應(yīng)用高通量測序技術(shù)研究新疆產(chǎn)區(qū)葡萄果實、葉片及果園土壤微生物多樣性

魏玉潔，鄒 彎，馬文瑞，閆寅卓，武 運,*，薛 潔,*

（1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830000；2.中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院，北京 100015）

葡萄酒的風(fēng)格不僅取決于釀酒葡萄品種、釀造工藝，而且與發(fā)酵過程中微生物的代謝息息相關(guān)。新西蘭科學(xué)家研究表明，決定葡萄酒獨特風(fēng)味的化合物中，大約有一半來自微生物的代謝過程。在自然發(fā)酵過程中，葡萄酒中的微生物主要來源釀酒葡萄、葡萄園、釀造設(shè)備、酒廠車間環(huán)境等[1-4]，這些微生物在發(fā)酵過程中會隨著葡萄果粒和釀造工序進入發(fā)酵罐參與發(fā)酵過程，因此對葡萄酒的品質(zhì)形成有一定影響。

釀酒葡萄在生長過程中，受葡萄園土壤類型、地理地形、光照、降水量、晝夜溫差等自然因素的影響，附著在葡萄原料表皮中的微生物種類存在顯著差異[5]。目前世界上許多葡萄酒產(chǎn)地的本土微生物菌群已經(jīng)被廣泛研究，如西班牙、意大利、法國、美國、澳大利亞等。我國葡萄栽培區(qū)域廣闊，葡萄適栽區(qū)的生態(tài)地理條件復(fù)雜多樣，勢必蘊藏著豐富的釀酒微生物菌資源。但遺憾的是除釀酒葡萄自然發(fā)酵液中酵母多樣性的分析引起研究人員的極大關(guān)注外[6-9]，對于葡萄表面微生物資源和葡萄園中微生物的生態(tài)研究一直未得到應(yīng)有的重視，其多樣性研究在我國尚屬空白。

本研究利用高通量測序技術(shù)分析新疆產(chǎn)區(qū)3 個不同地區(qū)葡萄園中釀酒葡萄、土壤以及葡萄葉片中微生物的組成，揭示同種生態(tài)系統(tǒng)中地生微生物群落和附生微生物群落之間、不同生態(tài)系統(tǒng)微生物群落之間的生態(tài)聯(lián)系及交互作用，為新疆產(chǎn)區(qū)釀酒微生物資源庫的建設(shè)以及優(yōu)良微生物的篩選提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實驗樣品來自中國新疆天山北麓釀酒葡萄產(chǎn)區(qū)中的A、B和C 3 個葡萄園中的釀酒葡萄（G）、葡萄葉片（L）和葡萄園土壤（S），分別于2015年9月采樣，每種樣品采集3 份，樣品具體如表1所示。

表1 實驗樣品Table 1 Experimental samples

瓊脂糖 西班牙Biowest Agarose公司；NGS-ITS1 copy1 Barcode1-70、NGS-16s V4 copy1 Barcode1-70生工生物工程（上海）股份有限公司；Gold View I核酸染料 北京中生瑞泰科技有限公司；DL 2000 Marker美國Axygen公司；所有提取用無機、有機溶劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Illumina Misq測序平臺 國家級酒類品質(zhì)與安全國際聯(lián)合研究中心；電子天平 瑞士梅特勒-托利多公司；立式電熱壓力蒸汽滅菌鍋 上海申安醫(yī)療器械廠；2-16N高速微量離心機 湖南恒諾儀器設(shè)備有限公司；渦旋振蕩器 美國Scientific Industries公司；Mini-beater組織研磨器 美國Biospec公司；BioSpec-nano核酸蛋白檢測儀 德國Eppendorf公司；BG-Power 600電泳儀鄭州南北儀器設(shè)備有限公司；Biosystems Model溫度梯度聚合酶鏈式反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀、Tanon 1600凝膠成像儀 美國伯樂公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品采集

