扶正化瘀方對非酒精性脂肪性肝病大鼠肝纖維化及ACEAng Ⅱ-AT1R軸的影響

霍苗苗，程變巧，林偉國，吳旭瑋

非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)的病理過程包括單純性脂肪肝、脂肪性肝炎、肝纖維化和肝硬化等，其中肝纖維化是NAFLD發(fā)展中的關(guān)鍵階段，是向肝硬化發(fā)展的重要病理過程，目前其發(fā)病機制尚不明確。腎素血管緊張素系統(tǒng)(renin-angiotensin system，RAS)是人體內(nèi)重要的體液調(diào)節(jié)系統(tǒng)，不僅對調(diào)節(jié)全身血液循環(huán)起重要作用，還參與組織細胞炎癥和纖維化的調(diào)節(jié)；研究發(fā)現(xiàn)肝臟亦存在局部RAS，以旁分泌、自分泌的方式發(fā)揮作用，尤其是其經(jīng)典途徑——腎素血管緊張素轉(zhuǎn)換酶-血管緊張素Ⅱ-血管緊張素Ⅱ 1型受體(angiotensin-converting enzyme-angiotensinⅡ-angiotensin Ⅱ type 1 receptor，ACE-AngⅡ-AT1R)軸與肝纖維化病理生理過程密切相關(guān)，可能是抗肝纖維化治療的潛在靶點[1]。扶正化瘀方(Fuzhenghuayu decoction，F(xiàn)ZHY)是以中醫(yī)理論為指導，根據(jù)肝纖維化中醫(yī)病機特點，經(jīng)多年臨床科研實踐研制開發(fā)的抗肝纖維化藥物。前期研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ZHY可調(diào)節(jié)肝臟脂質(zhì)代謝，調(diào)節(jié)炎癥及與纖維化相關(guān)的基因表達，阻止非酒精性脂肪性肝纖維化的進展[2]。本研究著眼于肝組織せS系統(tǒng)，觀察FZHY對于NAFLD大鼠ACE-AngⅡ-AT1R軸乃至肝纖維化的影響，以進一步探索FZHY減緩肝纖維化進展的作用機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器 FZHY藥物組成同扶正化瘀膠囊，扶正化瘀膠囊購自上海黃海制藥有限責任公司(批號Z20020074)，抗α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)抗體及抗AT1R抗體購自英國Abcam公司，抗ACE抗體購自美國Thermo Scientific公司，免疫組化試劑盒及DAB顯色試劑盒購自北京中杉金橋公司，Trizol、RNA酶抑制劑、M-MLV(moloney murine leukemia virus)反轉(zhuǎn)錄酶、TaqDNA聚合酶購自日本TaKaRa公司，AngⅡ放免試劑盒購自北京北方生物技術(shù)研究所；引物序列由上海生物工程公司設(shè)計并合成。熒光定量PCR擴增儀(美國ABI 公司)；Image-Pro plus6.0圖像分析系統(tǒng)(美國Media Cybernetics公司)。

1.2 實驗分組及標本采集 實驗用清潔級SD雄性大鼠(150±20g，上海斯萊克實驗動物有限公司)40只，正常飼養(yǎng)1周后，隨機分為正常對照組、模型組、FZHY低劑量干預(yù)組(低劑量組)和FZHY高劑量干預(yù)組(高劑量組)，每組10只。正常對照組給予標準飼料，其他3組給予高脂飼料(2%膽固醇+10%豬油+88%標準飼料)；喂養(yǎng)24周后，低劑量組、高劑量組給予FZHY水溶液灌胃，低劑量組0.75g/(kg·d)(成人單位體重臨床用量的10倍)，高劑量組1.5g/(kg·d)(成人單位體重臨床用量的20倍)，1次/d，6次/周，共6周，正常組及模型組大鼠以等體積蒸餾水灌胃；繼續(xù)喂養(yǎng)至第30周處死大鼠，取全血和肝組織樣本備用。

1.3 肝功能檢測 生物化學分析法測定各組大鼠血清總膽固醇(total cholesterol，TC)、甘油三酯(triacylglycerol，TG)、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase，ALT)、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(aspartate aminotransferase，AST)水平。

