橋尾蛋白的結(jié)構(gòu)、功能及其與神經(jīng)系統(tǒng)疾病關(guān)系的研究進(jìn)展

陳菲，周青珍，楊文瓊

橋尾蛋白（gephyrin）是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)、研究最廣泛的抑制性突觸后膜骨架蛋白，在非神經(jīng)組織如腎、肝、肺、視網(wǎng)膜中均可檢測(cè)到橋尾蛋白，在哺乳動(dòng)物中橋尾蛋白主要在中樞神經(jīng)系統(tǒng)表達(dá)［1-4］。橋尾蛋白存在于突觸后膜上，具有組裝和穩(wěn)定抑制性突觸等作用，是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中抑制性神經(jīng)突觸聚集和外周組織中鉬輔因子（molybdenum cofactor，MoCo）進(jìn)行生物合成所必需的雙功能膜蛋白［5-7］。此外，橋尾蛋白在甘氨酸（Glycine，Gly）和γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）能受體聚集、抑制性突觸信號(hào)傳遞、長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)（long-term potentiation，LTP）過(guò)程中必不可少［8］。自Heinrich Betz團(tuán)隊(duì)1982年首次發(fā)現(xiàn)橋尾蛋白至今，其已被證實(shí)可結(jié)合多種類型抑制性突觸分子，進(jìn)而調(diào)控抑制性突觸的形成、功能及可塑性［9-10］，但目前仍存在許多尚未解決的問(wèn)題。本文綜述了橋尾蛋白的結(jié)構(gòu)、功能及其與神經(jīng)系統(tǒng)疾病的關(guān)系。

1 橋尾蛋白的結(jié)構(gòu)

SASSOè-POGNETTO等［11］通過(guò)運(yùn)用抗橋尾蛋白抗體而首次在哺乳動(dòng)物視網(wǎng)膜GABA能受體中發(fā)現(xiàn)橋尾蛋白的超微結(jié)構(gòu)，證實(shí)橋尾蛋白存在于哺乳動(dòng)物整個(gè)中樞神經(jīng)系統(tǒng)中。LARDI-STUDLER等［12］通過(guò)免疫染色法發(fā)現(xiàn)，橋尾蛋白選擇性定位于Gly和GABA能受體上。后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)，橋尾蛋白分子量為93 kDa，脊椎動(dòng)物橋尾蛋白包含3個(gè)主要結(jié)構(gòu)域，分別為20 kDa的G域、43 kDa的E域、18～21 kDa的C域，其中G域與E域通過(guò)中央結(jié)構(gòu)域—C域進(jìn)行連接［13］。G域和E域?qū)?yīng)細(xì)菌中負(fù)責(zé)合成MoCo的MogA和MoeA蛋白質(zhì)，C域包含大量突觸蛋白翻譯后修飾位點(diǎn)、結(jié)合位點(diǎn)的殘基，如GABA能受體相關(guān)蛋白、動(dòng)力蛋白的輕鏈等，因此C域被認(rèn)為與橋尾蛋白的功能最為密切；此外，G域負(fù)責(zé)形成穩(wěn)定的三聚體，而分離的E域則形成二聚體并表現(xiàn)出與Gly能受體亞基具有高親和力的結(jié)合位點(diǎn)。

2 橋尾蛋白的功能

2.1 橋尾蛋白與抑制性突觸后膜受體 橋尾蛋白的主要功能之一是作為骨架蛋白而將抑制性突觸受體穩(wěn)定在突觸后膜上［9］，其可能作為一種中樞蛋白而整合各種抑制性突觸活動(dòng)和信號(hào)，并通過(guò)聚集在突觸后膜上的Gly和GABA能受體而調(diào)節(jié)抑制性突觸信號(hào)的傳遞。此外，橋尾蛋白還能通過(guò)與神經(jīng)連接素-2、骨橋蛋白（osteopontin）等相互作用而參與抑制性突觸的成熟、功能維持等。

有研究者通過(guò)免疫染色觀察發(fā)現(xiàn)，Gly能受體在神經(jīng)元中的分布與橋尾蛋白簇在突觸后的定位幾乎完全重疊，而抑制橋尾蛋白的表達(dá)會(huì)阻斷Gly能受體在突觸后膜的聚集，提示橋尾蛋白與Gly能受體相互作用依賴于橋尾蛋白與Gly能受體β亞基之間的高親和力結(jié)合［14］。GABA能受體在突觸后膜的聚集主要通過(guò)橋尾蛋白等骨架蛋白相互作用實(shí)現(xiàn)，靶向刪除GABA能受體γ2亞基會(huì)阻礙GABA能受體與橋尾蛋白在突觸后膜聚集，但γ2亞基并不會(huì)直接與橋尾蛋白結(jié)合，因此橋尾蛋白在GABA能突觸后膜聚集的具體機(jī)制尚不完全清楚。此外，橋尾蛋白在突觸后膜聚集位點(diǎn)具有一定選擇性，意味著神經(jīng)元具有特異性分子機(jī)制以確保橋尾蛋白的靶向和突觸后膜聚集，但抑制性突觸后膜位點(diǎn)的多分子復(fù)合物的形成過(guò)程及橋尾蛋白在非突觸位點(diǎn)自身聚集的阻斷機(jī)制目前尚不明確。