土壤采樣方法：去除葡萄地表面的植物等殘體，用土鏟垂直切開土壤，在土壤深度20 cm處取樣，每個取樣點取樣約0.5 kg[10]。

葡萄葉片、葡萄采樣方法：以一株葡萄樹的上、中、下3 個部位采樣，用剪刀剪下葡萄葉片和葡萄串[11]。

1.3.2 樣品細菌和真菌的分離

1.3.2.1 土壤細菌和真菌的分離

將塊狀土壤輕輕破碎為粉末狀，稱取0.4 g土壤樣品和0.5 g研磨珠于滅菌的2 mL離心管中。

1.3.2.2 葡萄及葡萄葉片細菌和真菌的分離[12-14]

1）稱取葡萄皮、葉片（無果肉、無果梗）各4 g，加入到滅菌的50 mL離心管L1中，加6 mL TENP緩沖液（50 mmol/L Tris，20 mmol/L EDTA，100 mmol/L NaCl，1% PVP，pH 10.0），渦旋振蕩10 min；2）配平，3 000×g離心5 min，將上清液轉(zhuǎn)移至一個新的50 mL離心管L2中；3）再吸取6 mL TENP緩沖液到離心管L1中，渦旋振蕩5 min，配平，3 000×g離心5 min，將上清液轉(zhuǎn)移至離心管L2中；4）重復(fù)步驟3）；5）吸取6 mL磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）到離心管L1中，渦旋振蕩5 min，配平，3 000×g離心5 min，將上清液轉(zhuǎn)移至離心管L2中；6）將離心管L2配平，9 000×g離心10 min，棄上清液，留下的沉淀即為所需樣品，如需放置則-20 ℃保存。

1.3.3 DNA的粗提

土壤中微生物原基因組DNA的提取采用Mag-Bind Soil DNA Kit Protocol試劑盒（OMEGA）；葡萄表面、葡萄葉片微生物原基因組DNA的提取采用Fast DNA SPIN Kit for Soil試劑盒（MP）。

1.3.4 樣品分析

由中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院國家級酒類品質(zhì)與安全國際聯(lián)合研究中心應(yīng)用Illumina Misq測序平臺進行分析。

1.3.4.1 樣品PCR[15-16]

真菌ITS ITS1區(qū)域擴增通用引物：ITS 1F（5’-CTTGGTCATTTAGAGGAGTAA-3’）；ITS 1R（5’-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3’）。PCR（50 μL）擴增體系：dNTP Mixture 4 μL，10×PCR Buffer（Mg2+plus）5 μL，正向和反向引物各1 μL，模板DNA 5 μL，Ex Taq酶0.25 μL，ddH2O補足至50 μL，充分混勻。PCR擴增程序：98 ℃預(yù)變性3 min；98 ℃變性45 s，53 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，反應(yīng)35 個循環(huán)；72 ℃延伸8 min。-20 ℃保存。

細菌16S rDNA V4擴增通用引物：16S 515F（5’-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3’）；16S 806R（5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’）。PCR（50 μL）擴增體系：dNTP Mixture 4 μL，10×PCR Buffer（Mg2+plus） 5 μL，正向和反向引物各1 μL，模板DNA 5 μL，Ex Taq酶0.25 μL，ddH2O補足至50 μL，充分混勻。PCR擴增程序：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性45 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，反應(yīng)35 個循環(huán)；72 ℃延伸5 min。-20 ℃保存。

1.3.4.2 PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳分析

采用DL2000 Marker、1%的瓊脂糖凝膠，110 V恒壓對PCR產(chǎn)物進行電泳35 min，凝膠成像儀觀察電泳結(jié)果。

1.3.5 高通量測序[17-23]

使用AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒對真菌、細菌的PCR擴增產(chǎn)物進行切膠回收。采用Life Qubit 3.0對純化后的PCR產(chǎn)物進行濃度定量，構(gòu)建真菌ITS ITS1、細菌16S rDNA V4區(qū)域文庫。將樣品（文庫）逐步稀釋到4 nm，按1∶1加入氫氧化鈉室溫變性5 min，加入HT1 Buffer預(yù)冷，選8 ppm進行高通量上機測序。

