人參黃芩配伍對(duì)多發(fā)性腦梗塞性癡呆模型大鼠腦能量的影響＊

付 穎，高麗娟，夏 鵬，文躍強(qiáng)，徐世軍＊＊

（1.成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院 成都 611137；2.成都中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)腦病藥物整合轉(zhuǎn)化研究所 成都 611137；3.成都中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 成都 61137）

多發(fā)性腦梗塞性癡呆（Multi-infarct Dementia，MID）是一種因缺血性或腦血管疾病而造成的認(rèn)知功能障礙綜合征[1]，其發(fā)病機(jī)制涉及興奮性氨基酸毒性、線粒體功能紊亂、能量代謝障礙、氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡等[2]。它是繼阿爾茨海默癥（Alzheimer's disease，AD）后第二大癡呆癥型，也被認(rèn)為是目前唯一可以防治的癡呆類型[3]。血管系統(tǒng)受阻或病變引起腦內(nèi)尤其是認(rèn)知區(qū)域供血不足是MID患者認(rèn)知下降的重要原因[4]。腦內(nèi)能量主要源于葡萄糖的外周攝入，供血不足導(dǎo)致腦內(nèi)能量低下，線粒體是成直接能源物質(zhì)三磷酸腺苷（ATP）的主要場(chǎng)所，同時(shí)參與細(xì)胞分化、信息傳遞生理活動(dòng)[5]。當(dāng)機(jī)體線粒體功能障礙時(shí)，除可引起產(chǎn)能不足外，它還誘發(fā)氧化應(yīng)激、線粒體自噬、細(xì)胞凋亡等[6-7]，這些病變反過(guò)來(lái)加劇了MID病變程度及認(rèn)知下降。人參黃芩配伍是《外臺(tái)秘要》黃芩人參湯，原方主治“傷寒吐下后，內(nèi)外有熱，煩渴不安”，二者配伍體現(xiàn)了中醫(yī)益氣解毒治則，且二者臨床多以組方形式用于治療老年癡呆，如：參芪醒腦顆粒，柴胡加龍骨牡蠣湯，黃連解毒湯聯(lián)合天王補(bǔ)心丹等[8-11]。人參皂苷和黃芩苷具有改善癡呆模型學(xué)習(xí)記憶的作用，但二者配伍后能否干預(yù)多發(fā)性腦梗塞性癡呆鮮見(jiàn)報(bào)道。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SD大鼠，雄性，SPF級(jí)，50只，體質(zhì)量（200±20）g，由成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證編號(hào)：NO.51203500003215。

1.2 藥物與試劑

黃芩、人參等比配伍，加6倍量水浸泡1 h后煎煮3次，每次煎煮1.5 h，合煎液，粗濾后80℃濃縮至0.22 g·mL-1，4℃保存?zhèn)溆?。甲磺酸雙氫麥角毒堿片（喜得鎮(zhèn)），天津華津制藥有限公司制造，批號(hào)：7C883T；三磷酸腺苷二鈉鹽、二磷酸腺苷二鈉鹽、單磷酸腺苷二鈉鹽均購(gòu)置自sigma公司。

1.3 主要儀器

Morris水迷宮分析系統(tǒng)（WMT-100，成都泰盟科技有限公司），Agilent高效液相色譜儀（1260，Agilent公司），流式細(xì)胞儀（ZE5，Bio-Rad公司），DM1000徠卡顯微成像系統(tǒng)（德國(guó)，Leica）。

2 方法

2.1 模型制備及分組

取健康SPF級(jí)SD大鼠，適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d，采用微血栓栓塞法[12]制備MID模型，假手術(shù)組注射等體積的生理鹽水。造模2周后，根據(jù)體重和“Y”迷宮評(píng)價(jià)的學(xué)習(xí)記憶水平將模型大鼠隨機(jī)分為4組，即模型組（Model）、喜得鎮(zhèn)組（Hydergine）（0.7 mg·kg-1）、人參黃芩高劑量組（CRHG，2.22 g·kg-1）和人參黃芩低劑量組（CRHD，1.11 g·kg-1），每組10只，10只假手術(shù)大鼠作為對(duì)照組，分組后按照10 mL·kg-1每天1次灌胃給予相應(yīng)藥物，假手術(shù)組（Sham）和模型組給予等體積的生理鹽水，連續(xù)灌胃45天。

2.2 Morris水迷宮檢測(cè)學(xué)大鼠習(xí)記憶功能

定位航行實(shí)驗(yàn)：給藥第40天開(kāi)始進(jìn)行為期5天的連續(xù)定位航行訓(xùn)練，每天訓(xùn)練2次，記錄其在60 s內(nèi)找到平臺(tái)的時(shí)間（逃避潛伏期）。超過(guò)60 s找不到平臺(tái)，引導(dǎo)其找到平臺(tái)并在平臺(tái)停留10 s，逃避潛伏期記成60 s。