1.4 Ang Ⅱ測定 各組取血3ml制備血漿，另取100mg肝組織制成肝細胞勻漿，按Ang Ⅱ放免試劑盒說明書分別進行血漿及肝組織Ang Ⅱ測定。

1.5 肝組織病理學檢查 采用HE和Masson三色膠原染色，光鏡下觀察肝組織病理變化，特別是肝組織脂肪變、炎癥及肝纖維化程度。參照《非酒精性脂肪性肝病診療指南》及《病毒性肝炎防治方案》，進行Masson染色圖像分析，每張切片于10倍物鏡下選取四周和中央共5個區(qū)域，每個視野包括至少1個匯管區(qū)或纖維索，以IPP圖文分析軟件系統(tǒng)測定膠原纖維面積百分比(膠原纖維面積/視野面積×100%)，結(jié)果取均值。

1.6 肝纖維化相關(guān)基因的mRNA水平檢測 采用RT-qPCR法測定ACE、AT1R、α-SMA的mRNA水平。Trizol法提取肝組織RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA；以cDNA為模板行qPCR，以β-actin為內(nèi)參照。ACE(93bp)上游引物：5′-AGTGGGTGCTGCTCTTC CTA-3′，下游引物：5′-CGGAGGCTGTGATGGTTA T-3′；AT1R(205bp)上游引物：5′-CCCTCTGTTCTA CGGCTTTCT-3′，下游引物：5′-CAGTGTGCTTTG AACCTGTCA-3′；α-SMA(160bp)上游引物：5′-CTG ACAGAGGCACCACTGAA-3′，下游引物：5′-CATC TCCAGAGTCCAGCACA- 3′；β-actin(241bp)上游引物：5′-AACCCTAAGGCCAACCGTGAAAAG-3′，下游引物：5′-TCATGAGGTAGTCTGTCAGGT-3′。反應(yīng)體系參照TaKaRa公司SYBR Premix ExTaq說明書，并用2–ΔΔCt相對定量方式分析結(jié)果。ΔCt=Ct目的基因－Ct內(nèi)參基因；ΔΔCt=ΔCt實驗組－ΔCt對照組；當目的基因與內(nèi)參基因的擴增效率接近時，2–ΔΔCt表示所檢測樣品相對于參比樣品的目的基因的表達倍數(shù)。

1.7 免疫組織化學法檢測ACE、α-SMA、AT1R蛋白表達情況 肝組織病理切片依次脫蠟、水化，加3%H2O210min，枸櫞酸鈉修復液(pH6.0)高壓熱修復5min，非特異性血清封閉30min，分別加入抗ACE抗體(1∶300)、抗α-SMA抗體(1∶400)、抗AT1R抗體(1∶200)，于4℃孵育過夜，二抗37℃孵育20min，DAB顯色2～5min，水洗、蘇木素復染、脫水、透明、封片，顯微鏡下觀察。陰性對照切片以PBS代替一抗，其余步驟相同。

對免疫組織化學染色結(jié)果行半定量分析，圖像采用Image-Pro Plus 6.0圖像分析系統(tǒng)測量目的蛋白陽性細胞積分吸光度(integral absorbance，IA)值，每只大鼠肝組織取5張切片，每張切片分為4個象限，顯微鏡下每個象限取1～2個高倍視野，即每張切片選取4～8個高倍視野，計算IA均值。

1.8 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 16.0軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料以表示，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)　果

2.1 FZHY對大鼠血清肝功能的影響 生化分析結(jié)果顯示，與正常對照組比較，模型組、低劑量組、高劑量組大鼠血清CHOL、TG水平均明顯升高(P＜0.05)，但3組間差異無統(tǒng)計學意義(P=0.16)；同時，模型組、低劑量組、高劑量組大鼠血清ALT、AST水平均較正常對照組升高(P＜0.05)；與模型組比較，低劑量組及高劑量組ALT、AST均明顯下降，且高劑量組下降更明顯，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05，表1)。

表1 FZHY對大鼠肝功能的影響(±s，n=10)Tab.1 Effect of Fuzhenghuayu　decoction on the liver function of rats (±s, n=10)

表1 FZHY對大鼠肝功能的影響(±s，n=10)Tab.1 Effect of Fuzhenghuayu　decoction on the liver function of rats (±s, n=10)

TC. Total cholesterol; TG. Triacylglycerol; ALT. Alanine aminotransferase; AST. Aspartate aminotransferase; (1)P＜0.05 compared with normal control group; (2)P＜0.05 compared with model group; (3)P＜0.05 compared with low-dose group

