CREB和ERK1/2在CaMKⅡδ調(diào)控破骨細(xì)胞分化中的作用

王紅美，董偉，戚孟春，馮曉潔，陸大壯，李任，孫紅

許多骨過度吸收性疾病與破骨細(xì)胞活性異常關(guān)系密切[1]。破骨細(xì)胞分化依賴于核因子-κB受體活化因子配體(RANKL)及其下游的核因子-κB(NF-κB)、細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2(ERK1/2)、cAMP反應(yīng)原件結(jié)合蛋白(CREB)、Ca2+等一系列信號的調(diào)控[2-3]；其中，Ca2+-鈣調(diào)蛋白-活化T細(xì)胞核因子c1(NFATc1)信號軸對破骨細(xì)胞分化至關(guān)重要[4-5]，而鈣調(diào)蛋白依賴性激酶(CaMK)Ⅱ即為其中傳遞鈣信號的關(guān)鍵分子。研究發(fā)現(xiàn)，在CaMKⅡ的4個異構(gòu)體(α、β、γ、δ)中，CaMKⅡδ在破骨細(xì)胞分化不同階段呈持續(xù)性高表達(dá)[6-7]，提示其作用比較關(guān)鍵，但CaMKⅡδ對破骨細(xì)胞分化的作用及涉及的信號分子目前仍不十分清楚。本研究通過構(gòu)建CaMKⅡδ慢病毒干擾載體，探索其對CREB、ERK1/2蛋白活性的影響，以揭示CaMKⅡδ調(diào)控破骨細(xì)胞分化的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞和主要試劑 小鼠白血病單核巨噬細(xì)胞株RAW264.7細(xì)胞(中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細(xì)胞庫，中國)；RANKL及胎牛血清(Biovision，美國)；DMEM培養(yǎng)基(Hyclone，美國)；抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate-resistant acid phosphotase，TRAP)染色試劑盒(Sigma，美國)；兔抗鼠ERK1/2(稀釋度為1∶2000)、CREB抗體(稀釋度為1∶1000)(Cell Signaling Techonlogy，英國)；兔抗鼠CaMKⅡδ(稀釋度為1∶2000)、NFATc1多克隆抗體(稀釋度為1∶2000)(Abcam，英國)；羊抗兔辣根過氧化物酶標(biāo)記IgG(稀釋度為1∶5000，武漢博士德生物科技有限公司)；SYBR PremixExTaqTM(TaKaRa，日本)；PCR引物(Invitrogen，美國)。

1.2 CaMKⅡδ干擾載體干擾效率的測定 前期研究成功構(gòu)建了重組慢病毒CaMKⅡδ RNA干擾載體并轉(zhuǎn)染RAW264.7細(xì)胞，最佳感染復(fù)數(shù)(MOI)為30，轉(zhuǎn)染效率達(dá)78.0%[8]。將RAW264.7細(xì)胞分為3組：對照組(僅用RANKL誘導(dǎo))、陰性載體組(轉(zhuǎn)染陰性載體，并用RANKL誘導(dǎo))和干擾組(轉(zhuǎn)染干擾載體，并用RANKL誘導(dǎo))；病毒轉(zhuǎn)染12h后，更換新鮮培養(yǎng)基；3d后加入50ng/ml RANKL誘導(dǎo)破骨細(xì)胞分化；于RANKL誘導(dǎo)5d后收獲細(xì)胞，進(jìn)行相關(guān)檢測。

1.2.1 Real-time PCR檢測各組CaMKⅡδ mRNA相對表達(dá)水平 Trizol法提取細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA；于Rotor-Gene3000熒光定量PCR儀上進(jìn)行檢測。CaMKⅡδ引物為上游5′-CAGTGGAGCTGTCT GTCGヰ-3′，下游5′-GCAGACTACCACGCAACTCA-3′(409bp)；內(nèi)參β-actin(NM_007393.3)引物為上游5′-GTTGGAGCAAACATCCCCCA-3′，下游5′-CGCGACCATCCTCCTCTTAG-3′(186bp)。反應(yīng)條件：95℃ 30s；95℃ 15s、55℃ 20s、72℃ 20s，共40個循環(huán)。通過Rotor-Gene軟件自動計(jì)算目的基因mRNA相對表達(dá)水平，每組實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個復(fù)孔，并重復(fù)3次。