1.3.6 原始測序數(shù)據(jù)統(tǒng)計

下機后，采用雙峰（pair-end）測序法舍棄原始數(shù)據(jù)中的低質(zhì)量序列（保證50 個連續(xù)堿基的平均質(zhì)量大于Q30）。用Flash軟件，過濾對接上的序列（連續(xù)相同的堿基個數(shù)小于6，模糊堿基個數(shù)小于1），設(shè)計無法對接的序列，得到最終用于OTU（operational taxonomic unit）分析的序列。

1.3.7 OTU列表生成

采用Qiime軟件，將相似度達97%以上的序列歸為一個操作分類單元即OTU；聚類所有序列（Ucl法），參照RDP（Ribosomal Database Project）數(shù)據(jù)庫，采用貝葉斯算法注釋每個分類中的OTU代表序列，得到每個OTU的分類學(xué)信息。

1.3.8 微生物群落結(jié)構(gòu)及多樣性分析

對OTU數(shù)據(jù)進行整理，在微生物分類為屬的水平上對各個樣本中的真菌、細菌進行物種豐度柱形圖統(tǒng)計，確定優(yōu)勢菌屬；通過主坐標分析圖及聚類圖分析樣本間相似度；通過維恩圖觀察A、B、C 3 個葡萄園中樣本間所包含的相同菌屬，以此來綜合分析各個樣本中微生物群落的多樣性。

2 結(jié)果與分析

2.1 實驗樣品中微生物群落多樣性結(jié)果

高通量測序結(jié)果表明，本研究27 個樣品中共檢測出了272 種不同屬的真核微生物，屬于Ascomycota、Basidiomycota、Chytridiomycota、Zygomycota和Un—s-Fungal sp 38 CC 06_28這5 個菌門；檢測出了317 種原核微生物，屬于Actinobacteria、Bacteroidetes、Crenarchaeota、Firmicutes、Nitrospirae、Planctomycetes、Proteobacteria和Verrucomicrobia這8 個菌門。含量較多的前15 種菌屬如表2、3所示。

表2 3 個不同地區(qū)土壤、葡萄和葉片中屬水平真菌微生物數(shù)量Table 2 Fungal quantities at family level in soil, as well as on grapes and leaves

表2顯示了樣品的真菌群落構(gòu)成及大小，從不同的葡萄園來看，B地區(qū)檢測出的真菌數(shù)量最多，其次為C地區(qū)、A地區(qū)；從樣品種類來看，土壤所檢測出的真菌數(shù)量是最高的，其次是葡萄葉片，最后是葡萄表面。表3顯示了樣品的細菌群落構(gòu)成及大小，從不同的葡萄園來看，A地區(qū)檢測出的細菌數(shù)量最多，其次為B地區(qū)、C地區(qū)；從樣品種類來看，同真菌檢測結(jié)果相同，土壤所檢測出的細菌數(shù)量是最高的，其次是葡萄葉片，最后是葡萄表面。

表3 3 個不同地區(qū)土壤、葡萄和葉片中屬水平細菌微生物數(shù)量Table 3 Bacterial quantities at family level in soil, as well as on grapes and leaves

2.2 微生物豐度分析

圖1 真菌群落屬水平相對豐度Fig. 1 Relative abundance of fungi at genus level

由于樣品中所檢測出的微生物種類繁多，許多物種含量十分少，不能明顯地與含量多的物種表示在同一個圖中，所以以物種的豐度大于1%作為劃分依據(jù)，分別選擇了排名前14的真菌、細菌優(yōu)勢菌屬，以相對豐度為縱坐標，繪制柱形圖。圖1顯示出相對豐度值高于1%的14 種真菌菌屬，其中，Erysiphe在A、C地區(qū)土壤中含量很低甚至未檢出，Sordaria和Tetracladium在A地區(qū)葡萄葉片中含量很低甚至未檢出，Tetracladium在A地區(qū)葡萄、Geomyces在C地區(qū)葉片中含量很低甚至未檢出。在土壤樣品中Saccharomyces最為豐富，其次是Sordaria、Tetracladium和Geomyces；在葡萄中，Aureobasidium是最豐富的，其次為Cryptococcus、Aspergillus和Pleosporales；葡萄葉片中最豐富的也是Aureobasidium，其次為Sporospora。