Group　TC (mmol/L)　TG (mmol/L)　ALT (U/L)　AST (U/L)Normal control group　1.88±0.21　0.42±0.08　28.46±6.23　46.35±6.71 Model group　4.73±0.62(1)　1.57±0.24(1)　169.35±17.46(1)　166.91±18.50(1)Low-dose group　4.98±0.72(1)　1.37±0.15(1)　122.18±20.03(1)　131.57±16.34(1)High-dose group　4.65±0.51(1)　1.42±0.29(1)　81.32±16.67(1)(2)(3)　104.28±13.76(1)(2)(3)

2.2 FZHY對大鼠肝組織病理學的影響 HE染色結(jié)果顯示，正常對照組大鼠肝小葉為類圓形，肝細胞以中央靜脈為中心呈放射狀規(guī)則排列，結(jié)構(gòu)完整，未見肝細胞變性、壞死等病理變化；模型組可見肝組織、肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂，肝細胞呈彌漫性大泡性脂肪變，以腺泡3帶明顯，肝小葉內(nèi)點狀或灶狀肝細胞壞死伴有炎性細胞浸潤，可見竇周纖維化改變及匯管區(qū)纖維組織增生，部分出現(xiàn)橋連纖維化；低劑量組、高劑量組可見大鼠肝組織大泡性脂肪變肝細胞減少，炎癥、纖維化程度明顯改善，其中高劑量組改善效果更明顯(圖1)。

2.3 FZHY對大鼠肝組織纖維化程度的影響 Mason染色及圖像分析結(jié)果顯示，正常對照組肝組織少量膠原纖維表達(膠原纖維面積比為0.81±0.07)；模型組、低劑量組、高劑量組大鼠肝組織膠原纖維表達(膠原纖維面積比分別為：21.56±4.18，14.37±3.27，8.56±1.80)均明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)；與模型組比較，低劑量組及高劑量組膠原纖維面積均有所降低，高劑量組下降最明顯，組間差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05，圖1)。

2.4 FZHY對大鼠血漿、肝組織Ang Ⅱ水平的影響血漿Ang Ⅱ水平分析顯示，與正常對照組相比，模型組、低劑量組及高劑量組AngⅡ表達水平均明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，但3組間比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。與正常對照組比較，模型組、低劑量組、高劑量組肝組織Ang Ⅱ水平明顯升高，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)；與模型組比較，低劑量組及高劑量組Ang Ⅱ表達水平均明顯下降，其中高劑量組下降最為顯著，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05，表2)。

圖1 大鼠肝組織病理學變化(×200，n=10)Fig.1 Pathological changes of liver tissue in rats (×200, n=10)

表2 大鼠血漿、肝組織Ang Ⅱ水平變化(±s，n=10)Tab.2 Changes of angiotensin Ⅱ level in rat′s plasma and liver tissue(±s, n=10)

表2 大鼠血漿、肝組織Ang Ⅱ水平變化(±s，n=10)Tab.2 Changes of angiotensin Ⅱ level in rat′s plasma and liver tissue(±s, n=10)

(1)P＜0.05 compared with normal control group; (2)P＜0.05 compared with model group; (3)P＜0.05 compared with low-dose group

Group　Plasma AngⅡ(ng/L)Liver tissue AngⅡ (ng/g)Normal control group　509.0±112.3　926.9±167.3 Model group　873.4±167.3(1)　2451.3±225.8(1)Low-dose group　795.1±187.2(1)　1918.0±179.4(1)(2)High-dose group　832.9±201.4(1)　1662.1±180.2(1)(2)(3)

2.5 FZHY對大鼠肝組織ACE、AT1R、α-SMA mRNA水平的影響 從qPCR反應(yīng)曲線及熔解曲線看，擴增物均為單一產(chǎn)物，提示質(zhì)控良好。與正常對照組相比，模型組ACE、AT1R、α-SMA mRNA表達均明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)；與模型組比較，低劑量組、高劑量組ACE、AT1R、α-SMA mRNA水平下降，高劑量組表達水平最低，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05，圖2)。

2.6 FZHY對大鼠肝組織ACE、AT1R、α-SMA蛋白表達的影響 ACE免疫組化結(jié)果顯示，正常對照組大鼠肝細胞周圍只見少量棕黃色顆粒沉著，主要分布在肝小葉內(nèi)皮細胞及中央靜脈周圍，肝細胞內(nèi)未見棕黃色顆粒，模型組肝細胞周圍大片狀棕黃色深染，肝細胞及中央靜脈也可見大量棕黃色著色。AT1R免疫組化結(jié)果顯示，正常對照組肝組織弱陽性染色，主要在血管周圍表達；模型組棕色陽性細胞增多，多見于匯管區(qū)周圍細胞、肝竇內(nèi)皮細胞、纖維間隙內(nèi)、中央靜脈細胞。α-SMA免疫組化結(jié)果顯示，正常對照組血管壁只見少量棕黃色顆粒；模型組血管壁可見小片狀棕黃色顆粒，呈散在分布的棕色染色，陽性細胞多位于匯管區(qū)、肝血竇壁以及纖維間隔。低劑量組及高劑量組大鼠肝細胞周圍棕黃色顆粒呈細小片狀，肝細胞中亦可見少量棕黃色顆粒(圖3A)。