2.2 橋尾蛋白與抑制性突觸可塑性 突觸可塑性主要分為短期突觸可塑性和長(zhǎng)期突觸可塑性，其中短期突觸可塑性主要包括易化、抑制、增強(qiáng)，長(zhǎng)期突觸可塑性主要表現(xiàn)形式為L(zhǎng)TP和長(zhǎng)時(shí)程抑制（long-term depression，LTD）。有研究表明，突觸可塑性是學(xué)習(xí)記憶的基礎(chǔ)［15］，橋尾蛋白可能與部分抑制性突觸可塑性有關(guān)，如GABA能受體的β3亞單位磷酸化可促進(jìn)抑制性突觸后LTP過(guò)程中突觸外位點(diǎn)的橋尾蛋白聚集［16］，而橋尾蛋白組裝障礙會(huì)阻斷化學(xué)誘導(dǎo)的抑制性突觸后LTP過(guò)程和GABA能受體的聚集。也有研究表明，橋尾蛋白在突觸后膜的聚集及隨后的受體固定對(duì)于突觸后LTP的抑制信號(hào)傳導(dǎo)至關(guān)重要；PETRINI等［16］研究結(jié)果顯示，干擾橋尾蛋白的聚集會(huì)限制突觸后抑制性LTP的形成及GABA能受體的聚集，甚至起著決定性作用。

3 橋尾蛋白與神經(jīng)系統(tǒng)疾病

3.1 橋尾蛋白與MoCo缺乏癥 鉬是人體必需微量元素之一，單獨(dú)存在于生物體內(nèi)時(shí)不具有生物活性，只有與蛋白質(zhì)或蝶呤結(jié)合形成MoCo才具有酶催化作用［17-18］。自然界中存在兩種控制鉬氧化還原狀態(tài)和催化能力的輔因子，即以鐵硫簇為基礎(chǔ)的鐵MoCo和以鉬蝶呤（molybdopterin，MPT）為基礎(chǔ)的MoCo。目前所知的含鉬酶均是以MoCo的形式參與酶的催化，常見(jiàn)含鉬酶包括硝酸鹽還原酶、黃嘌呤脫氫酶、醛氧化酶、亞硫酸鹽氧化酶、線粒體氨肟還原蛋白［19］。人類MoCo缺乏癥是一種嚴(yán)重的常染色體隱性遺傳代謝紊亂性疾病，主要表現(xiàn)為出生時(shí)開(kāi)始出現(xiàn)無(wú)法治愈的新生兒驚厥、神經(jīng)元缺失，并于出生1年內(nèi)死亡，死亡原因主要是亞硫酸鹽氧化酶活性喪失而導(dǎo)致有毒亞硫酸鹽沉積［20-22］。

MoCo的生物合成可以分為4步［23］：第1步是三磷酸鳥(niǎo)苷（guanosine triphosphate，GTP）環(huán)化，第2步是MPT合成，第3步是MPT活化，第4步是鉬插入到MPT上。鉬依賴性酶如亞硫酸氧化酶、黃嘌呤氧化還原酶活性在橋尾蛋白催化MoCo生物合成的第4步必不可少。橋尾蛋白參與MoCo合成的步驟如下：G域結(jié)合MPT并催化腺苷酸轉(zhuǎn)移到MPT末端磷酸鹽上，隨后將腺苷酸化的MPT轉(zhuǎn)移至E域［24］。MoCo缺乏癥分為A型、B型、C型3種類型，其中只有C型被證實(shí)與橋尾蛋白基因（GPHN）突變有關(guān)［25］，GPHN的移碼缺失會(huì)影響橋尾蛋白中負(fù)責(zé)甲基化MPT的G域及水解腺苷鍵而插入鉬因子所需的E域［26］。

3.2 橋尾蛋白與阿爾茨海默?。ˋlzheimer disease，AD）AD的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，可能由多種因素共同作用所致，包括興奮性Gly毒性、淀粉樣蛋白沉積、鈣穩(wěn)態(tài)失調(diào)、自由基與氧化應(yīng)激損傷、胰島素相關(guān)糖代謝異常等。雖然對(duì)AD的研究已有100多年的歷史，但其具體發(fā)病機(jī)制至今尚未完全明確。既往關(guān)于AD發(fā)病機(jī)制的研究集中在淀粉樣斑塊、神經(jīng)原纖維纏結(jié)與認(rèn)知功能的關(guān)系，近年大量研究證實(shí)淀粉樣斑塊、神經(jīng)原纖維纏結(jié)形成之前發(fā)生的早期突觸變化更有可能是導(dǎo)致AD患者認(rèn)知障礙的原因之一［27-29］。尸檢結(jié)果顯示， AD患者皮質(zhì)區(qū)GABA能受體表達(dá)降低［30］。

