實時熒光定量PCR法定量微生物的條件及在魚露和蝦油微生物檢測中的應用研究

王香君，李夢茹，段杉

1(四川省農業(yè)科學院蠶業(yè)研究所，四川 南充，637000)2(華南農業(yè)大學 食品學院，廣東 廣州，510642) 3(美國英狄士化學公司廣州代表處，廣東 廣州，511430)

自然界中僅有不到1%的微生物可培養(yǎng)，因此傳統(tǒng)的基于培養(yǎng)微生物的平板計數法無法對環(huán)境中微生物作出準確計數。目前已有多種不依賴培養(yǎng)的微生物計數方法出現(xiàn)，主要包括用流式細胞儀計數和通過測定微生物的核酸含量計數。采用流式細胞儀計數須先用熒光染料對微生物細胞染色，然后用流式細胞儀計數，該法需要昂貴的儀器，且不同大小和類型的細胞產生的信號不同，進樣速度的差異、共存的雜質等產生的熒光信號等都會對計數結果產生影響。而通過測定環(huán)境中微生物的核酸(基因組DNA或RNA)濃度，以核酸濃度反映環(huán)境中微生物的數量的分子生物學方法，具有分析速度快、不依賴于培養(yǎng)等特點，克服了平板計數法的缺點。其中FQ-PCR技術通過PCR擴增細菌16S rDNA和真菌18S rDNA的基因序列來定量微生物，具有操作簡便、靈敏度和特異性高等優(yōu)點。

國內外已有多篇關于采用FQ-PCR法測定微生物數量的報道，例如CASTILLO等[1]用FQ-PCR對大腸桿菌(Escherichiacoli)DNA進行擴增，所得的標準曲線用于定量豬肉消化道中所有細菌，結果表明，F(xiàn)Q-PCR測出的細菌數比平板計數法高；YAMAMOTO等[2]和AL-GABR等[3]用FQ-PCR分別對土曲霉(Aspergillusterreus)和黑曲霉(Aspergillusniger)DNA進行擴增，所得的標準曲線分別用于定量空氣和飲水中的所有真菌，發(fā)現(xiàn)用FQ-PCR得到的真菌數比平板計數法高1～2個數量級。然而，上述研究均未對所采用的引物的特異性、擴增效率等進行研究，其定量的準確性及所用引物和擴增條件是否能夠普遍適用于各種環(huán)境條件下的微生物定量尚存疑問。WU等[4]歸納了多對擴增細菌16S rDNA和真菌18S rDNA通用引物，但這些細菌和真菌通用引物是否適用于FQ-PCR定量多種微生物尚待研究。

本研究選取多種常見的革蘭氏陽性及陰性細菌、絲狀真菌和酵母，以其DNA為模板，對國內外報道的幾種常見細菌16S rDNA和真菌18S rDNA通用引物在FQ-PCR反應中的特異性、擴增效率進行評估，確定最恰當的引物，并優(yōu)化擴增條件，在此基礎上對發(fā)酵過程中魚露和蝦油的細菌和真菌數量的變化進行測定。

1 材料與方法

1.1 原料和菌種

1.1.1 原料

制作魚露的原料來自陽江市海陵島，包括6種新鮮小雜魚，其所占質量百分比分別是雙斑瓦鰈2.3%，短尾大眼鯛5.2%，翼紅娘魚5.4%，鲬6.3%，眶棘雙邊魚80.8%，用塑料袋密封包裝后存放在溫度為-20 ℃的冰箱中。

制作蝦油的原料南美白對蝦(PenaeusvannameiBoone)蝦頭和蝦殼由陽江市海達水產有限公司提供，用塑料袋密封包裝后存放在溫度為-20 ℃的冰箱中。

1.1.2 菌種

細菌：嗜酸乳桿菌(Lactobacillusacidophilus)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、大腸桿菌(Escherichiacoli)、假單胞菌(Pseudomonassp.)、不動桿菌(Acinetobactersp.)，菌株均來自華南農業(yè)大學食品學院微生物實驗室。

