羊肚菌化學(xué)成分分析與對(duì)羥基苯甲醇的含量測(cè)定＊

李 湜，汪鋆植,3＊＊，張 盼，劉蘭慶，李平媛，鄧改改，賀海波,2

（1.三峽大學(xué)天然產(chǎn)物研究與利用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 宜昌 443002；2.湖北省土家族醫(yī)藥研究所 宜昌 443002；3.湖北省生物酵素工程技術(shù)研究中心 宜昌 443002）

羊肚菌，又名羊肚蘑、編笠菌，來源于羊肚菌科Morchellaceae羊肚菌 Morchella esculenta （L.）Pers的子實(shí)體[1]。因其菌蓋凹凸不平、狀如羊肚而名。羊肚菌是一種珍貴的食、藥用菌，具有較高的藥用和食用價(jià)值。我國(guó)對(duì)羊肚菌的記載最早見于《本草綱目》[2]，其菜部蘑菰蕈綱目記載：一種狀如羊肚，有蜂窠眼者，名羊肚菜。現(xiàn)代本草專著《中華本草》[3]及《新華本草綱要》對(duì)羊肚菌藥理作用有詳細(xì)論述，其味甘，性平。有和胃消食，化痰理氣的功能。用于消化不良、痰多氣短。

羊肚菌屬共有28個(gè)種，分布于世界各地，在我國(guó)主產(chǎn)于甘肅、湖南、青海、云南、新疆、四川、山西等地。羊肚菌肉質(zhì)脆嫩鮮美，營(yíng)養(yǎng)豐富，是一種珍稀的食、藥兩用真菌，有“素中之葷”的美稱。近年來，羊肚菌受到了國(guó)內(nèi)外學(xué)者的廣泛重視，研究?jī)?nèi)容主要涉及資源種類，地理分布，生長(zhǎng)環(huán)境，栽培技術(shù)，化學(xué)成分及藥理活性。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，羊肚菌的蛋白質(zhì)和氨基酸含量豐富，不飽和脂肪酸含量非常高。羊肚菌的蛋白質(zhì)含量比木耳多1倍，所含氨基酸中人體所需8種必需氨基酸占總量的47.47%[4]。羊肚菌蛋白質(zhì)具有葡聚糖裂解酶[5]和脂氧合酶活性[6]以及抑制血小板聚集等多種作用，是營(yíng)養(yǎng)和功能性食品開發(fā)的良好基料。而且其蛋白溶液有一定的抗氧化能力，對(duì)DPPH自由基的清除作用良好，與VC相近[7]。同時(shí)羊肚菌礦物元素含量豐富、種類齊全，含人體必需的鉀、磷、鈣等常量元素很高，人體必需的微量元素Fe，Mn，Zn等也很高。這些礦質(zhì)元素中Zn的含量是最高的[8]，Zn是人體必需的微量元素，能促進(jìn)人體生長(zhǎng)發(fā)育和增強(qiáng)人體免疫機(jī)能，食品中以游離態(tài)存在的鋅不易被人體吸收，且一般游離態(tài)的金屬均具有一定毒性。利用真菌富集功能，將無機(jī)鋅與蛋白、糖等物質(zhì)結(jié)合成有機(jī)鋅蛋白和鋅多糖等大分子活性物質(zhì)。而羊肚菌菌絲體具有較強(qiáng)的耐鋅能力和富鋅能力[9]。羊肚菌中硒元素含量較為豐富，高達(dá)5.16 mg?kg-1[10]。硒是人體紅細(xì)胞谷胱甘肽過氧化酶的組成成分，可運(yùn)輸大量氧分子用來抑制惡性腫瘤，使癌細(xì)胞失活；另一方面能加強(qiáng)維生素E的抗氧化作用[11]。羊肚菌所含的多糖成分也具有很高的藥用價(jià)值，具有升高白細(xì)胞的數(shù)量、提高免疫功能、抗癌、抗菌、預(yù)防艾滋病等多種功效。除此之外，研究表明羊肚菌提取物具有抗癌、降低毒性腎損傷、抗實(shí)驗(yàn)型胃潰瘍等活性。因此，羊肚菌在食品藥品領(lǐng)域具有極大的開發(fā)潛力和廣闊的應(yīng)用前景。

