干燥根，能補肝腎、強筋骨、續(xù)折傷、止崩漏等，用于治療肝腎不足、腰膝酸軟、風濕痹痛、跌撲損傷、崩漏和胎漏[1].川續(xù)斷主產(chǎn)于我國湖北、湖南、江西、廣西、云南、貴州、四川和西藏等省區(qū)[2].現(xiàn)代研究表明川續(xù)斷揮發(fā)油對金黃色葡萄球菌有較強的抑菌能力[3]，并對未孕或妊娠小鼠子宮具有顯著的抑制收縮作用，能抑制妊娠小鼠離體子宮的自發(fā)收縮頻率[4].水蒸氣蒸餾法是提取中藥揮發(fā)油的常用方法之一[5-9].現(xiàn)已報道的川續(xù)斷揮發(fā)油提取方法以乙醚為溶劑進行索氏提取，然后對乙醚提取物進行水蒸氣蒸餾，從而提取揮發(fā)油[3]；但此方法提取時間較長，且提取率較低.近年來，超聲輔助提取法已發(fā)展成為提取天然產(chǎn)物中活性成分的重要方法[10].超聲波輔助提取方法的操作簡單，能縮短提取時間，提高藥材成分的提取率，同時在提取過程中溫度升高不明顯，可抑制有效成分的揮發(fā)[11].目前，超聲輔助提取川續(xù)斷揮發(fā)油的研究未見報道.本研究采用Box-Benhnken響應面法設(shè)計優(yōu)化超聲輔助提取川續(xù)斷揮發(fā)油的最佳工藝參數(shù)，回歸擬合方程預測模型能對川續(xù)斷揮發(fā)油的超聲提取效果進行有效預測和分析，并利用GC-MS分析方法對川續(xù)斷揮發(fā)油化學成分進行解析鑒定，為川續(xù)斷揮發(fā)油的藥用研究和開發(fā)利用奠定基礎(chǔ).

1 材料與儀器

1.1藥材與試劑川續(xù)斷采自云南省大理州彌渡縣，石油醚、無水NaSO4均為分析純(成都天華化工科技有限公司).

1.2儀器QP2010Plus型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(日本島津)，瑞士MettlerToledo公司AB104-N型電子分析天平，KQ-100DA型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)，R201D-Ⅱ旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海申順生物科技有限公司)，SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長城科工貿(mào)有限公司)，GZX-DH-40X45電熱恒溫干燥箱(上海躍進醫(yī)療器械廠)，W201D恒溫水浴鍋(上海申順生物科技有限公司).

2 實驗方法

2.1川續(xù)斷揮發(fā)油提取將干燥后的藥材粉碎，過40目篩，再置干燥箱中烘干至恒重.準確稱取10g藥材粉末于具塞錐形瓶中，加入一定料液比的石油醚，密塞，超聲提取一定時間，在提取液中加入無水Na2SO4，進行抽濾，濾液倒入已知質(zhì)量為m1的圓底燒瓶中，然后在35 ℃水浴鍋中減壓濃縮至干，稱其質(zhì)量為m2.

揮發(fā)油提取率(%)=(m2-m1)/10×100%.

2.2單因素試驗

2.2.1超聲功率 本文料的單位為g，溶液的單位為mL，以石油醚為提取劑，在料液比1∶15，超聲時間30min條件下，設(shè)置超聲功率分別為60、70、80、90、100W等5個水平，每個水平進行3次平行實驗，計算每個水平下?lián)]發(fā)油平均得油率.

2.2.2超聲時間 以石油醚為提取劑，超聲功率為2.2.1中最優(yōu)水平，料液比為1∶15，設(shè)置超聲時間分別為10、20、30、40、50min等5個水平，每個水平進行3次平行實驗，計算每個水平下?lián)]發(fā)油平均得油率.

2.2.3料液比 以石油醚為提取劑，超聲功率為2.2.1中最優(yōu)水平，超聲時間為2.2.2中最優(yōu)水平，設(shè)置料液比分別為1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25 等5個水平，每個水平進行3次平行實驗，計算每個水平下?lián)]發(fā)油平均得油率.

