骨骼肌晝夜節(jié)律分子鐘機制的研究進展

閆銀弟 羅旭光 楊艷萍 李海榮 曹錫梅

山西醫(yī)科大學(xué)（太原 030001）

生物體以時間為周期所表現(xiàn)出的規(guī)律性的機體活動變化模式稱為生物節(jié)律，又稱近日節(jié)律。節(jié)律性是從低等的單細胞生物到人類的保守的進化特征［1］，并且參與調(diào)控基因的表達［2］。生命活動表現(xiàn)出以24 h為周期的變動稱為晝夜節(jié)律［3］。已有的研究普遍認為，晝夜節(jié)律受控于中樞下丘腦視交叉上核［4］。該節(jié)律由分子鐘驅(qū)動，分子鐘存在于生物體幾乎所有的細胞，包括核心鐘基因BMAL1（brain and muscle ARNT?like protein 1）、CLOCK（circadian locomotor output cycles kaput）、Per1/2（period1/2）和 Cry1/2（cryptochrome1/2）。但是關(guān)于外周組織晝夜節(jié)律的研究相對較少，如骨骼肌和心臟。本文闡述骨骼肌晝夜節(jié)律分子鐘機制的相關(guān)性研究，將有助于進一步研究骨骼肌發(fā)育分化，為維持骨骼肌的健康提供一個新思路。

1 晝夜節(jié)律的分子鐘機制

長期以來，多數(shù)學(xué)者認為中樞下丘腦視交叉上核的晝夜節(jié)律控制著外周組織器官的節(jié)律性，如骨骼肌，并使其保持同步［5?6］。小鼠眼睛接受光刺激后，通過神經(jīng)信號傳播到中樞視交叉上核，以分層方式同步中樞和外周分子鐘［7］。當(dāng)損毀中樞下丘腦視交叉上核后并不會中斷外周組織的晝夜節(jié)律，僅使這些組織之間去同步化［8］。已知晝夜節(jié)律不僅控制睡眠和清醒狀態(tài)、胃排空時間，而且還參與調(diào)節(jié)心情、認知、感覺敏銳度、呼吸節(jié)律、體溫等。循環(huán)系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)也會受到晝夜節(jié)律的調(diào)節(jié)，如心率和血壓［9］。小鼠肝臟和骨骼肌中的數(shù)百種基因具有晝夜節(jié)律表達模式［10］。那么中樞晝夜節(jié)律和外周組織的功能活動有怎樣的聯(lián)系呢？

哺乳動物中大多數(shù)轉(zhuǎn)錄因子以時間依賴的方式激活或者抑制表達基因的靶基因，其中BMAL1、CLOCK、Per1/2和Cry1/2轉(zhuǎn)錄翻譯反饋機制是核心［11］。作為主要的調(diào)節(jié)子，BMAL1與CLOCK形成二聚體，結(jié)合靶基因啟動子區(qū)的E?box（CACGTG）誘導(dǎo)靶基因的表達。如 Period（Per1和Per2）和Cryptochrome（Cry1和Cry2）被BMAL1/CLOCK二聚體激活。反過來Per和Cry形成復(fù)合物反饋抑制BMAL1/CLOCK二聚體的活性［4］。分子鐘幾乎存在于生物體所有的細胞，維持正常的晝夜節(jié)律對生物體的生命活動具有十分重要的作用。此外，其他調(diào)控回路作為補充，進一步鞏固加強分子鐘的功能，包括核受體Rev?erbα（Nr1d1）、Rev?erbβ（Nr1d2）和 RORα（Nr1f1）。BMAL1/CLOCK 二聚體復(fù)合物能夠直接誘導(dǎo)上述核受體的表達；核受體Rev?erbα則競爭BMAL1啟動子元件從而控制該基因的節(jié)律性表達［12］。缺失 RORα的小鼠表現(xiàn)出異常的晝夜節(jié)律［13］。不同的是 Rev?erbα/β激活BMAL1的轉(zhuǎn)錄而RORα抑制BMAL1的轉(zhuǎn)錄［4］。分子鐘還能夠通過翻譯后修飾，如磷酸化、乙酰化、泛素化等作用，進一步調(diào)節(jié)晝夜節(jié)律［14］。酪蛋白激酶（CK1ε）、分裂原蛋白激酶（MAPK）和糖原合成酶激酶（GSK?3β）均是分子鐘磷酸化作用的組件，通過泛素化作用能夠控制轉(zhuǎn)錄的激活與抑制［14］。翻譯后修飾如組蛋白乙酰化或去乙?；?，控制分子鐘方面發(fā)揮著重要作用［14］。在小鼠肝臟，組蛋白脫乙酰化酶3（histone deacetylase 3，HDAC3）調(diào)控靶基因組DNA顯示出周期性節(jié)律；核受體Rev?erbα募集HDAC3定位到靶基因保證肝細胞的正常脂代謝，若敲除 Rev?erbα或 HDAC3導(dǎo)致肝脂肪變性［14］；當(dāng)小鼠缺失Rev?erbα基因?qū)е轮|(zhì)代謝異常，促進飲食誘導(dǎo)的肥胖并改變誘發(fā)糖尿病的血糖和血脂利用之間的平衡［15］。當(dāng)小鼠禁食時，肝臟和脂肪組織的脂質(zhì)代謝改變，需要與骨骼肌協(xié)同工作，才能維持葡萄糖平衡［14］。