近年來國(guó)內(nèi)、外對(duì)羊肚菌成份的報(bào)道較多地是營(yíng)養(yǎng)成分,主要集中在多糖、酶類、氨基酸、吡喃酮抗生素、脂肪酸類等幾個(gè)大的方面，對(duì)活性單體成分的研究鮮有報(bào)道，在一定程度上限制了羊肚菌的開發(fā)應(yīng)用。鑒于上述原因，研究并探索羊肚菌子實(shí)體的化學(xué)成分十分必要。明確羊肚菌有效成分和有效部位，為更好地體現(xiàn)其藥用價(jià)值，促進(jìn)羊肚菌的利用，都具有十分重要的意義。本實(shí)驗(yàn)針對(duì)羊肚菌的成分進(jìn)行了分離、純化和結(jié)構(gòu)鑒定，確定活性化合物，并采用HPLC法對(duì)主要活性成分含量進(jìn)行測(cè)定，為進(jìn)一步開發(fā)利用羊肚菌奠定基礎(chǔ)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

HEV-50型自動(dòng)滅菌鍋（日本HIRAYAMA公司）；Bruker AV 400核磁共振波譜儀（瑞士布魯克公司）；SB-100旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（日本EYELA公司）；DIONEX 3000液相色譜儀（美國(guó)Thermo公司）；Cosmail C18（4.6 mm×250 mm）色譜柱（日本NACALAI TESQUE,INC）；低溫冷凍干燥機(jī)（美國(guó)Labconco公司）。

1.2 材料

0.45 μm尼龍膜針筒過濾器（天津津騰）；薄層色譜板（煙臺(tái)市化學(xué)工業(yè)研究所）；甲醇（色譜純，美國(guó)Thermo公司）；其它試劑均為分析純（天津科密歐試劑）；羊肚菌子實(shí)體，由宜昌市農(nóng)科院提供，經(jīng)劉世林研究員鑒定為羊肚菌Morchella esculenta （L.）Pers。

2 方法與結(jié)果

2.1 提取與分離

羊肚菌新鮮子實(shí)體干燥粉碎后得到0.8 kg的粉末，用3 L95%的乙醇于熱水浴中提取3次，每次3 h。乙醇提取液減壓濃縮至無醇味，使用純水溶解醇提物浸膏，并使用1∶1的石油醚多次萃取，直至石油醚層無明顯顏色，得到石油醚提取物，然后使用乙酸乙酯萃取，得到乙酸乙酯提取物，最后再用正丁醇萃取后得到正丁醇提取物。石油醚萃取物浸膏經(jīng)硅膠柱層析，以石油醚-乙酸乙酯（1∶0-0∶1，V/V）進(jìn)行梯度洗脫得到4部分（Fr.1-Fr.4），再經(jīng)硅膠柱（石油醚-乙酸乙酯（3∶1））層析分離純化得到化合物1、2。乙酸乙酯萃取物浸膏經(jīng)硅膠柱層析，以氯仿-甲醇（1∶0-0∶1，V/V）進(jìn)行梯度洗脫，后經(jīng)1次凝膠柱（氯仿-甲醇（1∶1））層析分離純化得化合物3、4。正丁醇部位用水飽和的正丁醇做洗脫劑，制備得到化合物5。

2.2 結(jié)構(gòu)鑒定

通過核磁鑒定，分離得到的五個(gè)單體化合物分別為11,15,19-三甲基-5,9,-二十碳二烯酸（11,15,19-trimethyl-5,9-eicosadienoic acid）[12]、順-13-二十二碳烯酸（cis-13-Docosenoic acid&Erucic acid）[13]、對(duì)羥基苯甲醇（4-Hydroxybenzyl alcohol）[14]、5,7,22-三烯-3β-羥基-麥角甾醇（Ergosta-5,7,22-triene-3β-ol）[15]和甘露醇（Mannitol）[16]，結(jié)構(gòu)式（圖1-5）。

11,15,19 -三甲基-5,9,-二十碳二烯酸:1H NMR（400 MHz,CDCl3）δ：5.43 （2H,m）,5.36 （1H,m）,5.25（1H,m）,2.25 （4H,m）,2.10 （1H,m）,2.03 （3H,m）,1.69（3H,m）,1.54 （1H,m）,1.31 （5H,m）,1.13 （8H,m）,0.89（12H,m）;13C-NMR （100 MHz，CDCl3）δ：179.49 （C-1）,33.953 （C-2）,24.683 （C-3）,27.171 （C-4）,130.018 （C-5）,128.061 （C-6）,29.021 （C-7）,29.062 （C-8）,127.897（C-9）,130.439 （C-10）,31.913 （C-11）,31.913 （C-12）,29.127 （C-13）,29.334 （C-14）,31.516 （C-15）,29.343（C-16）,31.516 （C-17）,29.575 （C-18）,29.678 （C-19）,22.499 （C-20）,14.043 （C-21）,14.095 （C-22）,22.555 （C-23）。

