響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化酶解法制備海洋微藻微擬球藻抗氧化肽工藝

呂小京，操德群,2，徐年軍,2,*

（1.寧波大學(xué)海洋學(xué)院，浙江省海洋生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 寧波 315211；2.寧波大學(xué) 應(yīng)用海洋生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 寧波 315211）

自從Harman[1]提出自由基理論以來(lái)，人們認(rèn)識(shí)到食物氧化變質(zhì)及人體內(nèi)氧化代謝產(chǎn)生的自由基與人的衰老和很多疾病有關(guān)。自由基會(huì)對(duì)細(xì)胞核組織造成嚴(yán)重氧化損傷，加速人體衰老，也會(huì)誘發(fā)動(dòng)脈硬化、老年癡呆癥、癌癥等疾病[2]?？寡趸瘎┚哂星宄杂苫鸵种浦|(zhì)過(guò)氧化的功能，可用于含脂肪食品的抗氧化及保健食品、化妝品的開(kāi)發(fā)，因此抗氧化劑近些年在國(guó)內(nèi)外發(fā)展很快[3-4]。目前使用的多為化學(xué)合成抗氧化劑，如丁基羥基茴香醚、二丁基羥基甲苯等，其本身具有毒副作用，所以各國(guó)政府對(duì)其添加量進(jìn)行了嚴(yán)格控制[5]。生物體由于處于不同的生態(tài)環(huán)境，以及自然衰老等原因，體內(nèi)會(huì)產(chǎn)生很多自由基，如羥自由基、氧自由基等。生物體在長(zhǎng)期的進(jìn)化過(guò)程中，產(chǎn)生了多種抗逆機(jī)制，為了提高自身的抗逆性，生物體在逆境條件下應(yīng)激性產(chǎn)生抗氧化肽類生物活性物質(zhì)。于是人們把目光逐步轉(zhuǎn)向從各種動(dòng)植物組織中提取天然抗氧化劑。國(guó)內(nèi)外研究人員已從大米[6]、小麥[7]、玉米[8]、鷹嘴豆[9]、鴨肉[10]、雞蛋清[11]、草魚(yú)[12]、貽貝[13]、輪蟲(chóng)[14]、螺旋藻[15]等動(dòng)植物來(lái)源的蛋白質(zhì)中提取出了具有抗氧化活性的肽類物質(zhì)。天然抗氧化肽具有安全性高、抗氧化性強(qiáng)、易被人體吸收等特點(diǎn)，作為食品和機(jī)體的抗氧化劑，是近年來(lái)熱門(mén)的研究課題。

微擬球藻（Nannochloropsis）是一種海洋來(lái)源的餌料微藻，目前已經(jīng)被批準(zhǔn)為新資源食品。微擬球藻生長(zhǎng)周期短，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，并且可以實(shí)現(xiàn)大規(guī)模養(yǎng)殖，具有很大的開(kāi)發(fā)潛力和商業(yè)化應(yīng)用前景[16]。微擬球藻含有豐富的二十碳五稀酸、蛋白質(zhì)及礦物質(zhì)，具有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[17]，在美國(guó)、智利等國(guó)家倍受歡迎。目前，該藻種主要應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖、食品、保健食品、生物制藥、化妝品和生物柴油等領(lǐng)域[18]，對(duì)微擬球藻中生物活性物質(zhì)的研究還很少。本研究以微擬球藻為原料制備微擬球藻蛋白，通過(guò)酶解法制備微擬球藻抗氧化肽，以水解度及1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除活性為評(píng)價(jià)指標(biāo)，經(jīng)單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面法分析確定了最佳酶解工藝條件，以期為微擬球藻抗氧化肽的開(kāi)發(fā)及綜合利用提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

微擬球藻（Nannochloropsis sp.）藻粉 煙臺(tái)海融生物技術(shù)有限公司。

胃蛋白酶、考馬斯亮藍(lán)G-250、牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）、透析袋（截留分子質(zhì)量為3 500 Da） 北京索萊寶科技有限公司；DPPH、鄰苯二甲醛（o-phthaldialdehyde，OPA）、2-巰基乙醇、L-還原型谷胱甘肽（L-glutathione reduced，GSH）、四硼酸鈉、十二烷基硫酸鈉 美國(guó)Sigma公司；其他試劑均為分析純，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