1.2.2 Western blotting檢測各組CaMKⅡδ蛋白相對表達(dá)水平 采用RIPA法在冰上裂解各組細(xì)胞，經(jīng)低溫高速離心提取各組細(xì)胞總蛋白，用Bradford法測定蛋白濃度；以50μg為蛋白上樣量，按4∶1的比例加入5×上樣緩沖液，煮沸變性、電泳并轉(zhuǎn)膜；5%BSA室溫封閉后加兔抗鼠一抗4℃孵育過夜，羊抗兔二抗孵育40～60min，ECL顯色儀上顯色1min，以β-actin作內(nèi)參照。Image J軟件檢測膜上蛋白條帶灰度值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。以目的基因的灰度值與內(nèi)參β-actin灰度值的比值表示蛋白表達(dá)水平。

1.3 CaMKⅡδ RNA干擾對ERK1/2、CREB蛋白活性的影響 RAW264.7細(xì)胞分為陰性載體組和干擾組。病毒轉(zhuǎn)染細(xì)胞3d后，加入50ng/ml RANKL誘導(dǎo)其向破骨細(xì)胞分化，并于誘導(dǎo)第0、5、10、15、30、60min收獲細(xì)胞，Western blotting檢測ERK1/2蛋白磷酸化水平，方法同1.2.2；于誘導(dǎo)第0、1、3、6、12、24h收獲細(xì)胞，檢測CREB蛋白磷酸化水平。

1.4 ERK1/2信號阻斷對NFATc1基因表達(dá)的影響 RAW264.7細(xì)胞分為對照組和ERK1/2抑制劑(PD98059)組。細(xì)胞貼壁24h后，兩組細(xì)胞加入50ng/ml RANKL進(jìn)行誘導(dǎo)，ERK1/2抑制劑組同時加入20μg/ml PD98059以特異性阻斷ERK1/2信號。3d后收獲細(xì)胞，Western blotting檢測NFATc1蛋白水平。

1.5 ERK1/2信號阻斷對破骨細(xì)胞分化、功能的影響 RAW264.7細(xì)胞按照1×103個/cm2制備細(xì)胞爬片，細(xì)胞分組及處理同1.4。于RANKL處理5d后收獲細(xì)胞。按TRAP染色試劑盒說明進(jìn)行TRAP染色，于光學(xué)顯微鏡下隨機(jī)選取6個視野拍照記錄，計(jì)算每視野中TRAP陽性多核破骨細(xì)胞(細(xì)胞核≥3個)的數(shù)目，每組檢測5個細(xì)胞爬片[8]。骨吸收功能檢測：制備新鮮牛骨骨密質(zhì)磨片(厚約0.2mm)，滅菌后將細(xì)胞以2×104個/cm2接種其上。兩組細(xì)胞實(shí)驗(yàn)處理5d后收獲骨磨片，掃描電鏡(SEM)觀察。500倍下隨機(jī)選取6個視野觀察吸收陷窩，應(yīng)用圖像分析軟件Med 6.0測量吸收陷窩的數(shù)目和面積總和，每組檢測5個磨片[8]。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。定量資料以表示，實(shí)驗(yàn)1.2～1.3中數(shù)據(jù)采用單因素方差分析，實(shí)驗(yàn)1.4～1.5中數(shù)據(jù)采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)　果

2.1 CaMKⅡδ慢病毒載體干擾效率測定 Realtime PCR檢測結(jié)果顯示，陰性載體組CaMKⅡδ mRNA相對表達(dá)水平(0.916±0.111)與對照組(1.378±0.570)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而干擾組CaMKⅡδ mRNA相對表達(dá)水平(0.314±0.162)明顯低于陰性載體組和對照組(P＜0.01)，干擾組mRNA干擾效率為77.2%(圖1)。

圖1 Real-time PCR檢測各組細(xì)胞CaMKⅡδ mRNA表達(dá)水平(n=3)Fig. 1 Quantitative analysis of mRNA level of CaMKⅡδ by Real-time PCR (n=3)

Western blotting檢測結(jié)果顯示，對照組CaMKⅡδ蛋白相對表達(dá)水平(1.058±0.571)與陰性載體組(1.003±0.122)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而干擾組中CaMKⅡδ蛋白水平(0.321±0.041)較對照組下降了70.2%(P＜0.01)，即蛋白干擾效率為70.2%(圖2)。

圖2 Western bloはing檢測各組細(xì)胞CaMKⅡδ蛋白表達(dá)水平Fig. 2 Detection of CaMKⅡδ protein level (Western bloはing)