真菌：釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、青霉(Penicilliumsp.)、曲霉(Aspergillussp.)，菌株均來自華南農業(yè)大學食品學院微生物實驗室。

1.2 實驗材料和儀器

核酸蛋白檢測儀，德國Eppendorf公司；BioRad CFX96實時熒光定量PCR儀，BIO-RAD公司。

ZR Fungal/Bacterial DNA Kit，ZYMO RESEARCH；Bester?SybrGreen qPCR Mastermix，DBI?Bioscience；引物，由上海生工生物工程技術服務有限公司(簡稱生工)合成(見表1和表2)。

1.3 研究方法

1.3.1 魚露樣品的制備

將小雜魚于室溫解凍后，與食鹽按3∶1的質量比混勻，然后置于35 ℃的恒溫箱中發(fā)酵。發(fā)酵過程中定期補加蒸發(fā)的水分以保持鹽度恒定(25%，w/w)。定期取樣，對其微生物進行計數。

表1 細菌通用引物Table 1 Bacterial universal primers

1.3.2 蝦油樣品的制備

將蝦頭蝦殼于室溫解凍后，用攪碎機絞碎，加入原料質量的5% NaCl混勻，裝入燒杯中，再放于45 ℃水浴鍋中，80 r/min保溫自溶4 h。自溶完畢后，取出用200目尼龍紗布過濾，得自溶液并測定其鹽度，再補加NaCl，使自溶液的NaCl質量分數達到25%，并將自溶液放入35 ℃培養(yǎng)箱中，待其發(fā)酵成熟后，進行微生物計數。

1.3.3 魚露和蝦油中微生物計數

分別采用平板計數法和FQ-PCR法對魚露和蝦油中微生物進行計數。

1.3.3.1 平板計數法

按GB 4789.2—2010方法稍作改進，在細菌培養(yǎng)基(PCA固體培養(yǎng)基)的基礎上添加質量分數為0%和10%的NaCl，對能在0%和10%鹽度下生存的細菌進行計數；在真菌培養(yǎng)基(PDA固體培養(yǎng)基)基礎上添加0%和20% NaCl，對能在0%和20%鹽度下生存的真菌進行計數，細菌和真菌數量的單位是lg CFU/mL。

1.3.3.2 FQ-PCR法

(1)各菌種DNA的提取：將嗜酸乳桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、假單胞菌、不動桿菌、釀酒酵母、青霉、曲霉分別擴大培養(yǎng)(嗜酸乳桿菌用MRS肉湯培養(yǎng)基培養(yǎng)，金黃色葡萄球菌用PCA液體培養(yǎng)基培養(yǎng)，假單胞菌用Pseudomonas液體培養(yǎng)基培養(yǎng)，大腸桿菌用LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)，不動桿菌用MM液體培養(yǎng)基培養(yǎng)，釀酒酵母用麥芽汁液體培養(yǎng)基培養(yǎng)，青霉用PDA液體培養(yǎng)基培養(yǎng)，曲霉用PDA液體培養(yǎng)基培養(yǎng))，再用ZR Fungal/Bacterial DNA 提取試劑盒(操作方法見說明書)提取各菌種DNA，通過核酸蛋白檢測儀測定DNA濃度，置-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

(2)魚露和蝦油樣品中微生物總DNA的提?。簩l(fā)酵的魚露和蝦油在無菌條件下先用快速濾紙過濾掉粗顆粒后，分別用離心和過膜的方法分離菌體。離心條件為12 000 r/min離心3 min；過膜條件為用0.22 μm濾膜過濾菌體，然后用無菌水將濾膜上的菌體洗下來。用ZR Fungal/Bacterial DNA Kit分別提取上述2種方法獲得的菌體總DNA。所有DNA樣品均于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

