增強耐甲氧西林金黃色葡萄球菌抗生素敏感性的中藥篩選＊

魯 茹，陸桂玉，林浙哲，鄭洪杰，程東慶

（浙江中醫(yī)藥大學醫(yī)學技術(shù)學院 杭州 310053）

耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（Methicillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA）是含有外源性甲氧西林耐藥決定子（methicillin-resistant determinant A，MecA）或者苯唑西林最小抑菌濃度（Minimum inhibitory concentration，MIC）≥ 4 μg·mL-1的金黃色葡萄球菌菌株，是許多國家最常見的導致醫(yī)院獲得性感染的病原體，也是WHO發(fā)布的三種最重要的超級耐藥菌之一，能導致壞死性肺炎、嚴重敗血癥、壞死性筋膜炎等疾病[1,2]，嚴重危害人體健康，據(jù)估計每年大約有十萬人因感染MRSA而住院治療，其防治已成為全球關(guān)注的焦點。MRSA除對甲氧西林耐藥外，對其它所有與甲氧西林相同結(jié)構(gòu)的β-內(nèi)酰胺類和頭孢類抗生素均耐藥，它還可通過改變抗生素作用靶位，產(chǎn)生修飾酶，降低膜通透性產(chǎn)生大量PABA等不同機制[3]，對氨基糖苷類、大環(huán)內(nèi)酯類、四環(huán)素類、氟喹喏酮類、磺胺類、利福平均產(chǎn)生不同程度的耐藥。我國MRSA分離株對慶大霉素、克林霉素、大環(huán)內(nèi)酯類和左氧氟沙星等抗菌藥物的耐藥率基本上都在80%左右[4]，且分離率及多重耐藥呈增加趨勢[5]。目前，可供臨床治療MRSA的藥物非常有限，除傳統(tǒng)的糖肽類抗生素如萬古霉素，及新研發(fā)的抗生素如利奈唑胺及達托霉素外，其他抗生素的效果均不佳。萬古霉素是治療耐甲氧西林金黃色葡萄球菌感染的常見藥物。但隨著萬古霉素的廣泛應(yīng)用，降低了MRSA對萬古霉素的敏感性，且萬古霉素對組織穿透能力有限，其在體外對MRSA的殺菌作用明顯慢于β內(nèi)酰胺類，治療MRSA菌血癥和感染性心內(nèi)膜炎方面的療效顯著低于β內(nèi)酰胺類，殺菌速度比較緩慢，雖MRSA對萬古霉素敏感率相對較高，但臨床效果欠佳[6]。且萬古霉素具有嚴重的耳毒性及腎毒性，因此臨床應(yīng)用受到了較大的限制[7]。目前許多國家（包括中國）均已發(fā)現(xiàn)對萬古霉素耐藥的MRSA[8]，若耐萬古霉素的MRSA廣泛感染，就目前狀況而言無藥可救，因此MRSA已成為臨床和公共衛(wèi)生的公敵，其防治已成為全球關(guān)注的焦點。在耐萬古霉素的MRSA廣泛感染之前，尋找有效抗MRSA的藥物迫在眉睫。

而中藥能夠作為抗菌增敏劑能夠增強耐藥菌對抗生素的敏感性，且至今未發(fā)現(xiàn)中藥耐藥菌。以天然活性產(chǎn)物為先導的抗MRSA藥物研究已有一定歷史，目前中藥逆轉(zhuǎn)耐藥機制作為中藥抗菌研究的一個新的領(lǐng)域已經(jīng)悄然興起，并且取得了不少成就。從MRSA的耐藥機制角度出發(fā)，一些中藥雖不能夠直接殺菌，但能夠從不同方面增強MRSA抗生素敏感性，從而為抗生素殺菌打開MRSA耐藥的束縛。此時，進行中西藥聯(lián)用，篩選出有增敏作用的中藥，使其天然活性成分對細菌進行結(jié)構(gòu)修飾，達到更好的抗菌效果，增加對抗生素的敏感性是目前研究的熱點。

本文選取33種常用中藥制備提取物，作用于臨床分離的MRSA菌株，考察中藥作用前后MRSA對苯唑西林（美國臨床和實驗室標準協(xié)會CLSI建議對苯唑西林MIC≥4 μg·mL-1的金黃色葡萄球菌菌株定義為MRSA）敏感性的變化，旨在篩選能增強MRSA抗生素敏感性的中藥，探索此類中藥與抗生素配伍使用恢復(fù)抗生素的殺菌效力的可行性，為臨床治療MRSA感染提供新思路。