2.3Box-Benhnken響應面法試驗根據(jù)2.2中單因素實驗結(jié)果，利用Design-Expert8.0.6Trial軟件設(shè)計超聲功率(A)、料液比(B)、超聲時間(C)等3因素3水平的Box-Benhnken試驗，以得油率為響應值.試驗設(shè)計見表1.

表 1 響應面分析因素及水平表

2.4GC-MS分析氣相色譜條件：色譜柱：Rxi-5m彈性石英毛細管柱(30m×0.25mm×0.25μm)；載氣：氦氣；進樣溫度：290 ℃；柱箱溫度(采用程序升溫方案)：柱初始溫度為50 ℃，保持5min，以10 ℃/min升至200 ℃，保持2min，再以5 ℃/min升至290 ℃，保持10min；進樣量：1μL；分流比：10∶1；柱流量：1.0mL/min；溶劑延遲時間：3min.

質(zhì)譜條件：離子源：電子轟擊離子源(EI)；離子源溫度：200 ℃；接口溫度：220 ℃；檢測電壓：0.8kV；質(zhì)量掃描范圍(m/z)：33～700amu；電子能量：70eV.

3 結(jié)果與分析

3.1單因素實驗

3.1.1超聲功率的影響 在超聲功率60、70、80、90、100W水平下?lián)]發(fā)油平均得油率分別為：1.365%、1.521%、1.868%、1.777%、1.661%.超聲波是通過空化效應破碎細胞，從而提取細胞內(nèi)的揮發(fā)油.當超聲功率達到一定值時，產(chǎn)生的空化現(xiàn)象使氣泡閉合過快，產(chǎn)生的沖擊波不能使川續(xù)斷細胞完全破碎，從而導致得油率下降[12].因此，進行響應曲面分析試驗時，超聲功率以80W為中心值.隨著超聲功率的增大，川續(xù)斷的得油率不斷升高，當超聲功率為80W時，此時得油率達到最大值，隨著超聲功率繼續(xù)增大，得油率略有降低.

3.1.2料液比的影響 在料液比1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25水平下?lián)]發(fā)油平均得油率分別為:1.251%、1.356%、1.851%、1.799%、1.8%.當料液比為1∶15時，川續(xù)斷揮發(fā)油得油率達到最大值.料液比小于1∶15時，隨著料液比的增大，得油率也隨之上升.當料液比達到1∶15時，得油率基本持平，隨著溶劑劑量的增加，得油率幾乎保持穩(wěn)定.從節(jié)約溶劑的方面考慮，進行響應曲面分析試驗時，料液比以1∶15為中心值.

3.1.3超聲時間的影響 在超聲時間10、20、30、40、50min水平下?lián)]發(fā)油平均得油率分別為：1.431%、1.46%、1.836%、1.709%、1.65%.當超聲時間達到30min時，此時得油率達到最大值，隨著超聲時間的繼續(xù)延長，得油率稍微下降.推斷其原因為隨著超聲時間的延長，導致部分揮發(fā)油結(jié)構(gòu)遭到破壞，從而使部分揮發(fā)油成分發(fā)生降解，使得川續(xù)斷揮發(fā)油提取率降低.因此，進行響應曲面分析試驗時，超聲時間以30min為中心值.

3.2響應面優(yōu)化試驗

3.2.1響應面設(shè)計方案 根據(jù)Design-Expert8.0.6Trial軟件中Box-Behnken設(shè)計響應曲面試驗,以A、B、C等3個因素為變量，以得油率為響應值，實驗設(shè)計和結(jié)果見表2.

3.2.2響應面法試驗結(jié)果分析 根據(jù)Design-Expert8.0.6Trial軟件分析數(shù)據(jù)得回歸擬合方程

得油率=-13.642+0.316×A+0.239×B+
0.080×C+2.39×10-3×AB-4.45×10-4×
AC+2.50×10-4×BC-2.16×10-3×A2-
0.014 3×B2-7.42×10-4×C2.