(3)引物的選擇：文獻報道有多對通用引物用于FQ-PCR定量細菌和真菌數量，它們擴增不同的DNA片段，常用的細菌和真菌通用引物見表1和表2。

用表1細菌通用引物擴增相同的DNA模板(大腸桿菌)和表2真菌通用引物擴增相同的DNA模板(青霉)，并做2次獨立重復實驗。FQ-PCR反應體系為20 μL：SYBR Green QPCR Mix 10 μL、上下游引物(10 μmol/μL)各0.4 μL、DNA 模板2 μL、加雙蒸水至20 μL。FQ-PCR反應參數：95 ℃預變性2 min；40個循環(huán)：95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，在延伸階段收集熒光信號。DNA熔解曲線分析是從65 ℃以1 ℃/min的升溫速度上升到95 ℃。同時設計陰性對照(無DNA模板)排除DNA污染，每個引物做3次平行。

(4)引物退火溫度的優(yōu)化：將(3)得到的最適的細菌和真菌通用引物進行FQ-PCR反應，DNA模板分別是大腸桿菌和青霉，將FQ-PCR擴增程序的退火溫度分別設置為65、64.1、62.5、59.5、55.9、53、51和50 ℃，比較擴增效果，每個溫度做3次平行，并做2次獨立重復實驗。

(5)單一細菌菌種和單一真菌菌種DNA的標準曲線：將嗜酸乳桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、假單胞菌、不動桿菌、釀酒酵母、青霉、曲霉的DNA分別用雙蒸水稀釋，使它們的DNA質量濃度均在20～100 ng/μL之間，再進行梯度稀釋，選擇合適的質量濃度梯度，用(3)和(4)得到的FQ-PCR最佳反應條件進行擴增，得到它們各自的標準曲線，每個標準點做3次平行，每條標曲做2次獨立重復實驗。

(6)混合細菌和混合真菌DNA的標準曲線：將嗜酸乳桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、假單胞菌、不動桿菌的DNA分別用雙蒸水稀釋，使它們的DNA質量濃度均在20～100 ng /μL之間，再各取DNA稀釋液5 μL混勻，稱為“混合細菌”；將釀酒酵母、青霉、曲霉的DNA也分別用雙蒸水稀釋，使它們的DNA質量濃度在20～100 ng /μL之間，再各取DNA稀釋液10 μL混勻，稱為“混合真菌”。并通過核酸蛋白檢測儀測定DNA質量濃度后，將混合細菌和混合真菌分別進行梯度稀釋，選擇合適的質量濃度梯度，再用(3)和(4)得到的FQ-PCR反應條件進行擴增，得到它們各自的標準曲線。每個標準點做3次平行，每條標準曲線做2次獨立重復實驗。

(7)魚露和蝦油中細菌和真菌數量的測定：由(6)得到混合細菌和混合真菌DNA的標準曲線，根據魚露和蝦油中細菌和真菌DNA擴增曲線中的Cq值，再從標準曲線上查出DNA質量濃度。由于NADKARNI等[8]和SASS等[9]報道，1個細菌細胞相當于5 fg DNA；YAMAMOTO等[2]報道是1個真菌細胞相當于17.5 fg DNA，因此細菌和真菌從DNA轉換成細胞數的換算數分別是5和17.5。FQ-PCR法測定魚露和蝦油中細菌和真菌數量的單位是lg個/mL。