1 材料與方法

1.1 菌株來源

MRSA（271）經(jīng)浙江大學醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院檢驗科分離、鑒定、惠贈；本實驗室保存的對甲氧西林敏感的金黃色葡萄球菌ATCC25923用于質(zhì)控。

1.2 材料

中藥：穿心蓮（廣東）、浙貝母（浙江）、槐花（河北）、射干（安徽）、毛冬青（浙江）、蘆薈（海南）、牡丹皮（安徽）、水飛薊（江蘇）、金銀花（山東）、野菊花（安徽）、連翹（山西）、山楂（山東）、馬齒莧（浙江）、天葵子（湖南）、青黛（福建）、白及（浙江）、魚腥草（興寧）、山核桃葉（浙江）、山楂核（安徽亳州）（均購自浙江中醫(yī)藥大學飲片廠），姜黃素（購自華東醫(yī)藥集團生物工程研究所有限公司）。

培養(yǎng)基：Luria-Bertani培養(yǎng)基，配方為蛋白胨2.50 g、Nacl 1.25 g、瓊脂 3.75-5.00 g、牛肉膏 0.75 g、蒸餾水250 mL，調(diào)節(jié)PH為7.3 Ml；5.1倍MH肉湯，配方為可溶性淀粉0.38 g、NaCl 0.20 g、酸水解酪蛋白4.38 g、牛肉浸膏0.75 g、蒸餾水250 mL，調(diào)節(jié)PH至7.3 mL蛋白；2倍MH肉湯，配方為可溶性淀粉0.76 g、NaCl 0.20 g、酸水解酪蛋白8.76 g、牛肉浸膏1.50 g、蒸餾水250 mL，調(diào)節(jié)PH至7.3 mL蛋白。鈣離子調(diào)節(jié)的MH肉湯培養(yǎng)基（CAMHB）是在MH的基礎(chǔ)上加CaCl2，使其Ca2+濃度達到0.05 mg·mL-1（應(yīng)用于苯唑西林需另加2%NaCl）。

1.3 儀器設(shè)備

II級生物安全柜（1300 SERIES A2，美國Thermo公司），細菌濁度儀（WGZ-2XJ，上海昕瑞儀器儀表有限公司），臺式連續(xù)投料粉碎機（DF-20，溫嶺市大林儀器公司），電子精密天平（PL602E/02，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司），超低溫冰箱（Thermo Scientific Forma 994），恒溫電熱套（TC-5，海寧市華星儀器廠），旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（RE-52AA，上海亞索生化儀器廠），智能生化培養(yǎng)箱（SPX-280，寧波海曙賽福實驗設(shè)備有限公司）等。

1.4 方法

1.4.1 水煎法制備中藥提取液[9]

稱取25.00 g中藥，研磨切碎，加500 mL蒸餾水，文火煎30 min，過濾；濾渣加500 ml蒸餾水，重復(fù)操作，合并2次濾液并2000 r·min-1離心，上清液加熱濃縮至25 mL，即得1.00 g·mL-1中藥水提物。臨用前用蒸餾水1∶100倍稀釋，再用肉湯倍比稀釋成6個濃度。

1.4.2 醇提法制備中藥提取液[10]

稱取25.00 g中藥，加250 mL 95%乙醇，加熱回流4 h，過濾，濾液2500 r·min-1離心，上清液旋蒸至干。用二甲基亞砜（DMSO）溶解中藥醇提物制得母液，再加入生理鹽水注溶。滅菌后用肉湯將其倍比稀釋成6個濃度。

1.4.3 苯唑西林溶液制備[11]

取苯唑西林鈉一水合物溶于蒸餾水，得5120 μg·mL-1濃度的苯唑西林母液。

臨用前用CAMHB將苯唑西林母液稀釋。

1.4.4 菌液制備[12]

將菌種接種于LB培養(yǎng)基中，于37℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18-24 h，用生理鹽水配制0.5麥氏濁度菌液，再用CAMHB稀釋100倍，相當于菌液濃度為106CFU·mL-1。