圖2 大鼠肝組織ACE、AT1R、α-SMA mRNA表達變化Fig.2 Expressions of ACE, AT1R and α-SMA mRNA in liver tissue of rats

與正常對照組比較，模型組細胞ACE、AT1R、α-SMA蛋白表達明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)；與模型組比較，低劑量組及高劑量組ACE、AT1R、α-SMA蛋白表達均明顯下降，以高劑量組下降程度更為明顯，組間比較差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05，圖3B)。

圖3 大鼠肝組織ACE、AT1R、α-SMA蛋白表達變化(×400，n=10)Fig.3 Expressions of ACE, AT1R and α-SMA protein in liver tissue of rats (×400, n=10)

3 討　論

肝纖維化的發(fā)生與發(fā)展是一個動態(tài)病理生理過程，符合中醫(yī)病機、病位動態(tài)演變的規(guī)律，基于傳統(tǒng)中醫(yī)學整體觀念及辨證論治的傳統(tǒng)中醫(yī)藥在治療肝纖維化方面具有獨特優(yōu)勢。針對纖維化、肝硬化“瘀血內(nèi)結(jié)、正氣虛弱”的病機，F(xiàn)ZHY主要由丹參、人工蟲草菌絲、桃仁、松花粉、絞股藍、五味子組成。方中丹參活血化瘀為君藥；冬蟲夏草補虛損、益精氣；桃仁助丹參活血化瘀，共為臣藥；松花粉及絞股藍同為佐藥，具有益氣潤燥、清熱解毒之功效；五味子味酸為引經(jīng)使藥。全方組合，具有扶助正氣、活血祛瘀生新的功效。

肝纖維化源自慢性肝損傷的修復反應(yīng)，由于炎癥的反復發(fā)生與修復，細胞外基質(zhì)沉積和代謝失衡可導致肝纖維化進行性加重，進而發(fā)生肝硬化，甚至肝衰竭。因此，肝纖維化機制及有效的抗肝纖維化藥物是近年來該領(lǐng)域關(guān)注的熱點。本研究通過高脂飼喂成功誘導了輕度非酒精性脂肪性大鼠肝纖維化模型，表現(xiàn)為肝組織HE染色及Masson染色等病理學方法呈現(xiàn)的肝組織、肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂，肝細胞彌漫性大泡性脂肪變，竇周纖維化改變及匯管區(qū)纖維組織增生，部分出現(xiàn)橋連纖維化；通過qPCR及免疫組織化學染色法可見模型動物肝臟α-SMAmRNA及蛋白水平明顯升高。α-SMA被認為是肝星狀細胞(hepatic stellate cells，HSCs)活化標志物；目前大量研究證實[2-4]，肝纖維化發(fā)生過程中起關(guān)鍵作用的中心環(huán)節(jié)是HSCs活化增殖，活化的HSCs高度表達α-SMA并合成分泌細胞外基質(zhì)，導致細胞外基質(zhì)的過度沉積，進而促進肝纖維化的發(fā)生及進展，因此如何有效抑制HSCs活化增殖是治療肝纖維化的關(guān)鍵問題。