1.4 數據分析

測定和分析結果采用SPSS 16.0和Excel進行數據處理，結果采取均值±標準差形式。p<0.05認為具有顯著差異。

2 結果與討論

2.1 細菌和真菌FQ-PCR定量條件的確定

2.1.1 引物的選擇

用表1細菌通用引物擴增相同的DNA模板(大腸桿菌)和表2真菌通用引物擴增相同的DNA模板(青霉)，結果見圖1和圖2。

以不同引物擴增細菌16S rDNA和真菌18S rDNA的不同區(qū)域，不合適的引物會出現(xiàn)非特異性擴增，導致FQ-PCR定量不準確。因此引物的選擇標準是擴增特異性高，不產生非特異性擴增，不形成引物二聚體，同時要求得到的擴增曲線光滑平穩(wěn)，熒光吸收圖譜的S形曲線形狀完好，以出現(xiàn)最小Cq值和最高熒光值為最佳。引物的特異性可通過分析擴增產物的熔解曲線確定，特異性擴增的熔解曲線只能有單峰，如出現(xiàn)明顯雙峰甚至多峰則屬非特異性擴增；而陰性對照要求起峰Cq>35個循環(huán)[8]。

圖1 細菌通用引物的擴增曲線和熔解曲線Fig.1 Amplification curve and melting curve analysis of PCR products of bacterial universal primers

圖2 真菌通用引物的的擴增曲線和熔解曲線Fig.2 Amplification curve and melting curve analysis of PCR products of fungal universal primers

由圖1可知，引物P11P-P13P和338F-518R的擴增曲線的平臺期不完整；引物63F-335R和515F-806R比較，63F-335R的Cq值較小和熒光值較高，擴增曲線呈平穩(wěn)光滑的S形，且熔解曲線只有單峰，CASTILLO等[1]選擇引物63F-335R用FQ-PCR成功定量了豬肉消化道中的細菌，因此選用63F-335R作為FQ-PCR測定細菌數量的引物。由圖2可知，真菌引物NS1-NS2和NS5-NS6出現(xiàn)明顯雙峰，引物P1-P2和0817F-1536R出現(xiàn)微弱雙峰，而引物0817F-1196R熔解曲線只有單峰，同時擴增曲線也是呈平穩(wěn)光滑的S形完整曲線，擴增效果較好，因此選用0817F-1196R為FQ-PCR定量測定真菌數量的引物。

2.1.2 引物的退火溫度

為確定引物63F-335R和0817F-1196R的退火溫度，由生工合成的表1和表2中引物的參考熔解溫度Tm范圍為55～70 ℃，而文獻報道引物的退火溫度要低于熔解溫度Tm5 ℃左右，因此將FQ-PCR擴增程序的退火溫度分別設置為65、64.1、62.5、59.5、55.9、53、51和50 ℃，擴增結果見圖3和圖4。

圖3 引物63F-335R溫度梯度的擴增曲線和熔解曲線Fig.3 Amplification curve and melting curve analysis of annealing temperature produced by FQ-PCR with primer 63F-335R

圖4 引物0817F-1196R溫度梯度的擴增曲線和熔解曲線Fig.4 Amplification curve and melting curve analysis of annealing temperature produced by FQ-PCR with primer 0817F-1196R

引物退火溫度以引物得到的熔解曲線中熔解峰有最高的峰值、最窄的峰型以及擴增曲線有最小的Cq值為最佳。圖3顯示，引物63F-335R在59.5 ℃得到的熔解峰峰值較高、峰型較窄，同時通過結合CASTILLO[1]關于引物63F-335R的退火溫度為60 ℃的報道，確定引物63F-335R的退火溫度為60 ℃。報道中顯示的引物0817F-1196R的退火溫度有所不同，退火溫度范圍為48～58 ℃。圖4顯示引物0817F-1196R在59.5 ℃得到的熔解峰峰值較高、峰型較窄、Cq值最小，由于適當提高退火溫度有利于提高FQ-PCR反應的特異性，因此選擇與59.5 ℃最接近的60 ℃為引物0817F-1196R的退火溫度。

2.2 細菌和真菌的FQ-PCR標準曲線

線性擴增要符合如下標準：FQ-PCR標準曲線的決定系數R2>0.98；PCR擴增效率(E)在90%～120%范圍內[10-11]。RODRIGUEZ等[12]報道，F(xiàn)Q-PCR標準曲線的決定系數R2越接近1、擴增效率越接近100%、斜率越接近-3.322，結果可信度越高。