FD-1C-80冷凍干燥機(jī) 北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；Sorvall ST 16R冷凍離心機(jī) 賽默飛世爾科技公司；SpectraMax 190全波段酶標(biāo)儀 美國(guó)Molecular Devices公司；Vortex-2旋渦混合器 艾卡（廣州）儀器設(shè)備有限公司；BSA224S電子分析天平 賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；DK-8D電熱恒溫水槽 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；DHG-9070A（S）電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 寧波江南儀器廠；SevenEasy pH計(jì) 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 微擬球藻蛋白的制備

微擬球藻藻粉→超純水（固液比1∶10）→反復(fù)凍融→合并上層提取液→低溫離心（8 ℃，16 000×g，10 min）→上清液→減壓抽濾（0.45 μm水系濾膜）→濾液→鹽析（50%飽和度硫酸銨溶液）→低溫離心（8 ℃，10 000×g，10 min）→分別收集沉淀物和上清液→上清液進(jìn)行二次鹽析（80%飽和度硫酸銨溶液）→低溫離心（8 ℃，10 000×g，10 min）→合并沉淀物→少量超純水溶解→透析（截留分子質(zhì)量為3.5 kDa，4 ℃，36 h）→冷凍干燥→微擬球藻蛋白（于-40 ℃棕色樣品瓶避光保存）。

1.3.2 蛋白質(zhì)量濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線及可溶性蛋白含量測(cè)定

蛋白質(zhì)量濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制采用考馬斯亮藍(lán)法，以BSA作為標(biāo)準(zhǔn)物，用考馬斯亮藍(lán)G-250測(cè)定蛋白質(zhì)量濃度，測(cè)定波長(zhǎng)為595 nm，以吸光度對(duì)蛋白質(zhì)量濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[19]。根據(jù)蛋白質(zhì)量濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線即可求出微擬球藻蛋白溶液中可溶性蛋白含量。

1.3.3 酶解實(shí)驗(yàn)

選用胃蛋白酶做酶解實(shí)驗(yàn)。將微擬球藻蛋白用一定pH值的1.0 mmol/L磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）溶解，配制成一定質(zhì)量濃度的微擬球藻蛋白溶液，然后按一定比例加入蛋白酶，用旋渦混合器混勻，置于水浴鍋中在恒溫條件下進(jìn)行酶解實(shí)驗(yàn)。酶解8 h后，將酶解物于95 ℃水浴15 min滅酶活，室溫下冷卻后冰浴30 min，然后低溫離心（4 ℃，16 000×g，10 min），上清液過(guò)0.45 μm水系過(guò)濾器，取100 μL用于測(cè)定水解度，剩余溶液冷凍干燥得到微擬球藻蛋白酶解物，于-40 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4 水解度的測(cè)定

水解度參照Vasquezvillanueva等[20]的OPA法進(jìn)行測(cè)定。在96 孔酶標(biāo)板中分別加入2.5 μL酶解液和100 μL OPA混合液，25 ℃孵化8 min，然后用酶標(biāo)儀在340 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度。用GSH（0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mg/mL，用pH 7.0、1.0 mmol/L PBS配制）作為標(biāo)準(zhǔn)品繪制多肽含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線，求出樣品中的多肽含量，蛋白含量用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定。水解度計(jì)算如式（1）所示：

1.3.5 DPPH自由基清除活性的測(cè)定

DPPH自由基清除率的測(cè)定參照Li Ke等[21]的方法并修改。將冷凍干燥后的酶解物（溶解于pH 7.0、1.0 mmol/L PBS）配制成2.0 mg/mL的樣品溶液，同時(shí)將DPPH溶解于無(wú)水乙醇中配制成0.16 mmol/L的DPPH溶液。在96 孔酶標(biāo)板中加入100 μL樣品溶液和100 μL DPPH溶液，25 ℃避光反應(yīng)30 min后，于517 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。同時(shí)以100 μL樣品溶液和100 μL無(wú)水乙醇混合后的吸光度為對(duì)照組；以100 μL 1.0 mmol/L PBS和100 μL DPPH溶液混合后的吸光度為空白組。DPPH自由基清除率計(jì)算如式（2）所示：