圖1 11,15,19-三甲基-5,9,-二十碳二烯酸

圖2 順-13-二十二碳烯酸

順-13-二十二碳烯酸：1H NMR （400MHz,CDCl3）δ：5.79 （1H,br.s,OH）,5.35 （2H,t,J=5.1Hz）,2.29 （2H,t,J=7.5 Hz,CH2COOH）,1.95 （2H,H-15）,1.95 （2H,H-12）,1.29 （CH2）,0.88 （3H,t,J=6.9 Hz）;13C-NMR（100 MHz，CDCl3）δ：179.935 （C-1）,129.713 （C-13）,129.92 （C-14）,34.03 （C-2）,31.91 （C-20）,29.76 （C-11）,29.67 （C-16）,29.58 （C-18）,29.51 （C-19）,29.57 （C-42）,29.35 （C-5）,29.31 （C-6）,29.23 （C-7）,29.13 （C-8）,29.06 （C-11）,29.02 （C-17）,27.20 （C-12）,27.10 （C-15）,24.67（C-3）,22.68 （C-21）,14.11 （C-22）。

對(duì)羥基苯甲醇：1H NMR （400 MHz,CD3OD）δ：7.16（2H,d,J=11.48 Hz）,6.75 （2H,d,J=11.44 Hz）,4.87 （s,2H）,4.48 （s,2H）;13C-NMR （100 MHz,CD3OD）δ：155.483 （C-1）,129.532 （C-4）,129.745 （C-3,-5）,115.0（C-2,6）,62.67（-CH2）。

5,7,22 -三烯-3β-羥基-麥角甾醇：1H NMR（400MHz,CDCl3）δ：5.57 （3H,d,J=3.6Hz）,5.52-5.15（10H,m）,5.13 （1H,s）,3.63 （4H,d,J=4.2Hz）,2.46 （2H,s）,2.28 （2H,s）,1.25-1.05 （6H,m）,1.09-0.67 （9H,m）,063 （7H,s）;13C-NMR （100MHz,CDCl3）δ：37.024 （C-1）,31.944 （C-2）,70.464 （C-3）,40.409 （C-4）,139.75 （C-5）,119.585 （C-6）,116.282 （C-7）,141.355 （C-8）,46.249（C-9）,36.9 （C-10）,21.104 （C-11）,38.371 （C-12）,40.795 （C-13）,54.555 （C-14）,22.99 （C-15）,28.277 （C-16）,55.734 （C-17）,12.041 （C-18）,16.278 （C-19）,39.08（C-20）,21.02 （C-21）,135.56 （C-22）,131.976 （C-23）,42.817 （C-24）,33.084 （C-25）,19.637 （C-26）,19.944（C-27）,17.597 （C-28）。

甘露醇：1HNMR （400MHz,CDCl3）δ：3.75 （2H,dd,H-1b,H-6b）,3.57 （2H,d,J=8.65Hz,H-3,H-4）,3.54（2H,dd,H-1a,H-6a）,3.22 （2H,dd,H-2,H-5）;13CNMR（100MHz,CDCl3）δ：63.80 （C-1,6）,69.66 （C-2,5）,71.23 （C-3,4）。

2.3 羊肚菌中對(duì)羥基苯甲醇的HPLC含量測(cè)定

2.3.1 色譜條件

使用Cosmail C18（4.6 mm×250 mm）色譜柱，流動(dòng)相為甲醇：水=10%∶90%，DAD檢測(cè)器設(shè)定檢測(cè)波長(zhǎng)為220 nm，柱溫為25℃，進(jìn)樣量為10 μL，洗脫程序?yàn)楹闾荻认疵?0 min。

圖3 對(duì)羥基苯甲醇

圖4 5,7,22-三烯-3β-羥基-麥角甾醇

圖5 甘露醇

2.3.2 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取對(duì)羥基苯甲醇標(biāo)準(zhǔn)品5 mg，置于5 mL棕色容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，配置成1 mg?mL-1的對(duì)照品溶液。

2.3.3 供試品溶液的制備

精密稱取羊肚菌樣品粉末（過3號(hào)篩）約1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加入50%乙醇50 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理，放冷，再稱定質(zhì)量，用50%乙醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，濾過，精密量取續(xù)濾液10 mL，濃縮至近干無醇味，使用1 mL甲醇超聲處理10 min溶解后，再用0.45 μm有機(jī)膜濾頭過濾。