空間探索實(shí)驗(yàn)：定向航行實(shí)驗(yàn)結(jié)束24 h后，撤除平臺(tái)，將大鼠從相同位置放入迷宮，系統(tǒng)同步記錄60 s內(nèi)大鼠的運(yùn)動(dòng)軌跡，記錄穿越平臺(tái)次數(shù)。

2.3 海馬病理形態(tài)學(xué)檢測(cè)

空間探索結(jié)束后處死大鼠，冰浴取腦，左半腦用4%多聚甲醛固定，常規(guī)脫水、包埋、切片、HE染色、封片，顯微鏡觀察大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)。

2.4 線粒體腫脹度和膜電位檢測(cè)

采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)線粒體腫脹度和膜電位。將適量腦組織制成單細(xì)胞懸液并調(diào)整為105個(gè)/mL；取1 mL的細(xì)胞懸液離心，棄上清液后每管加入500 μl的JC-1工作液重懸，37℃孵育15 min后清洗兩次并收集沉淀，然后再加入500 μl緩沖液重懸混勻后上機(jī)檢測(cè)檢測(cè)線粒體腫脹度；取適量腦組織單細(xì)胞懸液，調(diào)整為106個(gè)/mL，加入 5 μl JC-1染液至100 μl樣本中，37℃孵育15 min，PBS清洗后收集沉淀物，然后加入300-400 μl JC-1專用稀釋液重懸混勻后上機(jī)檢測(cè)線粒體膜電位，采用KALUZA軟件分析檢測(cè)結(jié)果。

2.5 海馬ATP、ADP、AMP測(cè)定

取適量海馬組織，加入生理鹽水（海馬重∶生理鹽水體積=1∶10），冰浴勻漿，取0.6 mL勻漿液，加入等體積0.5 mol·L-1高氯酸渦旋儀渦旋混勻，4℃12000xg離心10 min。取上清液0.8 mL，用NaOH（5 mol·L-1）調(diào)PH至中性，靜置30 min，4℃12000xg離心10 min。取上清液直接進(jìn)樣，HPLC梯度洗脫，測(cè)定AMP、ADP、ATP的含量。色譜條件：ODSHYPERSIL C18色譜柱（5 μm，250 mm×4.6 mm），柱溫25℃；流動(dòng)相0.05 mol/L磷酸緩沖鹽溶液（pH=6.5）；流速1.0 mL·min-1；樣品室溫10℃；進(jìn)樣體積10 μL；紫外檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm。根據(jù)公式計(jì)算能荷值：EC= （[ATP]+0.5[ADP]）/（[ATP]+[ADP]+[AMP]）。

2.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

數(shù)據(jù)以“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”（xˉ± S）表示，Morris水迷宮逃避潛伏期用雙因素（two-way ANOVA）Tukey's多重比較分析，符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)采用單因素方差分析（one-way ANOVA），不符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)采用非參數(shù)秩和檢驗(yàn)。

3 結(jié)果

3.1 人參黃芩配伍對(duì)模型大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響

如圖1所示，隨著訓(xùn)練時(shí)間的增加，各組大鼠逃避潛伏期均有不同程度的縮短。與假手術(shù)組比較，模型組大鼠逃避潛伏期明顯延長(zhǎng)，穿越平臺(tái)次數(shù)則明顯減少（P＜0.05）；與模型組比較，人參黃芩配伍組逃避潛伏期顯著縮短（P＜0.05），穿越平臺(tái)次數(shù)顯著增多（P ＜ 0.05）。

3.2 人參黃芩配伍對(duì)模型大鼠海馬CA1區(qū)病理形態(tài)學(xué)的影響

與假手術(shù)組比較，模型組海馬CA1區(qū)椎體神經(jīng)細(xì)胞排列稀疏，細(xì)胞數(shù)目減少，結(jié)構(gòu)不完整，可見(jiàn)明顯的神經(jīng)細(xì)胞壞死及細(xì)胞變性（P＜0.05）；與模型組比較，人參黃芩配伍組神經(jīng)細(xì)胞排列稀疏有明顯改善，神經(jīng)細(xì)胞壞死和細(xì)胞變性明顯改減輕（P＜0.05）（圖2）。