式中：Ai為樣品組溶液的吸光度；Aj為對(duì)照組溶液的吸光度；A0為空白組溶液的吸光度。

1.3.6 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

酶解步驟如1.3.3節(jié)，分別對(duì)酶底比（質(zhì)量百分比1.0%、2.0%、3.0%、4.0%、5.0%、6.0%、7.0%）、底物質(zhì)量濃度（0.7、1.0、3.0、5.0、7.0、9.0、11.0 mg/mL）、酶解溫度（27、32、37、42、47、52 ℃）、pH值（1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5）進(jìn)行單因素試驗(yàn)，考察各因素對(duì)酶解產(chǎn)物水解度及DPPH自由基清除活性的影響。

1.3.7 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，固定酶底比6.0%、酶解時(shí)間8 h，根據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，以底物質(zhì)量濃度、酶解溫度、pH值這3 個(gè)因素為自變量，DPPH自由基清除率為響應(yīng)值，采用軟件Design-Expert V8.0.6設(shè)計(jì)三因素三水平的響應(yīng)面分析試驗(yàn)，確定微擬球藻蛋白酶解最佳工藝條件，試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平Table 1 Coded levels for independent variables used in response surface analysis

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 酶底比對(duì)酶解物水解度及抗氧化活性的影響

在底物質(zhì)量濃度20.0 mg/mL、酶解溫度37 ℃、pH 2.0、酶解8 h的條件下，由圖1可知，隨著酶底比的增加，蛋白水解度逐漸增加，說(shuō)明酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加可以增加底物與酶的接觸機(jī)率，從而加速酶解反應(yīng)進(jìn)程，水解度增大[22]。當(dāng)酶底比達(dá)到5%時(shí)，蛋白水解度達(dá)到最大，繼續(xù)增加酶底比反而使水解度略有下降，可能是因?yàn)殡S著產(chǎn)物濃度的提高，產(chǎn)物與酶形成復(fù)合物，阻礙了底物與酶的結(jié)合，從而減緩了水解進(jìn)程，使水解度緩慢減小。觀察酶解產(chǎn)物的抗氧化活性可以發(fā)現(xiàn)，不同酶底比對(duì)于酶解物的抗氧化活性影響不大，只在酶底比為6%時(shí)酶解物的DPPH自由基清除率略有增加。綜合考慮水解度和抗氧化活性，選擇最適酶底比為6%。

圖1 酶底比對(duì)酶解物水解度及抗氧化活性的影響Fig. 1 Effects of enzyme-to-substrate ratio on DH and antioxidant activity of hydrolysates

2.1.2 底物質(zhì)量濃度對(duì)酶解物水解度及抗氧化活性的影響

圖2 底物質(zhì)量濃度對(duì)酶解物水解度及抗氧化活性的影響Fig. 2 Effects of substrate concentrations on DH and antioxidant activity of hydrolysates

在酶底比6%、酶解溫度37 ℃、pH 2.0、酶解8 h的條件下，如圖2所示，水解度隨底物質(zhì)量濃度的增加而增加，說(shuō)明增加底物質(zhì)量濃度能增加底物與酶的接觸幾率，從而加速酶解反應(yīng)進(jìn)程[23]。本實(shí)驗(yàn)中酶解物的抗氧化活性未隨底物質(zhì)量濃度和水解度的增加而增加，而是呈現(xiàn)先增后減的趨勢(shì)，這可能是由于過(guò)度酶解使一些活性多肽進(jìn)一步被水解成小分子質(zhì)量的短肽，而這些短肽不具有或有較弱的抗氧化活性[24]。因此為了得到抗氧化活性較強(qiáng)的酶解產(chǎn)物，必須嚴(yán)格控制蛋白的酶解程度。由圖2可知，底物質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL和3.0 mg/mL時(shí)，酶解物的DPPH自由基清除率差異不大，考慮到底物質(zhì)量濃度1.0 mg/mL時(shí)酶解物的水解度過(guò)低，且反應(yīng)體系所需溶劑體積過(guò)大，故選擇3.0 mg/mL為適宜底物質(zhì)量濃度。

2.1.3 酶解溫度對(duì)酶解物水解度及抗氧化活性的影響

圖3 酶解溫度對(duì)酶解物水解度及抗氧化活性的影響Fig. 3 Effect of hydrolysis temperature on DH and antioxidant activity of hydrolysates