Saccharomyces、Aureobasidium、Sporospora和Aspergillus雖然豐度有所不同，但出現(xiàn)在所有樣品中。Saccharomyces、Sordaria和Tetracladium大量存在于土壤樣品中，而在葡萄表面尤其是葉片中含量十分少。Aureobasidium大量存在于葡萄表面，其次為葉片，在土壤中含量卻十分少。Pleosporales、Penicillium、Cryptococcus、Dothideales、Alternaria和Scleroderma也出現(xiàn)在所有樣品中，但豐度較小。值得注意的是，Erysiphe在B地區(qū)葡萄葉片中大量存在，幾乎接近于菌屬總和的50%。

圖2 細菌群落屬水平相對豐度Fig. 2 Relative abundance of bacteria at genus level

圖2 顯示，在27組樣品中，其他未檢出菌屬所占比例較大，只有Arthrobacter、Sphingomonas、Steroidobacter、Pseudomonas和Acinetobacter 5 種細菌菌屬存在于所有土壤、葉片和葡萄中，其他菌屬尤其是Oenococcus含量很低甚至未檢出。土壤中細菌檢出量明顯大于葉片，葡萄表面所檢出的細菌最少。

土壤中豐度最大的菌屬為Kaistobacter，其次為Arthrobacter、Skermanella；葡萄和葉片中Pseudomonas豐度相對較大，其次為Sphingomonas和Adhaeribacter。Flavisolibacter在A地區(qū)葡萄中、Adhaeribacter在B地區(qū)葡萄中未檢出。所有樣品中雖然檢出有醋酸桿菌，但其含量均很低，沒有進入前14 種優(yōu)勢菌屬范圍。

2.3 樣品中所含OTU數(shù)目分析

圖3 真菌群落維恩圖Fig. 3 Venn diagram of fungal communities

采用Qiime軟件，得到每個OTU的分類學(xué)信息，通過R軟件，繪制維恩圖。由圖3a看出，3 個葡萄園的土壤樣品中分別含有真菌種類150、156、126、141、142、137、131、146 個和143 個，其中共有的菌種種類有94 個；由圖3b看出，葡萄果實樣品中分別含有真菌種類91、98、80、118、104、103、97、110 個和106 個，共有的真菌種類有69 個；由圖3c看出，葡萄葉片樣品中分別含有真菌種類79、80、77、99、73、90、87、101 個和89 個，共有的真菌種類58 個。3 個地區(qū)葡萄園土壤中所含的相同真菌種類較多，而葡萄葉片中較少。

圖4 細菌群落維恩圖Fig. 4 Venn diagram of bacterial communities

由圖4a可看出，3個葡萄園的土壤樣品中分別含有細菌種類1 070、1 083、1 087、1 090、1 065、1 077、1 083、1 057個和1 058 個，共有的細菌種類1 009 個；由圖4b看出，葡萄樣品中分別含有的細菌種類51、54、40、68、57、56、59、63 個和56 個，有32 種細菌在所有葡萄樣品中均含有；由圖4c看出，葡萄葉片中分別含有細菌種類82、126、103、86、84、104、101、83 個和92 個，共有的細菌種類47 個。從細菌OTU數(shù)目分析，不同地區(qū)土壤中相同微生物比較多，而葡萄葉片和葡萄果實相對較少。

2.4 不同樣品中微生物群落的比較分析

圖5 真菌群落主成分分析（a）和UPGMA聚類分析（b）圖Fig. 5 Principal coordinate analysis of fungal communities (a) and UPGMA cluster analysis (b) of the fungal microbiota