圖1 人參黃芩配伍對(duì)MID模型大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響（n=6）

圖2 人參黃芩配伍對(duì)MID模型大鼠海馬CA1區(qū)病理形態(tài)學(xué)影響（n=6）

3.3 人參黃芩配伍對(duì)模型大鼠海馬線粒體功能的影響

與假手術(shù)組比較，模型組海馬線粒體明顯腫脹，線粒體膜電位顯著下降（P＜0.05）；與模型組比較，人參黃芩配伍低劑量組線粒體腫脹度明顯下降，人參黃芩配伍高低劑量組線粒體膜電位均顯著增高（P＜0.05）（圖3）。

3.4 人參黃芩配伍對(duì)MID大鼠腦能量的影響

與假手術(shù)相比較，模型組腦組織ATP含量顯著降低（P＜0.05），但AMP和ADP含量無(wú)明顯變化（P＞0.05），腦能荷值顯著降低（P＜0.05）；與模型組比較，人參黃芩配伍高劑量組大鼠腦組織中ATP含量顯著升高（P＜0.05），AMP和ADP的含量無(wú)顯著差異（P＞0.05），腦能荷值顯著升高（P ＜ 0.05）（圖4）。

4 討論

圖3 人參黃芩配伍對(duì)MID模型大鼠海馬線粒體功能的影響（n=3）

慢性腦缺血引起的低灌注導(dǎo)致皮層與海馬神經(jīng)元損傷，破壞空間學(xué)習(xí)記憶形成過(guò)程，被認(rèn)為是MID認(rèn)知障礙的病理學(xué)基礎(chǔ)[13]。MID認(rèn)知功能的下降與腦組織中廣泛的小缺血灶或微梗死灶相關(guān)[14]，自體血栓栓塞法能更好的模擬腦組織廣泛微梗死灶，與臨床具有較高的一致性。本次研究發(fā)現(xiàn)，微血栓頸總動(dòng)脈注射后可以導(dǎo)致大鼠逃避潛伏期顯著延長(zhǎng)，穿越平臺(tái)次數(shù)減少，海馬CA1區(qū)椎體細(xì)胞排列紊亂、細(xì)胞稀疏，提示造模成功。人參黃芩配伍干預(yù)后，大鼠逃避潛伏期縮短，穿越平臺(tái)次數(shù)增多，海馬CA1區(qū)病理形態(tài)學(xué)不同程度減輕，說(shuō)明人參黃芩配伍具有改善MID學(xué)習(xí)記憶功能的作用。腦是機(jī)體能量代謝最活躍的部位，穩(wěn)定而協(xié)調(diào)的腦能量代謝對(duì)腦正常狀態(tài)的保持至關(guān)重要。腦，特別是神經(jīng)元，對(duì)缺血缺氧的敏感性在整個(gè)機(jī)體中最高[15]。多發(fā)梗死性癡呆存在多發(fā)性局限性腦血流降低或腦血管阻塞，首先影響了神經(jīng)細(xì)胞的能量供應(yīng)。已有研究表明腦能量代謝障礙是MID病變的中心環(huán)節(jié)，臨床實(shí)驗(yàn)也表明線粒體功能下降、能量代謝衰減可能是神經(jīng)退變病發(fā)病的早期信號(hào)[16]。能荷是代表總的腺苷酸系統(tǒng)中所負(fù)荷的高能磷酸基數(shù)量，是反應(yīng)腦能量水平的最直接指標(biāo)，本次研究發(fā)現(xiàn)，MID模型大鼠海馬能荷顯著低下，提示腦供能不足或低下，經(jīng)人參黃芩干預(yù)后，模型大鼠海馬能荷水平顯著提高，說(shuō)明人參黃芩配伍可以改善因腦梗造成腦供能不足。腦組織供能主要依賴ATP[17]，ATP生成場(chǎng)所是線粒體，通過(guò)不斷進(jìn)行ADP-ATP再循環(huán)完成能量的穿梭轉(zhuǎn)換，但并不能在細(xì)胞中儲(chǔ)存[18]。因此線粒體供能正常與否與ATP生成和水平密切相關(guān)。線粒體腫脹度和膜電位水平可以反應(yīng)線粒體供能和結(jié)構(gòu)是否正常。已有研究表明MID模型大鼠存在明顯的線粒體功能障礙，表現(xiàn)為線粒體腫脹和線粒體膜電位下降[12,16]，這與本研究的結(jié)果一致，人參黃芩配伍可以改善多發(fā)性腔梗所致的腦組織線粒體腫脹度和膜電位的下降，提示其促進(jìn)腦能荷的提高與線粒體損傷保護(hù)有關(guān)。綜上，保護(hù)線粒體功能，改善腦能量進(jìn)而保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞損害是人參黃芩配伍改善MID學(xué)習(xí)記憶功能的主要作用機(jī)制之一。