1.4.5 中藥作用前菌株對苯唑西林的MIC測定

參照CLSI 2017標準方法[11]，通過微量液體法：將倍比稀釋后不同濃度的苯唑西林溶液分別加到96孔聚苯乙烯板中，每孔100 μL，設(shè)復(fù)孔。再在每孔中加100 μL所制得的菌液，最終藥物濃度分別為1024、512、256、128、64、32 μg·mL-1。密封后置于34℃生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)16-20 h后，觀察各孔是否出現(xiàn)渾濁，以肉眼觀察板條中不長菌的孔所對應(yīng)的最低藥物濃度為MIC。最終測定苯唑西林對MRSA（271）、ATCC25923的MIC。

1.4.6 菌株對中藥提取物的MIC測定

采用微量肉湯稀釋法，將倍比稀釋后不同濃度的中藥液分別加到96孔聚苯乙烯板中，每孔100 μL，設(shè)復(fù)孔。再在每孔中加100 μL所制得的菌液，密封后置于34℃生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)16-20 h后，觀察各孔是否出現(xiàn)渾濁，以肉眼觀察板條中不長菌的孔所對應(yīng)的最低藥物濃度為MIC。顏色較深的孔可在LB平板上點種加以驗證[13]。

1.4.7 中藥提取物對苯唑西林MIC的影響作用

選取對實驗菌株沒有抑制作用的最大濃度作為各提取物的起始工作濃度，適當稀釋后與MRSA新鮮培養(yǎng)物（106CFU·mL-1）共同培養(yǎng)，微量液體法測定苯唑西林的MIC，設(shè)陽性對照（只加菌液與肉湯）、陰性對照（只加肉湯），每一試驗設(shè)2個復(fù)孔。34℃培養(yǎng)24 h，記錄MIC。中藥提取物作用前后苯唑西林的MIC經(jīng)過對數(shù)變換后進行配對t檢驗[14,15]，判斷中藥提取物增敏作用實驗前后MRSA（271）對苯唑西林的敏感性有無差異（P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義）。

1.4.8 有效中藥提取物的量效關(guān)系的確定

選出具有增敏作用中藥，以增敏實驗時的有效濃度為起始濃度，進行10%梯度稀釋。在96孔聚苯乙烯板中橫排從左向右依次加50 μL倍比稀釋的苯唑西林溶液（2048、1024、512、256、128、64 μg·mL-1）。豎排從上向下依次加50 μL10%梯度稀釋的中藥稀釋液，再在每孔中加入100 μL所制得的菌液，做復(fù)孔。密封后置于34℃生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)16-20 h后，觀察各孔是否出現(xiàn)渾濁，以肉眼觀察板條中不長菌的孔所對應(yīng)的最低藥物濃度為MIC，記錄中藥作用前后MIC，以MIC降低率（式1）為判斷指標，選出中藥有效濃度范圍。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌種耐藥性測定結(jié)果

根據(jù)美國臨床實驗室標準化委員會標準規(guī)范，MIC ≥ 4 μg·mL-1為耐藥，MIC ≤ 2 μg·mL-1為敏感，參照CLSI 2017標準方法[11]，測得苯唑西林對MRSA（271）的MIC 為 128-512 μg·mL-1，為 耐 藥 菌 ；對 MSSA（ATCC25923）的MIC為0.25 μg·mL-1，為敏感菌，用于質(zhì)控。

2.2 增敏作用實驗結(jié)果

所選的33種提取物中測得13種中藥提取物對MRSA（271）的MIC為：連翹醇提物14.0 mg·mL-1，馬齒莧醇提物320.5 mg·mL-1，魚腥草醇提物140.5 mg·mL-1，射干醇提物283.5 mg·mL-1，野菊花醇提物224.0 mg·mL-1，槐花醇提物 240.0 mg·mL-1，牡丹皮醇提物48.3 mg·mL-1，水飛薊醇提物129.0 mg·mL-1，青黛醇提物1078.0 mg·mL-1，蘆薈醇提物18.3 mg·mL-1，毛冬青醇提物 17.1 mg·mL-1，山楂醇提物 66.5 mg·mL-1，白及醇提物78.0 mg·mL-1。其余20種中藥提取物在實驗中未測得MIC，對MRSA（271）無抑制作用。

為排除增敏作用實驗時中藥本身抑菌作用對實驗結(jié)果的影響，選取中藥提取物對實驗菌株沒有抑制作用時的最大濃度作為各提取物的起始工作濃度?？偣策M行三次重復(fù)實驗，以中藥提取物作用前后苯唑西林MIC的改變?yōu)橹笜?，根?jù)不同中藥提取物各自對MRSA（271）的增敏作用實驗前后苯唑西林MIC的變化，采用配對t檢驗（P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義），判斷中藥提取物增敏作用實驗前后MRSA（271）對苯唑西林的敏感性有無差異，即中藥提取物對MRSA（271）是否具有增敏作用。