用R語言分析3 個葡萄園樣品的真菌群落，不同樣品分別用不同的點來表示，進行主成分分析及聚類分析。圖5a中，當(dāng)PC1為63.28%，PC2為20.92%時，從樣品種類來看，葡萄葉片和葡萄果實中的真菌群落相似性較高，相比之下，土壤與葉片、葡萄的距離較遠，相似性較低。從樣品采集地點來看，3 個葡萄園中土壤的相似性較高，B葡萄園中的葉片微生物與A、C地區(qū)有清晰的劃分，而A、C地區(qū)的釀酒葡萄雖然與B地區(qū)之間有一定的距離，但差異較小。

為了比較不同地區(qū)樣品間微生物種類的差異，本研究將所有樣品真菌群落進行聚類分析（圖5b），結(jié)果表明，在遺傳距離為0.05處時，土壤樣品與葡萄葉片、釀酒葡萄產(chǎn)生了分支，同時，3 個葡萄園中的土壤也各成一個分支，差異明顯。葡萄葉片與葡萄差異較小，B葡萄園的葡萄葉片在0.1遺傳距離處與A、C葡萄園產(chǎn)生分支，各葡萄園中的葡萄無明顯差異。

圖6 細菌群落主成分分析（a）和UPGMA聚類分析（b）圖Fig. 6 Principal coordinate analysis of bacterial communities (a) and UPGMA cluster analysis (b) of the bacterial microbiota

與真菌群落相同，用SPSS分析3 個葡萄園樣品的細菌群落。圖6a顯示，當(dāng)PC1為70.61%，PC2為15.50%時，從樣品種類來看，葡萄葉片和葡萄中的真菌群落相似性十分高，相比之下，土壤與葉片、葡萄的距離較遠，相似性較低。從樣品采集地點來看，3 個葡萄園中土壤的相似性較高，其中A和B葡萄園更為相似，C葡萄園中的微生物與A、B地區(qū)存在差異；A、B葡萄園的葉片和葡萄聚集在一起，無明顯的差異，而C葡萄園相對于A、B葡萄園來說，有明顯的區(qū)別，存在差異。

將所有樣品的細菌群落進行聚類分析（圖6b），結(jié)果與主成分分析結(jié)果基本一致。在遺傳距離為0.05處時，所有的土壤樣品就與葡萄葉片、葡萄產(chǎn)生了分支，但3 個葡萄園中土壤的劃分不是十分清晰，C與A、B葡萄園不在同一條分支上，而A和B葡萄園交互在一起，無明顯差異。B、C葡萄園中的葉片和葡萄均各自產(chǎn)生一條分支，有明確的區(qū)別，只有A葡萄園中的葉片和葡萄無明顯差異。

3 討 論

近年來，對于葡萄酒微生物的研究已不只局限于釀酒葡萄漿果，而是逐漸擴大到了葡萄葉片、葡萄樹皮、葡萄園土壤乃至更大的生態(tài)系統(tǒng)，許多研究都表明與葡萄酒相關(guān)的真菌和細菌微生物會附生在葡萄樹的各個部位上，如葡萄汁、葡萄酒、葡萄葉片、樹皮、樹根、土壤等[24-26]。