2.3.4 線性關(guān)系考察

圖6 對(duì)羥基苯甲醇的標(biāo)準(zhǔn)曲線

表1 不同產(chǎn)地羊肚菌和不同碳源培養(yǎng)的菌絲體中對(duì)羥基苯甲醇的含量

精密稱取對(duì)羥基苯甲醇對(duì)照品適量，然后色譜甲醇精密稀釋成0.8 mg?mL-1、0.6 mg?mL-1、0.4 mg?mL-1、0.2 mg?mL-1、0.1 mg?mL-1、0.05 mg?mL-1、0.01 mg?mL-1和0.001 mg?mL-1對(duì)照品溶液，使用0.45 μm有機(jī)膜濾頭過濾后待用。按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程Y=217.95X-0.003，相關(guān)系數(shù)R2=0.999。由圖5可知，羊肚菌的質(zhì)量濃度在0.01-0.8 mg?mL-1范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.3.5 精密度試驗(yàn)

取對(duì)照品溶液適量，按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，重復(fù)6次，記錄峰面積。結(jié)果，RSD＝1.06%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.3.6 重復(fù)性試驗(yàn)

取本品適量，按“2.3.3”項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，再按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果，RSD＝0.96%（n＝6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.3.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一供試品溶液適量，分別于放置0、2、4、6、8、10、12、24、36、48 h時(shí)按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果，RSD＝0.99%（n＝10），表明供試品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.8 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱取已知對(duì)羥基苯甲醇含量的羊肚菌粉末6份，分別精密加入對(duì)羥基苯甲醇標(biāo)準(zhǔn)品溶液，按“2.3.3”項(xiàng)下方法制成供試品溶液，再按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，平均回收率為98.27%，RSD＝1.84%（n＝ 6）。

2.3.9 樣品含量測(cè)定

取不同產(chǎn)品的羊肚菌子實(shí)體，以及土豆培養(yǎng)基中分別等量加入可溶性淀粉（A）、玉米汁（B）、小麥汁（C）液體發(fā)酵培養(yǎng)的三種菌絲體，按“2.3.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，各進(jìn)樣10 μL，測(cè)定2次，根據(jù)回歸方程計(jì)算樣品中對(duì)羥基苯甲醇的含量，結(jié)果（表1）。

3 討論與結(jié)論

羊肚菌富含多糖、蛋白質(zhì)、黃酮類、多酚類、氨基酸以及微量元素等成分，不僅味美，具有極高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，還具有多種保健功能?，F(xiàn)代研究表明羊肚菌有調(diào)節(jié)免疫[17]、保肝護(hù)腎[18]、抗疲勞[19]、抗衰老[20]、抗腫瘤[21]、降血脂[22]等多種作用。羊肚菌所含的亞油酸和油酸有降低人體膽固醇濃度和降低低密度脂蛋白（LDL），升高高密度脂蛋白（HDL）的功能，有助于預(yù)防動(dòng)脈硬化[23]；羊肚菌多糖具有降血脂，增強(qiáng)免疫功能，抗疲勞、預(yù)防動(dòng)脈硬化的作用，并能減輕癌癥患者放化療引起的毒副作用[24]；黃酮、多酚類、核苷酸等物質(zhì)則具有抗氧化抗腫瘤、預(yù)防、治療佝僂病和機(jī)體各種黏膜炎及皮膚炎等功效。

但對(duì)羊肚菌活性成分的研究還有待深入，既往多項(xiàng)活性的研究，還停留在提取物上，未對(duì)羊肚菌提取物中具體保護(hù)心血管系統(tǒng)的成分詳細(xì)分析報(bào)道。Tomita等[25]從羊肚菌子實(shí)體中提取出具有抗血小板凝集作用的物質(zhì)，其效果比阿斯匹林高出2-3倍，能有效地防治心腦血管血栓的形成。王亞輝等[26]通過建立大鼠高血壓模型后給藥尖頂羊肚菌子實(shí)體提取液，發(fā)現(xiàn)羊肚菌提取液顯著降低了模型大鼠的收縮壓。梅曉燈[27]等發(fā)現(xiàn)，低、高劑量組尖頂羊肚菌活性提取物能顯著地抑制高血壓大鼠的收縮壓升高，這說明羊肚菌提取物具有良好的降血壓作用。諸多的證據(jù)顯示羊肚菌在保護(hù)心血管方面的作用價(jià)值，其組成成分中也必然存在發(fā)揮作用的物質(zhì)基礎(chǔ)，故有必要進(jìn)一步對(duì)羊肚菌保護(hù)心血管系統(tǒng)的活性成分深入研究。