2.2 CaMKⅡδ RNA干擾對CREB蛋白活性的影響

Western blotting檢測結(jié)果顯示，兩組細(xì)胞p-CREB水平均從0～3h逐漸升高，然后逐漸下降，至24h達(dá)到最低水平。陰性載體組在0、1、3、6、12、24h的p-CREB水平分別為0.89±0.08、1.11±0.27、1.21±0.18、0.84±0.06、0.76±0.06和0.71±0.06，而干擾組則分別為：0.70±0.11、0.85±0.13、0.91±0.03、0.64±0.01、0.45±0.03和0.32±0.05；除6h外，干擾組各時間點(diǎn)p-CREB化水平均明顯低于陰性載體組(P＜0.05，圖3)，下調(diào)幅度為21%～55%。

2.3 CaMKⅡδ RNA干擾對ERK1/2蛋白活性的影響 Western blotting檢測結(jié)果顯示，兩組細(xì)胞在RANKL誘導(dǎo)后，p-ERK1/2水平逐漸升高，10min達(dá)到最高水平，然后逐漸下降。陰性載體組在0、5、10、15、30、60min的p-ERK1/2水平分別為0.83±0.0.14、1.28±0.23、1.41±0.31、1.16±0.23、0.86±0.17和0.71±0.21，而干擾組分別為0.66±0.09、0.92±0.08、1.13±0.19、0.76±0.11、0.68±0.16和0.43±0.14；除30、60min外，干擾組各時間點(diǎn)p-ERK1/2水平均明顯低于陰性載體組(P＜0.05，圖4)，下降幅度為55%～64%。

圖3 兩組細(xì)胞各時間點(diǎn)p-CREB表達(dá)水平比較(Western blotting，n=3)Fig. 3 Comparison of p-CREB level between two groups at each time point (Western blotting, n=3)

圖4 兩組細(xì)胞各時間點(diǎn)p-ERK1/2水平比較(Western blotting，n=3)Fig. 4 Comparison of p-ERK1/2 level between two groups at each time point (Western blotting, n=3)

2.4 ERK1/2信號阻斷對NFATc1基因表達(dá)的影響

Western blotting檢測結(jié)果顯示，ERK1/2抑制劑組NFATc1蛋白表達(dá)水平(1.53±0.27)明顯低于對照組(2.29±0.08，P＜0.05)，下降了33.2%(圖5)。

圖5 Western blotting檢測兩組細(xì)胞NFATc1蛋白水平Fig. 5 Detection of NFATc1 protein levels in two groups(Western blotting)

2.5 ERK1/2信號阻斷對破骨細(xì)胞分化、功能的影響 TRAP染色可見兩組細(xì)胞中均形成了TRAP陽性多核破骨細(xì)胞(圖6A)；定量分析顯示，ERK1/2抑制劑組中破骨細(xì)胞數(shù)目為9.7±1.5，較對照組的16.0±1.0下降了39.3%(P＜0.01)。

掃描電鏡(SEM)觀察可見兩組細(xì)胞中均有骨吸收陷窩形成(圖6B)；定量分析顯示，ERK1/2抑制劑組骨吸收陷窩數(shù)目及面積分別為7.3±1.5和5463.0±885.1μm2，均明顯低于對照組的14.3±2.3和11447.0±710.4μm2(P＜0.05，P＜0.01)，分別下降了50.0%和52.3%。上述結(jié)果提示，ERK1/2信號阻斷能夠顯著抑制破骨細(xì)胞生成及骨吸收功能。

圖6 兩組破骨細(xì)胞生成及骨吸收陷窩檢測Fig. 6 Detection of osteoclast formation and bone resorption lacunae on bovine cortical bone

3 討　論

Ca2+信號在調(diào)控破骨細(xì)胞分化、成熟、凋亡等方面發(fā)揮著重要作用[9]。RANKL作為破骨細(xì)胞分化的關(guān)鍵刺激因子，與受體RANK結(jié)合后，可使破骨細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平上升并誘發(fā)Ca2+低水平持續(xù)震蕩，進(jìn)而激活Ca2+-鈣調(diào)蛋白-NFATc1信號通路[4-5]，通過鈣調(diào)蛋白依賴性激酶(CaMKs)以及鈣調(diào)磷酸酶(calcineurin)使NFATc1活化并核異位，調(diào)控相關(guān)基因表達(dá)，影響破骨細(xì)胞分化及生成[4-5,10]。