Renouf等[27]研究表明，土壤中的優(yōu)勢真菌菌屬為Saccharomyces、Sordaria、Tetracladium和Geomyces，葡萄和葡萄葉片中的優(yōu)勢真菌菌屬為Aureobasidium、Sporospora、Cryptococcus和Dothideales，此外，本研究還檢測到了其他真菌菌屬如Aspergillus、Pleosporales、Penicillium、Erysisphe、Alternaria和Scleroderma；Pinto[28]和Stevanato[29]等研究表明，Ascomycota和Basidiomycot是土壤、葡萄和葡萄葉片中主要的真菌微生物（門水平），本研究通過檢測不僅得到了Ascomycota和Basidiomycot，還得到了Chytridiomycota，Un—s-fungal sp CC 06_28和Zygomycota。需要注意的是，已有研究[30-32]指出，葡萄樹白粉病對葡萄傷害非常大，使葡萄幼果易開裂腐敗，該病由Erysisphe引發(fā)，但目前可以有效預(yù)防，本研究在B地區(qū)的葡萄葉片上檢測出了大量的Erysisphe，建議B地區(qū)需要盡快進行防治；已有研究[33-35]指出，赭曲霉素可以致人死亡，它主要由Aspergillus產(chǎn)生，是全球葡萄酒都存在的問題，有些權(quán)威機構(gòu)建立了2 μg/L的最大限量，雖然如此，但它存在于葡萄和葡萄酒中的可能性風(fēng)險卻不高；Lachenmeier等[36]指出，霉菌是一種絲狀真菌，大量存在于葡萄表面，能夠侵染葡萄的莖、葉、花、果實等，造成果實減產(chǎn)，影響果實品質(zhì)，它在儲酒橡木桶內(nèi)外、葡萄酒瓶木塞處很容易生長繁殖，當(dāng)濃度達到十億分之一或萬億分之一時就能明顯的聞出，產(chǎn)生令人不愉快的霉味，部分霉菌的次級代謝產(chǎn)物還有致癌趨勢，損害人體健康。

Hirano[37]、Park[38]等研究表明，土壤中的優(yōu)勢細菌菌屬為Kaistobacter、Arthrobacter、Skermanella和Sphingomonas，葡萄和葡萄葉片中的優(yōu)勢細菌菌屬為Pseudomonas、Acinetobacter和Kaistobacter，此外，本研究還檢測到了其他細菌菌屬如Steroidobacter、Rubrobacter、Flavisolibacter、Pontibacter、Nitrospira、Rhodoplanes和Adhaeribacter；Proteobacteria、Firmicutes、Bacteroidetes和Actinobacteria為土壤、葡萄和葡萄葉片中主要的細菌微生物（門水平），本研究通過檢測不僅得到了Proteobacteria、Firmicutes、Bacteroidetes和Actinobacteria，還得到了Crenarchaeota、Nitrospirae、Planctomycetes和Verrucomicrobia；李翠霞[39]通過對Oenococcus的分離鑒定得出，Oenococcus在葡萄酒乳酸發(fā)酵階段數(shù)量迅速增長成為優(yōu)勢菌屬，并大量存在于葡萄酒中，本研究也證明了Oenococcus并非土壤、葡萄、葡萄葉片中的優(yōu)勢菌。

眾所周知，酵母菌是葡萄酒釀造的靈魂，直接決定了葡萄酒的風(fēng)味及感官品質(zhì)。目前葡萄酒相關(guān)酵母菌種類繁多，分屬于24 個屬的120 種，幾乎遍及酵母菌的主要屬種，主要有Saccharomyces、Pichia、Candida、Hanseniaspora、Schizosaccharomyces、Dekkera、Metschnikowia、Issatchenkia、Saccharomycodes、Zygosaccharomyces 10 個屬的酵母，其中最具代表性的為酵母屬。本研究檢測到的Saccharomyces，可以將葡萄漿果中的糖轉(zhuǎn)化成乙醇、CO2及其他代謝產(chǎn)物，在葡萄汁發(fā)酵過程中生成并釋放多種香氣物質(zhì)，同時還對葡萄果實表面的細菌有一定的生物抑制作用[40-41]，一些非釀酒酵母經(jīng)過恰當(dāng)利用控制，還可有效提高葡萄酒風(fēng)味及復(fù)雜性[42-44]。在真菌微生物中，受貴腐霉菌侵染的葡萄所釀造的貴腐葡萄酒，風(fēng)味與其他葡萄酒迥然不同，口味獨特，是一種少見的高檔酒[45]。