研究表明對(duì)羥基苯甲醇（4-hydroxybenzylalcohol，4-HBA）是羊肚菌的活性成分之一。對(duì)羥基苯甲醇具有多種作用，是天麻的主要活性成分之一，與天麻的抗驚厥、保護(hù)心腦血管及神經(jīng)細(xì)胞、改善學(xué)習(xí)記憶等作用有關(guān)[28]。對(duì)羥基苯甲醇在體外、體內(nèi)均具有顯著的抗血小板聚集活性，其作用機(jī)制可能是通過抑制外鈣內(nèi)流和內(nèi)鈣釋放達(dá)到抑制血小板聚集作用[29]。血小板的活化、聚集是動(dòng)脈粥樣硬化、心肌梗死、中風(fēng)等多種心腦血管疾病的重要發(fā)病機(jī)制之一，因此，對(duì)羥基苯甲醇可能是羊肚菌防治心血管疾病的物質(zhì)基礎(chǔ)之一。

中醫(yī)之“痰”與多種疾病具有密切的關(guān)系，有“廣義”和“狹義”之分。狹義之痰，一般是指肉眼可見之痰，又稱為“外痰”。廣義之痰，泛指因氣化失常產(chǎn)生、遍布周身內(nèi)外的，具有廣泛致病性的病理代謝產(chǎn)物。又稱之為“內(nèi)痰”?！皟?nèi)痰”致病廣泛，出現(xiàn)眩暈、頭身困重、肥胖、氣短、嗜睡、納呆、惡心、舌淡、苔膩、脈濡滑等多種癥狀。是高血壓、治冠心病、腦卒中、血管性癡呆等心腦血管疾?。桓咧Y、脂肪肝、糖尿病等代謝性疾病的危險(xiǎn)因素。因此，從痰論治是中醫(yī)治療多種疾病的方法。具體治法有益氣化痰、溫陽(yáng)化痰、解郁化痰、清熱化痰、溫化寒痰、燥濕化痰、潤(rùn)燥化痰、祛風(fēng)化痰、消積化痰、化痰散結(jié)、化痰開竅等。中醫(yī)認(rèn)為“脾為生痰之源”，在治痰的過程中，十分注重脾胃功能的調(diào)理恢復(fù)，在治痰的過程中常酌選補(bǔ)氣、理氣藥。羊肚菌既能補(bǔ)益脾胃，又能化痰理氣，對(duì)治療“痰”證具有重要意義。本研究為進(jìn)一步研究闡釋羊肚菌化痰理氣等傳統(tǒng)功效的物質(zhì)基礎(chǔ)和現(xiàn)代醫(yī)學(xué)機(jī)制提供了依據(jù)。

由表1可知，對(duì)3個(gè)不同產(chǎn)地羊肚菌子實(shí)體以及不同培養(yǎng)基液體發(fā)酵培養(yǎng)的羊肚菌菌絲體中對(duì)羥基苯甲醇含量進(jìn)行了測(cè)定，發(fā)現(xiàn)不同產(chǎn)地，相同培養(yǎng)方式生產(chǎn)的羊肚菌子實(shí)體中對(duì)羥基苯甲醇含量差異較小，不同培養(yǎng)條件生產(chǎn)的的菌絲體中對(duì)羥基苯甲醇含量差異較大。對(duì)羥基苯甲醇在羊肚菌中含量較高，藥理作用明確，且與其活性相關(guān)聯(lián)，因此，對(duì)羥基苯甲醇可作為羊肚菌質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)之一。本研究所建立的含量測(cè)定指標(biāo)及方法可為羊肚菌的質(zhì)量控制提供參考。

同時(shí)，甘露醇具有利尿脫水、提高血漿滲透壓、抗氧化、抗衰老、鎮(zhèn)咳、祛痰和平喘等多種功效[30,31]，是蟲草及其制品中重要的功能性成分之一[32]，也是評(píng)價(jià)蟲草及其制品質(zhì)量品質(zhì)的重要指標(biāo)[33]，其測(cè)定方法已經(jīng)收載于中國(guó)藥典。因此，甘露醇可以同對(duì)羥基苯甲醇同時(shí)作為羊肚菌的質(zhì)量控制指標(biāo)，以期更好控制羊肚菌的質(zhì)量。