在酶底比6%、底物質(zhì)量濃度3.0 mg/mL、pH 2.0、酶解8 h的條件下，由圖3可知，當(dāng)酶解溫度小于47 ℃時(shí)，水解度逐漸增加，酶解溫度超過(guò)47 ℃后水解度明顯下降。這是因?yàn)橐环矫嫔邷囟瓤墒狗磻?yīng)體系內(nèi)的物質(zhì)運(yùn)動(dòng)加快，從而提高底物與酶的接觸幾率，加速反應(yīng)進(jìn)程；另一方面，過(guò)高的溫度使維持酶分子結(jié)構(gòu)的次級(jí)鍵斷裂，導(dǎo)致酶活性降低，延緩了酶解進(jìn)程，水解度下降[25]。觀察酶解產(chǎn)物的抗氧化活性發(fā)現(xiàn)，與其他溫度相比，溫度為42 ℃和47 ℃時(shí)的酶解產(chǎn)物的DPPH自由基清除率相對(duì)較低，結(jié)合水解度變化曲線分析，造成這一現(xiàn)象的原因是在這兩個(gè)溫度條件下，酶解產(chǎn)物的水解度較大，過(guò)度的水解造成抗氧化肽的結(jié)構(gòu)被破壞，酶解產(chǎn)物的抗氧化活性降低。其他溫度條件下，酶解物的水解度都在54.94%～56.98%之間，其抗氧化活性也相差不多，說(shuō)明在一定的水解度下，酶解產(chǎn)物具有合適且穩(wěn)定的肽段長(zhǎng)度和氨基酸比例，從而具有良好的抗氧化活性。酶解溫度為37 ℃時(shí)，酶解產(chǎn)物的抗氧化活性最大，且胃蛋白酶的最適溫度為37 ℃，故選擇37 ℃為最適酶解溫度。

2.1.4 pH值對(duì)酶解物水解度及抗氧化活性的影響

圖4 pH值對(duì)酶解物水解度及抗氧化活性的影響Fig. 4 Effect of pH value on DH and antioxidant activity of hydrolysates

在酶底比6%、底物質(zhì)量濃度3.0 mg/mL、酶解溫度37 ℃、酶解8 h的條件下，如圖4所示，酶解產(chǎn)物的水解度隨pH值的變化呈現(xiàn)不規(guī)則波動(dòng)，而酶解物的抗氧化活性則呈現(xiàn)先增后減的趨勢(shì)。這是因?yàn)榉磻?yīng)體系pH值的變化會(huì)直接影響酶分子及底物分子的解離狀態(tài)、酶蛋白活性中心的構(gòu)象，進(jìn)而影響酶與底物的結(jié)合、酶穩(wěn)定性及產(chǎn)物轉(zhuǎn)化，最終影響酶解產(chǎn)物的性質(zhì)[26-27]。從圖4可以看出，pH值小于2.0時(shí)酶解產(chǎn)物的抗氧化活性較強(qiáng)，pH值大于2.0后酶解產(chǎn)物的抗氧化活性急劇下降，可能是由于胃蛋白酶的最適pH 1.0～2.0，在這一范圍內(nèi)，胃蛋白酶的活性高，酶解效果好。pH 1.5時(shí)，酶解產(chǎn)物的DPPH自由基清除率達(dá)到最大，所以確定最佳pH值為1.5。

2.2 酶解工藝響應(yīng)面優(yōu)化

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

綜合單因素試驗(yàn)結(jié)果，固定酶底比6.0%、酶解時(shí)間8 h，以底物質(zhì)量濃度、酶解溫度、pH值這3 個(gè)因素為自變量，DPPH自由基清除率為響應(yīng)值，根據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案與結(jié)果如表2所示。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案與結(jié)果Table 2 Experimental design with response variable for response surface analysis