試驗結(jié)果顯著性和方差分析見表3,該模型F=121.54，P<0.000 1，可知該二次回歸擬合方程模型極顯著.該模型中A、B、C、AB、A2、B2、C2項是極顯著(P<0.01)，AC項是顯著(P<0.05)，BC項是不顯著(P<0.1).通過F值分析，3因素對得油率的影響大小依次為：A(F=44.76)>B(F=22.32)>C(F=13.46).失擬項值為6.52，P=0.050 9>0.05，表明失擬項不顯著，實驗誤差較小，因此該模型能對川續(xù)斷揮發(fā)油的超聲提取效果進行有效預測和分析.

表 2 Box-Benhnken響應面實驗設(shè)計和結(jié)果

表 3 試驗結(jié)果顯著性和方差分析表

注： **表示影響極顯著(P<0.01)， *表示影響顯著(P<0.05)，P<0.1是不顯著項.

實驗數(shù)據(jù)做概率與預測分析，如圖1和圖2所示.圖1數(shù)據(jù)點幾乎分布在一條直線上，符合對殘差正態(tài)概率的要求；圖2中數(shù)據(jù)點分布雜亂無章、無規(guī)律，符合殘差與預測值的要求，說明該組實驗數(shù)據(jù)正常，可以反映實驗的真實性.從表4知，模型的相關(guān)系數(shù)R2=0.993 6，表明該模型有較好擬合度；修正R2=0.985 5，表明該模型可以解釋98.55%的實驗數(shù)據(jù)變異性；預測R2= 0.913 8，與R2、修正R2相差不大，表明該模型預測值與實測值符合良好，模型具有代表性.得油率的平均值(δMean)為1.53，標準偏差(σ)和變異系數(shù)(C×V)均表示數(shù)據(jù)的離散程度：

圖 1 殘差的正態(tài)概率分布圖

項目參數(shù)項目參數(shù)σ0029R209936δMean153修正R209855C·V190預測R209138

C·V=(σ/δMean)× 100%，

C·V<15，表示實驗數(shù)據(jù)正常.

以得油率為響應值作響應曲面圖，如圖3～5所示，并分析各個因素間的顯著性和交互作用.從圖3可知，當超聲時間固定在零水平時，超聲功率和料液比的響應曲面最陡，說明兩者對川續(xù)斷揮發(fā)油提取率影響最顯著，且成二次線性關(guān)系；底部等高線呈橢圓且閉合，說明兩者交互作用顯著，且有最高點.從圖4可知，當超聲功率固定在零水平時，料液比響應曲面較陡，但是超聲時間響應曲面比較緩和，幾乎成一條直線，說明料液比對川續(xù)斷揮發(fā)油提取率更顯著，且成二次線性關(guān)系，但是超聲時間對川續(xù)斷揮發(fā)油提取率影響顯著性較差，幾乎呈一次線性關(guān)系.從圖5可知，當料液比固定在零水平時，超聲功率響應面較陡，但是超聲時間響應曲面比較緩和，相比較來說超聲功率對川續(xù)斷揮發(fā)油提取率影響更顯著.通過響應曲面圖分析可知3個因素對川續(xù)斷揮發(fā)油提取率影響性大小為：A>B>C.

圖 3 超聲功率和料液比對川續(xù)斷揮發(fā)油得油率響應曲面和等高線

圖 4 料液比和超聲時間對川續(xù)斷揮發(fā)油得油率響應曲面和等高線

圖 5 超聲功率和超聲時間對川續(xù)斷揮發(fā)油得油率響應曲面和等高線

通過Design-Expert 8.0.6 Trial軟件分析可確定最佳工藝條件為：超聲功率78.19 W,料液比1∶15.22,超聲時間33.16 min，得油率預測值為1.846%.

3.2.3模型驗證 針對實際可操作性，工藝條件修改為：超聲功率80W,料液比1∶15,超聲時間33min.在此條件下，通過3次平行實驗進行驗證，平均得油率實測值為1.869%，與預測值基本一致(預測值與實測值對比如圖6所示).從圖6可見，數(shù)據(jù)點基本上處于一條直線上，擬合方程模型的預測值與實測值差異較小，可以用于揮發(fā)油得油率預測.因此，結(jié)果表明該擬合方程模型的預測值與實測值符合良好，能有效的預測川續(xù)斷揮發(fā)油得油率，對川續(xù)斷揮發(fā)油的提取和優(yōu)化具有指導意義.