CaMKs是Ca2+-鈣調(diào)蛋白-NFATc1信號系統(tǒng)的重要中間分子，包括Ⅰ、Ⅱ和Ⅳ三種亞型[11]。國外學(xué)者發(fā)現(xiàn)，CaMKⅣ可通過CREB而發(fā)揮對破骨細(xì)胞的調(diào)控作用，但阻斷CaMKⅣ-CREB信號并不能完全阻斷破骨細(xì)胞生成[12]，提示CaMKs其他亞型也可能發(fā)揮著作用。國外學(xué)者及本課題組前期研究顯示，CaMKⅡδ的mRNA和蛋白表達(dá)水平在破骨細(xì)胞分化過程中呈時間依賴性增強(qiáng)，提示其作用可能極其關(guān)鍵[6-7]；本課題組進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，CaMKⅡδ RNA干擾可顯著下調(diào)破骨細(xì)胞分化過程中NFATc1、TRAP、c-Src基因表達(dá)，并抑制破骨細(xì)胞分化，從而證實(shí)CaMKⅡδ對破骨細(xì)胞分化發(fā)揮著關(guān)鍵的調(diào)控作用[8]。

CREB是CaMKs下游重要的信號分子，參與破骨細(xì)胞分化的早期調(diào)控[12]。CREB被活化后，可進(jìn)入胞核并與NFATc1基因啟動子結(jié)合，參與NFATc1基因表達(dá)的調(diào)控；另一方面，CREB還參與c-fos的活化，而c-fos活化是NFATc1及其下游因子TRAP、基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)、DC-STAMP(dendritic cell-specific transmembrane protein)等破骨細(xì)胞分化相關(guān)基因表達(dá)的前提條件[13-14]。CREB能被CaMKⅣ活化，但CaMKⅣ RNA干擾并未完全阻斷CREB的磷酸化，提示CREB還受其他CaMKs的活化調(diào)控。本研究針對CaMKⅡδ進(jìn)行RNA干擾，發(fā)現(xiàn)在RANKL誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞向破骨細(xì)胞分化的0、1、3、6、12、24h中，除6h外，其余各時間點(diǎn)干擾組CREB磷酸化水平均顯著低于陰性載體組，下降幅度為21%～55%，提示CREB是CaMKⅡδ下游的信號分子，CaMKⅡδ基因沉默可明顯抑制CREB蛋白活化，CREB可能參與了CaMKⅡδ對破骨細(xì)胞分化的調(diào)控。

ERK1/2是絲裂原活化蛋白激酶MAPKs家族激酶中的一員，主要起到信號傳遞作用，能誘發(fā)一系列不同的胞內(nèi)反應(yīng)[15]。ERK1/2的活化(磷酸化)對破骨細(xì)胞生存至關(guān)重要。RANKL可誘發(fā)ERK1/2磷酸化，并在整合素β3的作用下使其磷酸化水平進(jìn)一步增強(qiáng)[3,16]；同時，ERK1/2的磷酸化可使c-fos活化，進(jìn)而使c-fos和c-jun結(jié)合形成AP-1復(fù)合體，進(jìn)入胞核內(nèi)調(diào)控NFATc1表達(dá)及破骨細(xì)胞分化[17]。研究顯示，CaMKs共同抑制劑KN93能夠劑量依賴性地抑制RANKL誘發(fā)的ERK1/2磷酸化，而CAMKⅠ、Ⅳ的抑制劑KN92對ERK1/2磷酸化的抑制作用甚微[18-19]，提示ERK1/2的磷酸化依賴于CaMKⅡ，且與MEK-ERK信號通路的激活有關(guān)。

為了驗(yàn)證CaMKⅡδ是否參與ERK1/2的活化調(diào)控，本研究探討了CaMKⅡδ RNA干擾對ERK1/2磷酸化的影響，結(jié)果提示CaMKⅡδ基因沉默可顯著抑制ERK1/2蛋白活化，CaMKⅡδ干擾可使ERK1/2磷酸化水平明顯降低，下調(diào)幅度達(dá)55%～64%，從而證實(shí)ERK1/2是受CaMKⅡδ調(diào)控的重要下游信號分子。為了進(jìn)一步證實(shí)ERK1/2在破骨細(xì)胞分化中的作用，本研究應(yīng)用ERK1/2抑制劑處理細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)阻斷ERK1/2信號可明顯降低NFATc1蛋白表達(dá)水平，并明顯抑制破骨細(xì)胞生成及其骨吸收功能，從而證實(shí)了ERK1/2信號對破骨細(xì)胞分化的重要調(diào)節(jié)作用。

綜上，本研究結(jié)果表明，CaMKⅡδ RNA干擾可明顯下調(diào)CREB和ERK1/2磷酸化水平，CREB和ERK1/2介導(dǎo)了CaMKⅡδ對破骨細(xì)胞分化的調(diào)控。但需要指出的是，除ERK1/2外，MAPKs家族其他成員如c-Jun氨基末端激酶1/2/3(JNK1/2/3)、p38等是否參與了CaMKⅡδ對破骨細(xì)胞分化的調(diào)控，仍有待進(jìn)一步研究。

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