2.2.2 模型的建立與方差分析

表3 模型回歸方程方差分析Table 3 Analysis of variance (ANOVA) of regression equation

利用軟件Design-Expert V8.0.6進(jìn)行多元回歸擬合，得到回歸模型方程：

Y=39.58+7.97A+0.41B+0.70C-1.88AB-6.03AC-0.80BC-0.95A2+4.44B2-8.00C2

回歸方程的方差分析結(jié)果見(jiàn)表3?；貧w模型的決定系數(shù)（R2）為0.948 3，說(shuō)明DPPH自由基清除率的實(shí)測(cè)值與預(yù)測(cè)值擬合較好；調(diào)整決定系數(shù)（）為0.855 3，表明該模型能解釋85.53%響應(yīng)值變化。該模型的P值小于0.01，表明該回歸模型極顯著；模型失擬項(xiàng)P值為0.963 5，該模型失擬項(xiàng)不顯著，說(shuō)明方程擬合度高，可用此模型預(yù)測(cè)底物質(zhì)量濃度、酶解溫度和pH值對(duì)DPPH自由基清除活性的影響。模型中一次項(xiàng)A和二次項(xiàng)C2影響極顯著，交互項(xiàng)AC和二次項(xiàng)B2影響顯著，可判斷出各因素對(duì)響應(yīng)值的影響是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，并非簡(jiǎn)單的線性關(guān)系。通過(guò)方差分析表中各因素的F值可評(píng)價(jià)各因素對(duì)試驗(yàn)指標(biāo)的影響，F(xiàn)值越大，影響越顯著。由表3可知，各因素對(duì)微擬球藻蛋白抗氧化活性的影響順序?yàn)榈孜镔|(zhì)量濃度＞pH值＞酶解溫度。

2.2.3 響應(yīng)面分析

分別固定各因素中的1 個(gè)因素在0水平，得其余2 個(gè)因素的交互作用對(duì)抗氧化活性影響的三維響應(yīng)面圖和等高線圖，可以直觀地反映各因素的交互作用對(duì)酶解產(chǎn)物抗氧化活性的影響[28]，如圖5所示。等高線是響應(yīng)面中水平方向的投影，等高線的形狀可反映出交互作用是否顯著，橢圓等高線表示兩因素交互作用顯著，圓形等高線表示交互作用不顯著[29]。圖5a、b等高線表現(xiàn)為橢圓形，說(shuō)明底物質(zhì)量濃度和酶解溫度、底物質(zhì)量濃度和pH值的兩因素交互作用明顯。如果一個(gè)響應(yīng)面坡度相對(duì)平緩，表明處理?xiàng)l件的變化對(duì)響應(yīng)值的影響不大，相反，如果一個(gè)響應(yīng)面坡度非常陡峭，表明響應(yīng)值對(duì)于處理?xiàng)l件的改變非常敏感[30]。圖5a、b顯示，沿A軸方向的響應(yīng)面的坡度明顯比較陡峭，說(shuō)明底物質(zhì)量濃度的變化對(duì)DPPH自由基清除率的影響比另外兩個(gè)因素對(duì)其的影響大。圖5c顯示，B軸方向的響應(yīng)面坡度比C軸更為平緩，說(shuō)明pH值的變化對(duì)響應(yīng)值的影響比溫度對(duì)響應(yīng)值的影響大。該結(jié)論與方差分析結(jié)果一致：各因素對(duì)微擬球藻蛋白抗氧化活性的影響順序?yàn)榈孜镔|(zhì)量濃度＞pH值＞酶解溫度。

圖5 雙因素交互影響DPPH自由基清除活性的響應(yīng)面及等高線圖Fig. 5 Response surface and contour plots showing the interactive effects of variables on DPPH radical scavenging activity

2.2.4 最佳酶解條件的確定及驗(yàn)證

分析得到最佳酶解條件為底物質(zhì)量濃度5.0 mg/mL、酶解溫度32 ℃、pH 1.36，在此酶解條件下，DPPH自由基清除率的預(yù)測(cè)值為53.16%。按照該工藝條件進(jìn)行3 次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，測(cè)得最佳酶解條件下酶解產(chǎn)物的DPPH自由基清除率為（51.85±1.20）%，與預(yù)測(cè)值接近，其相對(duì)誤差為2.5%，說(shuō)明通過(guò)響應(yīng)面法優(yōu)化得到的回歸模型方程及最佳條件可靠。

3 結(jié) 論

本研究在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面法建立酶解法制備微擬球藻抗氧化肽工藝的二次多項(xiàng)回歸方程，通過(guò)方差分析，該模型顯著，所得回歸方程擬合度高。最終確定最佳酶解條件為：底物質(zhì)量濃度5.0 mg/mL、酶解溫度32 ℃、pH 1.36、酶底比6%。在此酶解條件下DPPH自由基清除率達(dá)51.85%，與預(yù)測(cè)值接近，說(shuō)明通過(guò)響應(yīng)面法建立的回歸模型方程準(zhǔn)確可靠，這為進(jìn)一步分離純化微擬球藻抗氧化肽提供了參考。

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