2.2.1 單一細菌菌種DNA的標準曲線

采用引物63F-335R和60 ℃退火溫度分別對嗜酸乳桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、假單胞菌、不動桿菌的DNA進行擴增，獲得各自的標準曲線如圖5所示。

圖5 幾種細菌菌種DNA擴增的標準曲線Fig.5 Standard curves constructed after FQ-PCR amplification of serial dilutions of DNA of many bacterial strains

圖5顯示，每種細菌DNA的擴增符合線性擴增標準，標準曲線都有良好的線性關系，實驗重復性好，說明引物63F-335R適合對細菌進行FQ-PCR定量分析。

2.2.2 單一真菌菌種DNA的標準曲線

采用引物0817F-1196R和60 ℃退火溫度分別擴增釀酒酵母、青霉、曲霉的DNA，獲得各自的標準曲線見圖6。

圖6 幾種真菌菌種DNA擴增的標準曲線Fig.6 Standard curves constructed after FQ-PCR amplification of serial dilutions of DNA of many fungal strains

圖6顯示，釀酒酵母、青霉、曲霉的DNA擴增效果良好綜合圖5和圖6結果顯示，細菌通用引物63F-335R和真菌通用引物0817F-1196R對單一菌種的擴增效果較好。

2.2.3 混合細菌和混合真菌DNA的標準曲線

將混合細菌和混合真菌DNA分別進行FQ-PCR擴增，得到它們的標準曲線，結果見圖7和圖8。

圖7 混合細菌DNA的擴增曲線和標準曲線Fig.7 Amplification curve and standard curve constructed after FQ-PCR amplification of serial dilutions of mixed bacterial DNA注：標準曲線中混合細菌DNA濃度從大到小分別為 7×107、7×106、7×105、7×104、7×103 fg/μL。

圖7和圖8顯示，混合細菌和混合真菌DNA的擴增效果良好，得到的標準曲線都有很好的線性關系，沒有非特異擴增。

圖8 混合真菌DNA的擴增曲線和標準曲線Fig.8 Amplification curve and standard curve constructed after FQ-PCR amplification of serial dilutions of mixed fungal DNA 注：標準曲線中混合真菌DNA質量濃度從大到小分別為9×105、9×104、9×103、9×102、9×101 fg/μL。

由圖5和圖6可知，不同的細菌和真菌DNA擴增的標準曲線的決定系數R2、擴增效率和斜率都有所差異，通過SPSS分析可知，本文G+中嗜酸乳桿菌和金黃色葡萄球菌DNA擴增的標準曲線的斜率與G-(大腸桿菌、假單胞菌、不動桿菌)均有顯著差異(p<0.05)，而G+和G-組內的細菌之間沒有顯著差異，真菌中酵母與霉菌(青霉、曲霉)均存在顯著差異(p<0.05)。魚露和蝦油等自然發(fā)酵產品中多種細菌和真菌共存，且在發(fā)酵不同階段各種細菌、真菌的組成和數量會有波動。以僅含有一種細菌或真菌的DNA為模板擴增的標準曲線為標準可能比用混菌的DNA為模板的要低，而用混合菌株做標準曲線更趨近于真實情況，而本研究混合細菌和混合真菌即使在低濃度模板擴增都能得到良好的線性關系，試驗重復性好，靈敏度高，因此本文選擇混合細菌和混合真菌DNA擴增的標準曲線去測定魚露和蝦油中細菌和真菌數量。細菌標準曲線為y=-3.155x+33.220、R2=0.999；真菌標準曲線為y=-3.395x+32.671、R2=0.998。