研究中藥增強細菌對抗生素敏感性的作用，發(fā)現(xiàn)白及醇提物能夠降低MIC（P＜0.05），即白及醇提物能夠增強MRSA（271）對苯唑西林的敏感性（表1）。

2.3 增敏中藥提取物的量效關(guān)系

選取具有增敏作用的白及醇提物為對象，采用10%梯度稀釋法，使白及醇提物濃度為39.0、37.0、35.1、33.2、31.2、29.2、27.3、25.4、23.4、21.4、19.5 mg·mL-1，確定其增敏作用的有效濃度范圍（該實驗中，苯唑西林單獨作用時MIC為256 μg·mL-1。）。MIC降低率為12.5%時白及醇提物濃度為25.4-31.2 mg·mL-1；MIC降低率為25%時白及醇提物濃度為31.2-39.0 mg·mL-1（圖1）。則白及醇提物的有效濃度范圍為25.4-39.0 mg·mL-1（圖1）。

3 討論

由于抗生素的廣泛使用，細菌廣譜耐藥現(xiàn)象十分嚴重。2016年9月5日，二十國集團（G20）領(lǐng)導人杭州峰會通過的《二十國集團領(lǐng)導人杭州峰會公報》將抗生素耐藥性話題上升到了國際高度，使之成為一個等同于氣候變化和恐怖主義的世界性挑戰(zhàn)問題[16]。目前我國細菌耐藥性問題尤為嚴重，已高于世界平均水平的30%，且有逐年上升趨勢[17]。MRSA能導致壞死性肺炎、嚴重敗血癥、壞死性筋膜炎等疾病[1,2]，嚴重危害人體健康，早在1959年Jevons在英國就首次發(fā)現(xiàn)MRSA。當前，MRSA感染正以醫(yī)院獲得性感染的方式向社區(qū)獲得性感染的形式蔓延，特別是新的MRSA菌株極快地促進了其在全球擴散的速度，已成為醫(yī)院內(nèi)和社區(qū)感染的重要病原菌之一[18]。在澳大利亞、東南亞、南歐等一些國家和地區(qū)檢出率可達25%-50%[19]。在美國，每年因MRSA感染導致死亡的患者數(shù)相當于AIDS、結(jié)核病和病毒性肝炎的總和[20,21]。2004年美國大部分醫(yī)院MRSA感染率都超過50%，MRSA在美國占院內(nèi)感染金葡菌的比率從1975年的2.4%上升到1997年的39.9%。2005年，美國Uehnert等在全美475所醫(yī)院的調(diào)查顯示，MRSA感染的住院病人相比1995年增長了10倍，是2000年的3倍，比2004年增長了30%，而且由于檢測及培養(yǎng)方面的差別與缺陷，實際的發(fā)生率可能更高[22]，其中北美和南美這些地區(qū)是全球檢出率最高的地方已超過50%[19]。美國CDC發(fā)言人稱，MRSA的發(fā)病率和死亡率超過艾滋病、SARS和禽流感。2005年，在美國，MRSA嚴重感染人數(shù)約為9.4萬人，死亡1.865萬人，而當年艾滋病的死亡人數(shù)是1.7萬左右，所以MRSA又被稱為是“超級細菌”[23]。在我國，大型教學醫(yī)院MRSA的檢出率也達到60%[24]，MRSA分離率及多重耐藥均有增加趨勢。2008年Mohnarin監(jiān)測資料顯示，綜合醫(yī)院MRSA分離株占金黃色葡萄球菌的67.6%、ICU中高達84.8%。據(jù)估計每年大約有十萬人因感染MRSA而住院治療。我國雖尚無MRSA感染率及死亡率的全國性數(shù)據(jù)，但MRSA分離率及多重耐藥均有增加趨勢。據(jù)對多重耐藥菌的調(diào)查發(fā)現(xiàn)[25]，MRSA依然為我國細菌耐藥研究重點之一。