與真菌相比，除了部分乳酸菌外，大多數(shù)細菌微生物對于葡萄酒來說都是有害菌，會在不同程度上對葡萄酒的品質(zhì)造成影響，例如檢測到的Proteobacteria，醋酸菌是葡萄酒釀造中典型的有害菌[46]，它能夠?qū)⒁掖嫁D(zhuǎn)化成乙酸，導(dǎo)致葡萄酒酸敗甚至變質(zhì)。因此，在釀造過程的各個階段都應(yīng)該盡可能避免或減少細菌侵染，并且跟蹤監(jiān)測葡萄酒中的微生物狀況，以確保葡萄酒的良好品質(zhì)。葡萄酒相關(guān)細菌主要為乳酸菌和醋酸菌，乳酸菌有酒球菌屬（Oenococcus）、乳桿菌屬（Latobacillus）、明串珠菌屬（Leuconostoc）、片球菌屬（Pediococcus），其中酒類酒球菌（Oenococcusoeni）是進行蘋果酸-乳酸發(fā)酵（malate fermentation，MLF）的主要菌種，部分短乳桿菌、植物乳桿菌也可以引發(fā)蘋乳發(fā)酵[47-48]，本研究檢測到的Firmicutes，發(fā)生MLF后可以有效的降低葡萄酒酸度，避免葡萄酒在裝瓶、貯存期間發(fā)生二次發(fā)酵，增加葡萄酒的微生物學(xué)穩(wěn)定性，乳酸菌的代謝可以改變葡萄酒中醛類、酯類等呈香物質(zhì)和氨基酸、有機酸、維生素等微量元素的成分及含量，從而影響葡萄酒的感官品質(zhì)[49-50]。

傳統(tǒng)培養(yǎng)方法結(jié)合PCR如限制片段長度多態(tài)性分析、隨機擴增多態(tài)性分析技術(shù)及一些非培養(yǎng)方法如變性梯度凝膠電泳、實時熒光PCR技術(shù)和熒光原位雜交技術(shù)存在費力、耗時、結(jié)果可靠性差等缺陷[51-53]，本研究利用高通量測序技術(shù)通量高、產(chǎn)生數(shù)據(jù)量大、測序周期短、準確率高以及成本低等在微生物多樣性研究中具有的優(yōu)越性，將該技術(shù)運用于葡萄酒微生物多樣性分析，研究表明，良好的環(huán)境有利于大多數(shù)微生物的生長，影響著土壤、葡萄、葡萄葉片中微生物群落多樣性。從樣品種類來說，土壤比葡萄、葡萄葉片中的真菌和細菌種類多、數(shù)量多，早期研究表明，葡萄園土壤可以說是一個天然的微生物菌庫[54]，它提供著微生物生長所需要的營養(yǎng)，如碳源（氨基酸、有機酸和碳水化合物）、氮源和生長因子等[55]，其本身的理化性質(zhì)如質(zhì)地、礦物成分、有機質(zhì)等，直接影響著微生物的生長和分布，而施肥、耕作、種植等不同葡萄園管理方式及重金屬、有機污染物、工廠廢棄物等外部因素又可能會影響土壤的物理化學(xué)性質(zhì)，從而改變微生物群落的組成和分布[56-62]。從樣品所在地區(qū)來說，A、B地區(qū)冬季嚴寒、干燥，夏季酷熱，C地區(qū)氣候條件相對較溫和，冬季寒冷，夏季炎熱，3 個葡萄園日照充裕，晝夜溫差大，降水量少，病蟲害少，均為種植釀酒葡萄的優(yōu)質(zhì)產(chǎn)區(qū)。但C地區(qū)微生物多樣性低于A、B地區(qū)，其原因主要在于C地區(qū)的氣候條件，春季及早夏的大風(fēng)、沙塵天氣，嚴重影響著微生物的生長[63-64]。

本研究通過檢測分析新疆A、B、C 3 個地區(qū)葡萄園土壤、葡萄和葡萄葉片中的微生物種類、數(shù)量及分布，對新疆地區(qū)葡萄酒相關(guān)微生物群落多樣性有了一定的了解，為揭示新疆地區(qū)葡萄酒相關(guān)微生物多樣性、建立葡萄酒微生物種質(zhì)資源庫、篩選優(yōu)良品種、提高葡萄酒品質(zhì)等方面提供了理論支持。

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