本研究結果表明并非所有細菌和真菌通用引物都可用于FQ-PCR定量微生物，不合適的引物會出現(xiàn)非特異性擴增、擴增曲線不完整等結果，影響定量。而細菌通用引物63F-335R和真菌通用引物0817F-1196R無論對單一菌種或混合菌種，所得FQ-PCR標準曲線決定系數R2均>0.98，擴增效率E均在90%～120%范圍內，均符合線性擴增標準，可用于FQ-PCR定量。因此可以將FQ-PCR用于魚露、蝦油中微生物的定量研究。

2.3 FQ-PCR計數法及平板計數法的結果比較

采用FQ-PCR法用上述條件測定了蝦油中的細菌數量以及魚露發(fā)酵過程中細菌和真菌數量的變化，同時與平板計數法的結果進行了比較，結果見圖9。

圖9 平板計數法和FQ-PCR法定量魚露和蝦油中細菌和真菌的結果比較以及魚露發(fā)酵過程中細菌和真菌數量的變化Fig.9 Comparison of the results of bacterial and fungal populations in fish sauce and shrimp sauce determined by plate count method and FQ-PCR method, and detection of the change of bacterial and fungal populations in fish sauce during fermentation

圖9顯示，經 SPSS軟件方差分析，F(xiàn)Q-PCR法和平板計數法比較，有極顯著性差異(p<0.01)，F(xiàn)Q-PCR法比平板計數法檢測出的魚露和蝦油的細菌總數和真菌總數高1～2個數量級，這與NADKARNI[8]和YAMAMOTO[2]的研究結果一致。用過膜方法和離心方法分離魚露和蝦油中細菌，結果顯示兩種方法分離的細菌數量有顯著性差異(p<0.05)，且過膜方法的結果略高，推測可能是由于魚露及蝦油的鹽分較高，密度較大，離心不能將微生物完全沉淀下來，用過膜的方法得到的結果較準確。蝦油中細菌的平板計數結果顯示，10%鹽度培養(yǎng)基上的細菌數比0%鹽度培養(yǎng)基的低1～2個數量級，因此沒有將10%鹽度的結果列出。在魚露的真菌培養(yǎng)中，在0%鹽度PDA培養(yǎng)基上基本無真菌生長，在20%鹽度的培養(yǎng)基上經過一周左右時間有極少數真菌生長，因此沒有將魚露真菌培養(yǎng)的結果列出。

在魚露發(fā)酵過程中，用FQ-PCR方法檢測到魚露發(fā)酵過程中真菌數量雖略有增加，但一直在50 個/mL以下；而在平板計數法中，0%鹽度PDA培養(yǎng)基上基本無真菌生長，在20%鹽度的培養(yǎng)基上經過1周左右時間有極少數真菌生長，推測可能是魚露含有25%的鹽度，在這種環(huán)境下生存的真菌難以在無鹽的培養(yǎng)基上生長。國外研究在魚露發(fā)酵過程中用平板計數法也幾乎檢測不到真菌，與本研究的結果一致[13-14]。用FQ-PCR方法檢測到魚露發(fā)酵過程中細菌數量在3.16×104～3.16×105個/mL范圍內變動，數量遠高于真菌數。這說明在魚露發(fā)酵過程中真菌作用較小。許多文獻報道一些耐鹽或嗜鹽的乳酸菌是發(fā)酵魚產品中的優(yōu)勢菌群。

FQ-PCR的結果能很好地反映魚露發(fā)酵過程中細菌數量的變化規(guī)律，魚露發(fā)酵初期細菌數較高，可能是魚體表面及胃腸道、魚鰓等部位有一些不耐鹽的微生物尚未死亡，但是隨著發(fā)酵時間的延長，這些不耐鹽的微生物逐漸死亡，而在發(fā)酵過程中耐鹽和嗜鹽微生物逐漸成為優(yōu)勢菌，后期逐漸趨于穩(wěn)定。

3 結論

研究表明，F(xiàn)Q-PCR法可以有效定量魚露和蝦油中細菌和真菌數量，且測得的數據比平板計數法高1～2個數量級。

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