表1 中藥提取物作用前后苯唑西林對MRSA（271）的MIC結(jié)果

圖1 白及醇提物10%梯度稀釋量效關(guān)系圖

MRSA的耐藥機制主要為產(chǎn)生對β-內(nèi)酰胺類抗生素親和力很低的PBP2a；產(chǎn)生β-內(nèi)酰胺酶；增強細菌主動外排系統(tǒng)，減少抗生素在菌體內(nèi)積聚等。MRSA的多種耐藥機制使敏感菌成為耐藥菌，為臨床治療帶來困難，有效藥的缺少與病癥感染的增多使抗耐藥菌新藥的開發(fā)成為必然。因此尋找研發(fā)新型藥物已成為耐藥菌防治研究的重點。

MRSA的多種耐藥機制造成目前抗生素抗MRSA效果甚微。隨著近幾年中西醫(yī)結(jié)合工作的深入開展，中西藥的聯(lián)合應(yīng)用引起國內(nèi)外學者的廣泛重視。中藥具有多組分、多層面、多靶點、毒副作用小、很少發(fā)生耐藥現(xiàn)象等特點[26]，另外多活性成分發(fā)揮藥效作用，調(diào)動機體自身的抗病能力，達到多效性和整體的調(diào)節(jié)作用；西藥多為化學單體，組成成分明確，作用靶點具有專一性和針對性，其作用機理相對中藥比較清楚，療效評價體系比較容易明確[27]。目前國內(nèi)研究已發(fā)現(xiàn)中藥可以通過破壞細菌細胞結(jié)構(gòu)，抑制生物膜形成，抑制細菌蛋白合成等進行抑菌。還可以通過消除R質(zhì)粒、抑制細菌主動外排泵、抑制β-內(nèi)酰胺酶、抑制耐藥基因的表達等途徑逆轉(zhuǎn)細菌耐藥性[28]。韋志友等人[29]發(fā)現(xiàn)β-內(nèi)酰胺酶抑制劑的抗菌活性極弱，但對β-內(nèi)酰胺酶的抑制作用卻很強。臨床常與相應(yīng)的抗生素聯(lián)合使用而起協(xié)同作用。這是因為它們在抑制了β-內(nèi)酰胺酶的同時，還保留了抗生素的抗菌活性，從而有效對抗細菌的耐藥性。臨床實踐證明，中西藥的合理聯(lián)用確實可以發(fā)揮其各自優(yōu)勢，取得優(yōu)于單獨使用中藥或西藥的綜合療效，減少藥物的用量，或擴大藥物的適應(yīng)范圍，這是中西藥聯(lián)用的潛在優(yōu)勢。現(xiàn)中藥已逐漸成為抗耐藥菌研究的熱點。目前已有研究表明某些中藥具有抗菌增敏作用，如大蒜素、川芎嗪[30]、黃藤素、沒子酸[13]等，可以提高細菌對抗生素的敏感性，甚至是逆轉(zhuǎn)細菌耐藥性，提升已有抗生素的作用。這為解決日趨嚴重的細菌耐藥性問題提供了新思路。本實驗以中藥提取物整體為對象，增加篩選到有效物的可能性，使中藥發(fā)揮減緩或消除細菌耐藥性的作用，而西藥發(fā)揮抑菌殺菌作用，達到更好抗菌目的。

本實驗通過篩選33種中藥提取物的增敏作用，最終發(fā)現(xiàn)白及醇提物能夠有效降低苯唑西林對MRSA（271）的MIC（P ＜ 0.05），增加MRSA（271）對苯唑西林敏感性。并通過實驗確定了白及醇提物的量效關(guān)系：當白及醇提物濃度為25.4-31.2 mg·mL-1時，其MIC降低率為12.5%；當白及醇提物濃度為31.2-39.0 mg·mL-1時，MIC降低率為25%。并最終確定其有效濃度范圍為25.4-39.0 mg·mL-1。本次實驗成功地篩選出了具有增敏作用的中藥提取物，即白及醇提物，但是，白及醇提物的增敏機制還有待于進一步研究。同時，白及醇提物中能夠增強MRSA對抗生素的敏感性的具體有效成分也尚待確定。

有效藥的缺少與病癥感染的增多使得抗耐藥菌新藥的開發(fā)成為必然，篩選出中藥增敏劑，增強MRSA對苯唑西林的敏感性，提升苯唑西林的抗菌作用則有巨大市場前景。本次實驗成功地篩選出了白及醇提物具有增敏作用，這不僅為MRSA的臨床診療和院內(nèi)感染控制提供了新的思路，同時也為白及開辟了新的應(yīng)用領(lǐng)域。