Paizis等[1]首次證實肝臟亦存在局部RAS，肝臟局部RAS與肝纖維化、肝硬化有著密切的關(guān)系，其在肝纖維化發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用。本研究同樣證實，肝纖維化模型組せS中ACE、Ang Ⅱ、AT1R各環(huán)節(jié)表達均明顯升高，ACE有效催化Ang Ⅰ生成活性分子Ang Ⅱ，主要通過AT1R發(fā)揮經(jīng)典的ACE-Ang Ⅱ-AT1R軸效應(yīng)從而促進肝纖維化的形成。研究表明，ACE-Ang Ⅱ-AT1R軸與HSCs活化增殖密切相關(guān)[5]。Ang Ⅱ是RAS中最為重要的活性物質(zhì)之一，在肝纖維化的過程中發(fā)揮著促氧化、促炎及促纖維化的作用。肝纖維化患者及肝纖維化模型鼠血清中Ang Ⅱ水平均明顯升高[1]。Ang Ⅱ與肝細胞上的AT1R結(jié)合，促進肝臟細胞外基質(zhì)增生，誘導HSCs活化、收縮、增殖與遷移，啟動肝纖維化進程；活化的HSCs又可以增加RAS通路中各因子的表達，從而促進炎癥、Ang Ⅱ的氧化效應(yīng)及纖維化的發(fā)生和發(fā)展過程。Bataller等[6-7]通過皮下植入微型滲透壓泵進行慢性Ang Ⅱ輸注證實，Ang Ⅱ可以誘導HSCs的激活及膠原合成的增加；Ang Ⅱ促進體外培養(yǎng)的HSCs活性氧的生成、細胞的增殖和促炎癥因子的分泌。經(jīng)典RAS干預(yù)藥物血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑(ACE inhibitor，ACEI)及血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑(angiotensin Ⅱ receptor blockage，ARB)均可緩解肝纖維化模型動物的疾病進展[8-10]。

以上研究均證實ACE-Ang Ⅱ-AT1R軸通過影響HSCs的活化調(diào)控肝纖維化進展；而扶正化瘀藥物組肝纖維化程度較模型組明顯減輕，RAS中ACE、Ang Ⅱ、AT1R各環(huán)節(jié)及α-SMA表達均明顯降低，提示FZHY能有效延緩非酒精性脂肪性肝纖維化的發(fā)生和發(fā)展，該機制考慮與抑制ACE-Ang Ⅱ-AT1R軸活性從而有效抑制HSCs進展密切相關(guān)。綜上所述，本研究為傳統(tǒng)中藥FZHY在臨床用于非酒精性脂肪性肝纖維化的治療提供了理論依據(jù)。

【參考文獻】

[1]Paizis G, Cooper ME, Schembri JM,et al. Up-regulation of components of the renin-angiotensin system in the bile duct–ligated rat liver[J]. Gastroenterology, 2002, 123(5)∶ 1667-1676.

[2]Luo C, Chen ZX, Tan XH,et al. Therapeutic effects of Fuzhenghuayu decoction in a CCl4-induced liver cirrhosis rat model and on hepatic stellate cell activation[J]. Chin J Hepatol,2013, 21(9)∶ 668-673. [羅純, 陳澤雄, 譚行華, 等. 扶正化瘀方對肝纖維化模型大鼠肝組織纖維化及肝星狀細胞的影響[J]. 中華肝臟病雜志, 2013, 21(9)∶ 668-673.]

[3]Moriya K, Bae E, Honda K,et al. A fibronectin-independent mechanism of collagen fibrillogenesis in adult liver remodeling[J]. Gastroenterology, 2011, 140(5)∶ 1653-1663.

[4]Zhao XK, Yu L, Cheng ML,et al. Focal adhesion kinase regulates hepatic stellate cell activation and liver fibrosis[J]. Sci Rep,2017, 7(1)∶ 4032.

[5]Granzow M, Schierwagen R, Klein S,et al. Angiotensin-II type 1 receptor-mediated Janus kinase 2 activation induces liver fibrosis[J]. Hepatology, 2014, 60(1)∶ 334-348.

[6]Bataller R, G?bele E, Schoonhoven R,et al. Prolonged infusion of angiotensin II into normal rats induces stellate cell activation and proinflammatory events in liver[J]. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol, 2003, 285(3)∶ G642-G651.

[7]Bataller R, G?bele E, Parsons C J,et al. Systemic infusion of angiotensin II exacerbates liver fibrosis in bile duct–ligated rats[J]. Hepatology, 2005, 41(5)∶ 1046-1055.

[8]Yi E, Liu R, Wen Y,et al. Telmisartan attenuates hepatic fibrosis in bile duct-ligated rats[J]. Acta Pharmacol Sin, 2012, 33(12)∶1518-1524.

[9]Huang ML, Li X, Meng Y,et al. Upregulation of angiotensinconverting enzyme (ACE) 2 in hepatic fibrosis by ACE inhibitors[J]. Clin Exp Pharmacol Physiol, 2010, 37(1)∶ e1-e6.

[10] Munshi MK, Uddin MN, Glaser SS. The role of the reninangiotensin system in liver fibrosis[J]. Exp Biol Med, 2011,236(5)∶ 557-566.