2 骨骼肌發(fā)育分化中肌調(diào)節(jié)因子發(fā)揮的作用

肌調(diào)節(jié)因子（myogenic regulatory factors，MRFs）表達于骨骼肌的成肌細胞，是一組具有堿性螺旋?環(huán)?螺旋（basic helix?loop?helix，bHLH）結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子，包括MyoD、Myf5、myogenin 及 Myf?6［16］。該調(diào)節(jié)因子均含有 E 蛋白，能夠結(jié)合目的基因調(diào)節(jié)區(qū)的E?box，在成肌細胞的分裂增殖及分化為成熟骨骼肌細胞中起決定作用?；蚯贸∈箫@示，Myf5和MyoD在肌發(fā)育早期發(fā)揮作用，賦予中胚層前體細胞肌源性命運［17］；Myf6在肌發(fā)育早期和晚期均發(fā)揮作用［18］，并在Myf5：MyoD雙敲除小鼠（Myf5：Myod double?null mice）肌源性測定和分化中發(fā)揮作用［18］。myogenin是骨骼肌形成過程中關(guān)鍵的調(diào)節(jié)因子，在肌發(fā)育晚期發(fā)揮作用并呈節(jié)律性表達［19］。

骨骼肌細胞的發(fā)育分化是多因素參與并受嚴格調(diào)控的復(fù)雜生物學(xué)過程。蛋白精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶Prmt5發(fā)揮作用轉(zhuǎn)錄激活基因myogenin啟動子區(qū)是表達desmin、α?骨骼肌肌動蛋白（sketal α?actin）和骨骼肌細胞分化所必需的［20］。而desmin等骨骼肌標志性蛋白的表達需要骨骼肌調(diào)節(jié)因子MyoD的激活［21］，MyoD調(diào)節(jié)肌細胞的分化又依賴于蛋白精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶Prmt5［20］。為使機體更適應(yīng)于日常環(huán)境的變化，分子鐘驅(qū)動的晝夜節(jié)律接近于24 h，破壞該節(jié)律則有害于骨骼肌的健康［8］；如果晚上嚴格禁食，MyoD和myogenin在骨骼肌的表達顯著上調(diào)［19］。然而在小鼠胚胎發(fā)育晚期（E16.5d到E19.5d），神經(jīng)支配的伸長肌MyoD和myogenin下調(diào)；神經(jīng)支配的比目魚肌MyoD下調(diào)、myogenin表達水平保持不變［22］。骨骼肌成肌細胞分化過程中許多新基因的有效表達需要myogenin［23］。myogenin基因敲除小鼠的骨骼肌成肌細胞難以分化成正常的肌纖維，并表現(xiàn)為出生后高致死率［24］?？梢姽趋兰“l(fā)育分化過程中肌調(diào)節(jié)因子是必需的而且其調(diào)節(jié)具有特殊性。

3 鐘基因BMAL1/CLOCK對骨骼肌肌調(diào)節(jié)因子的調(diào)控作用

骨骼肌是人體的主要器官之一，約占體質(zhì)量的40%，參與維持姿勢、運動和呼吸。同時，它也是主要的代謝器官，具有內(nèi)分泌功能，對胰島素敏感［4］。胚胎發(fā)育過程中骨骼肌開始形成，出生后進一步發(fā)育成熟，具有特殊的收縮功能以及新陳代謝功能［4］。成人骨骼肌可以分為快肌纖維和慢肌纖維，慢肌纖維如比目魚肌和膈肌，含有大量的線粒體，收縮速度慢、收縮力小、持續(xù)時間較長，與有氧運動有關(guān)；快肌纖維如趾長伸肌，特點與慢肌纖維恰好相反，幾乎不含線粒體，收縮速度快、收縮力較大、持續(xù)時間較短。然而，骨骼肌纖維類型是在出生以后才建立，并保留可塑性，受外界刺激調(diào)節(jié)。運動參與調(diào)節(jié)骨骼肌功能，耐力運動促進向慢肌纖維轉(zhuǎn)換，力量運動則促進向快肌纖維轉(zhuǎn)換。運動還可以控制生物體的能量平衡，影響全身的晝夜節(jié)律［25］。提示晝夜節(jié)律和骨骼肌健康、正常的功能維持相關(guān)。