圖 6 預測值與實測值對比圖

3.3GC-MS分析按本文2.4的條件和方法對川續(xù)斷揮發(fā)油成分進行GC-MS分析，得到揮發(fā)油成分的總離子流圖，計算機通過峰面積歸一化法對總離子流圖進行解析，共檢測出53種成分，通過質(zhì)譜譜庫NIST08.LIB檢索以及人工圖譜解析鑒定了51種化合物(表5).川續(xù)斷揮發(fā)油中峰面積百分比最高的物質(zhì)為γ-谷甾醇(35.80%)，其次為豆甾醇(8.37%)、24-甲基-5-膽甾烯-3-醇(7.06%)、羊毛甾醇(6.71%)、正十五酸(3.23%)、正四十四烷(3.13%)、4α,14-二甲基-9β,19-環(huán)-5α-麥角甾-24(28)-烯-3β-醇乙酸酯(3.00%)、4-膽甾烯-3β-醇(2.29%)、羽扁豆醇(2.27%)、四十三烷(2.10%)、Z-7-十四碳烯醛(2.09%)、熊果-12-烯-28-醛(2.07%)、11,14-二十碳二烯酸甲酯(1.96%)、正二十一烷(1.96%)、2,6,10,15-四甲基十七烷(1.92%)、11-癸基二十四烷(1.74%)、溴化金合歡酯(1.62%)、1-氯二十七烷(1.11%)、1-氯二十碳烷(1.08%).

續(xù)表5

峰號保留時間/min名稱分子式相對分子質(zhì)量峰面積百分比/%3440215法呢醇C15H26O2220763541178正四十四烷C44H906183133642874正二十一烷C21H442961963744853四十三烷C43H886042103845044棕櫚酸-3-溴-2-丙炔酯C19H33BrO23720933945512膽甾烯基豆蔻酸酯C41H72O259607440472031-氯二十七烷C27H55Cl414111414879724-甲基-5-膽甾烯-3-醇C28H48O4007064249699豆甾醇C29H48O41283743499981-碘四十八烷C48H97I8000814451493γ-谷甾醇C29H50O41435804551951溴化金合歡酯C15H25Br28416246523494α，14-二甲基-9β，19-環(huán)-5α-麥角甾-24(28)-烯-3β-醇乙酸酯C32H52O246830047527881-氯二十碳烷C20H41Cl3161084853693羊毛甾醇C30H50O42667149551484-膽甾烯-3β-醇C32H52O24682295056321羽扁豆醇C30H50O4262275161751熊果-12-烯-28-醛C30H48O424207

4 結(jié)論

本研究采用Box-Benhnken響應面法設(shè)計優(yōu)化超聲輔助提取川續(xù)斷揮發(fā)油的最佳工藝參數(shù)，回歸擬合方程預測模型能對川續(xù)斷揮發(fā)油的超聲提取效果進行有效預測和分析，超聲輔助提取川續(xù)斷揮發(fā)油的最佳工藝參數(shù)為：超聲功率80 W,料液比1∶15,超聲時間33 min.模型驗證實驗平均得油率實測值為1.869%，與預測值1.846%基本一致，表明該實驗方法具有可行性，分析結(jié)果可靠，為川續(xù)斷揮發(fā)油工業(yè)化提取提供理論依據(jù).

通過GC-MS分析超聲輔助提取得到的揮發(fā)油，共檢測到53種成分，并鑒定出51種化合物，鑒定率為96.23%.其中醇類的相對含量最大，烴類物質(zhì)種類最多，相對含量較大的化學成分是γ-谷甾醇(35.80%)，其次為豆甾醇(8.37%)、24-甲基-5-膽甾烯-3-醇(7.06%)、羊毛甾醇(6.71%)等.其中，γ-谷甾醇是β-谷甾醇的C24位異構(gòu)體，具有降血糖作用和抗癌活性[13]；豆甾醇具有抗腫瘤、降低血液膽固醇、抗氧化、抗炎和對學習記憶的改善等藥理作用[14]；羊毛甾醇可以逆轉(zhuǎn)晶狀體內(nèi)蛋白質(zhì)的聚集，減輕白內(nèi)障的嚴重程度，提高晶狀體的清晰度[15].

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