目前，關(guān)于橋尾蛋白表達(dá)水平與認(rèn)知功能關(guān)系的研究報(bào)道較少，橋尾蛋白在AD患者中的表達(dá)與GABA能受體水平下降是否一致尚不清楚。HALES等［31］研究表明，因AD死亡患者腦組織橋尾蛋白密度和表達(dá)水平明顯降低，提示抑制性突觸數(shù)量降低；AGARWAL等［32］研究表明，男性AD患者腦組織中特征性橋尾蛋白表達(dá)水平較女性明顯降低；KISS等［30］通過(guò)免疫組化實(shí)驗(yàn)證實(shí)，AD晚期小鼠海馬CA1區(qū)、齒狀核區(qū)橋尾蛋白表達(dá)水平降低，抑制性突觸數(shù)量減少。但AD患者中樞神經(jīng)系統(tǒng)橋尾蛋白表達(dá)水平降低是通過(guò)何種分子通路實(shí)現(xiàn)的？橋尾蛋白表達(dá)水平異常是否與AD的發(fā)病直接相關(guān)？這些問(wèn)題仍需進(jìn)一步研究，而明確橋尾蛋白在AD發(fā)病中的作用及分子機(jī)制是未來(lái)研究方向之一。

3.3 橋尾蛋白與癲癇 癲癇發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，目前關(guān)于橋尾蛋白與癲癇關(guān)系的研究主要是針對(duì)癲癇患者中樞神經(jīng)系統(tǒng)中活化的GABA能受體衰減、橋尾蛋白聚集下調(diào)［33-34］。研究表明，癲癇患者腦脊液中GABA含量明顯降低，且腦脊液GABA含量與癲癇發(fā)作頻率有關(guān)；橋尾蛋白在抑制性突觸后膜上形成的多聚體對(duì)維持正常神經(jīng)抑制性信號(hào)必不可少，橋尾蛋白功能障礙有可能導(dǎo)致癲癇。橋尾蛋白異常參與癲癇的發(fā)病分子作用機(jī)制可能為：細(xì)胞應(yīng)激誘導(dǎo)GPHN外顯子跳躍產(chǎn)生異常剪接形式的RNA，繼而產(chǎn)生變性的或無(wú)活性的蛋白［35］。

既往研究表明，細(xì)胞應(yīng)激所致GPHN不規(guī)則剪接可造成顳葉癲癇（temporallobeepilepsy，TLE）患者截短的橋尾蛋白變體的表達(dá)［36］，異常剪接的GPHN mRNA已被證實(shí)與TLE有關(guān)，其作用機(jī)制為異常剪接的mRNA缺乏編碼橋尾蛋白G域的外顯子而導(dǎo)致細(xì)胞應(yīng)激（如溫度異常、堿中毒），繼而引發(fā) TLE［35］。F?RSTERA 等［37］首次報(bào)道了 1例伴 GPHN 基因雜合突變的癲癇性腦病嬰兒，該病例由于GPHN錯(cuò)義突變而導(dǎo)致所合成的橋尾蛋白失去原有功能，但并不影響蛋白的結(jié)構(gòu)和折疊，因此失去原有功能的橋尾蛋白在突觸后膜聚集并造成GABA能受體功能嚴(yán)重?fù)p傷。DEJANOVIC等［24］在TLE患者和TLE大鼠海馬區(qū)、鄰近皮質(zhì)中均觀察到GPHN異常表達(dá)，并認(rèn)為橋尾蛋白突變可導(dǎo)致神經(jīng)元過(guò)度興奮、抑制性神經(jīng)元發(fā)育異常及癲癇發(fā)作，提示TLE患者存在GABA能受體介導(dǎo)的神經(jīng)傳導(dǎo)缺陷［34］。因此，進(jìn)一步了解橋尾蛋白等骨架蛋白失調(diào)對(duì)GABA能受體功能中的調(diào)節(jié)作用可能會(huì)為研究癲癇的病理生理機(jī)制及癲癇新藥物作用靶點(diǎn)提供新思路。

4 小結(jié)與展望

神經(jīng)系統(tǒng)疾病如MoCo缺乏癥、AD、TLE均可能部分歸因于抑制性神經(jīng)傳導(dǎo)缺陷，而橋尾蛋白在抑制性神經(jīng)元調(diào)節(jié)中具有重要作用，因此不難推測(cè)MoCo缺乏癥、AD、TLE的發(fā)生可能與橋尾蛋白有關(guān)。目前研究已證實(shí)MoCo缺乏癥C型與GPHN突變有關(guān)、AD患者腦組織中橋尾蛋白表達(dá)水平下降、TLE與橋尾蛋白異常剪接有關(guān)［38］。近年大量研究證實(shí)，橋尾蛋白對(duì)抑制性突觸的結(jié)構(gòu)、功能調(diào)節(jié)至關(guān)重要，并可能與生物體內(nèi)各種抑制性神經(jīng)通路有關(guān)，但目前橋尾蛋白在Gly和GABA能受體功能調(diào)節(jié)中的確切作用機(jī)制尚不完全清楚，今后研究仍需更深入、細(xì)致地了解其動(dòng)態(tài)調(diào)控抑制性突觸后膜相關(guān)受體聚集的病理生理意義，以期能早期預(yù)防、干預(yù)甚至治愈相關(guān)神經(jīng)系統(tǒng)疾病。