已知小鼠骨骼肌中至少有215個基因具有晝夜節(jié)律表達模式［8，26］，這些基因不僅僅參與構(gòu)成核心分子鐘，如BMAL1、Nr1d1、Nr1d2、Per2，而且還參與骨骼肌的功能和代謝。利用特異性基因缺失小鼠觀察核心分子鐘基因?qū)趋兰〉挠绊懀築MAL1?/?小鼠以及 CLOCKΔ19小鼠壽命顯著縮短，提前出現(xiàn)衰老的特征，如肌纖維張力減弱；電鏡觀察可見肌絲結(jié)構(gòu)紊亂、線粒體體積變?。?7］。Rev?erbα缺失小鼠表現(xiàn)出運動能力低下，可能與線粒體的發(fā)生和活性缺失有關(guān)［28］；Per2缺失小鼠的運動耐力和運動能力均降低［4］。特異性誘導(dǎo)小鼠骨骼肌BMAL1缺失導(dǎo)致骨骼肌總重量增加，但是肌力明顯減弱，而BMAL1?/?小鼠骨骼肌的總重量減少［4］。提示鐘基因參與影響骨骼肌的代謝和健康。

有研究表明肌調(diào)節(jié)因子與分子鐘基因之間存在聯(lián)系。野生型小鼠骨骼肌MyoD1的表達呈周期性波動，當(dāng)突變CLOCK后MyoD1周期性波動消失；若缺失BMAL1，MyoD1的周期性波動也同樣消失［29］。BMAL1/CLOCK二聚體能結(jié)合到MyoD1啟動子，誘導(dǎo)MyoD1周期性波動表達［4］。已知MyoD?/?小鼠與BMAL1?/?和CLOCKΔ19小鼠有相似的特點：骨骼肌張力降低、肌絲結(jié)構(gòu)紊亂［26］。BMAL1與CLOCK結(jié)合MyoD啟動子區(qū)域的核心增強子改變MyoD靶基因的表達，表明MyoD是BMAL1與CLOCK的控制基因［4］。然而BMAL1與CLOCK缺失小鼠的骨骼肌形成正常，提示存在補償機制，如MyoD突變小鼠中觀察到肌調(diào)節(jié)因子Myf5發(fā)揮補償調(diào)節(jié)作用［30］。觀察馬和斑馬魚的骨骼肌，可見肌調(diào)節(jié)因子Myf6與BMAL1、CLOCK表達高峰呈現(xiàn)出同步的晝夜節(jié)律［31］，提示肌調(diào)節(jié)因子受鐘基因的調(diào)控。BMAL1與CLOCK除參與調(diào)控MyoD1的表達，BMAL1還參與Wnt信號通路轉(zhuǎn)錄控制肌分化［6］。胚胎發(fā)育過程中，Wnt信號通路在骨骼肌分化過程中發(fā)揮著重要作用，構(gòu)成鐘基因和肌分化的橋梁［32］。

4 討論

骨骼肌作為人體的主要器官，其結(jié)構(gòu)和功能變化與疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，如常見的心血管疾病和癌癥都伴隨著骨骼肌質(zhì)量的減輕、肌力減弱和代謝異常［33］。晝夜節(jié)律和分子鐘機制調(diào)節(jié)骨骼肌大量基因的表達，其中許多基因還參與轉(zhuǎn)錄、肌發(fā)生分化和新陳代謝［29］，晝夜節(jié)律紊亂可能會損害骨骼肌的健康。正常情況下，骨骼肌和其他組織協(xié)同工作，保持一致的晝夜節(jié)律。缺失核心鐘基因BMAL1導(dǎo)致肌組織嚴重病變，如肌纖維型轉(zhuǎn)變、肌節(jié)結(jié)構(gòu)異常等［14］。肌節(jié)是骨骼肌的基本結(jié)構(gòu)和功能單位，位于相鄰兩條Z線之間的一段肌原纖維，其中Z線是由多種蛋白組成的復(fù)雜結(jié)構(gòu)［34］。已知Z線相關(guān)蛋白Tcap（Titin cap，telethonin）參與調(diào)節(jié)正常肌節(jié)的發(fā)育。Tcap能夠與Titin N末端結(jié)構(gòu)域結(jié)合，作為Titin激酶的底物，與Titin相互作用保證肌節(jié)的完整性［34］。胚胎發(fā)育過程中，肌調(diào)節(jié)因子MyoD、myo?genin和Mfy5能夠結(jié)合到Tcap啟動子區(qū)域的E?box，控制Tcap的表達，影響骨骼肌肌節(jié)的結(jié)構(gòu)及完整性［35］。骨骼肌成肌細胞C2C12分化過程中Tcap的表達顯著上調(diào)，并呈明顯的周期性節(jié)律，通過RNA干擾（RNA interference）敲低Tcap則抑制C2C12的分化及生長［36］。BMAL1/CLOCK二聚體能夠促進Tcap表達，BMAL1/CLOCK二聚體結(jié)合MyoD啟動子協(xié)同增強促進Tcap的表達。胚胎發(fā)育過程中Myogenin也參與調(diào)節(jié)Z線組成蛋白［37］，促進Tcap表達。綜上，研究骨骼肌晝夜節(jié)律分子鐘機制將有助于明確分子鐘基因在骨骼肌發(fā)育分化過程中的作用及對骨骼肌功能和代謝的影響，為維持骨骼肌的健康提供新思路，對研究因為晝夜節(jié)律紊亂引發(fā)的疾病也有一定的指導(dǎo)意義。

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