白介素-1受體拮抗劑對(duì)大鼠腸缺血/再灌注損傷的保護(hù)作用

金 辰，鄒民吉，張冬冬，付文亮，陳 瑤，劉 青，徐東剛

(1. 安徽醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，安徽 合肥 230032；2. 軍事認(rèn)知與腦科學(xué)研究所，北京 100850)

小腸是對(duì)缺血/再灌注(ischemia/reperfusion，I/R)損傷最敏感的器官，在失血性休克、創(chuàng)傷等情況下，均不可避免地會(huì)造成小腸的缺血性損傷，在解除或緩解缺血損傷的過(guò)程中，又會(huì)造成I/R損傷[1]。 I/R損傷的病理生理機(jī)制十分復(fù)雜，涉及氧自由基損傷、白細(xì)胞黏附浸潤(rùn)、炎癥介質(zhì)釋放、能量代謝障礙等多方面因素的參與[2-3]。腸道I/R不僅損害腸道本身，還會(huì)引發(fā)全身炎癥反應(yīng)綜合征、多臟器功能不全綜合征等[4]，是造成重傷傷員康復(fù)率、生存率低的重要因素之一。目前，臨床主要采用抗能量衰竭[5]、調(diào)控巨噬細(xì)胞激活轉(zhuǎn)變[6]、抑制氧自由基[7]等藥物治療腸I/R損傷，但這些藥物的療效并不是很理想，I/R損傷的死亡率并未得到有效改善。因此，研究者們有必要進(jìn)一步探究腸I/R損傷的發(fā)病機(jī)制，并努力研發(fā)出療效更好、安全性更高的藥物，進(jìn)而達(dá)到抑制繼發(fā)癥發(fā)生、改善預(yù)后、提高存活率的目的。許多研究發(fā)現(xiàn)，炎癥反應(yīng)在腸I/R損傷的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中至關(guān)重要。白細(xì)胞介素-1(interleukin-1，IL-1)是一種重要的促炎因子，生物學(xué)效用廣泛，可激活淋巴細(xì)胞，上調(diào)免疫功能，促進(jìn)其他炎性細(xì)胞因子表達(dá)，誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，刺激細(xì)胞增殖等[8]。白介素-1受體拮抗劑(interleukin-1 receptor antagonist,IL-1Ra)是天然抗炎因子，與IL-1競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合細(xì)胞膜上的IL-1受體，從而拮抗IL-1信號(hào)傳遞，阻斷其生物學(xué)功能，在調(diào)節(jié)免疫、抑制炎癥方面發(fā)揮重要作用[9]。

腸道是自由基產(chǎn)生最為豐富的組織，腸I/R時(shí)，黃嘌呤氧化酶系統(tǒng)活性增強(qiáng)，線粒體功能受損，產(chǎn)生大量氧自由基。氧自由基不僅會(huì)通過(guò)氧化損傷蛋白質(zhì)、脂質(zhì)與DNA，從而直接破壞細(xì)胞，并且會(huì)激活多條信號(hào)通路，增加促炎因子、轉(zhuǎn)錄因子等的表達(dá)，從而誘導(dǎo)、調(diào)節(jié)細(xì)胞的凋亡和壞死[10]。有研究表明，IL-1Ra具有一定的清除自由基和增強(qiáng)內(nèi)源性抗氧化系統(tǒng)的能力，對(duì)氧化應(yīng)激損傷具有一定的治療作用，可緩解腦、卵巢等多種器官的I/R損傷誘發(fā)的氧化應(yīng)激[11-13]，但其對(duì)腸I/R損傷是否具有防治作用尚不清楚。本研究通過(guò)夾閉腸系膜上動(dòng)脈制備腸I/R損傷大鼠模型，探討IL-1Ra對(duì)大鼠腸I/R后的腸損傷是否具有保護(hù)作用，為IL-1Ra的臨床應(yīng)用提供理論和實(shí)踐依據(jù)。

1 材料

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物♂ SD大鼠35只，體質(zhì)量245～265 g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證編號(hào)：SCXK(京)2016-0011。在每天光照12 h環(huán)境中飼養(yǎng)2周。

1.2重組蛋白的制備以本研究室保存的PBV220IL-1Ra cDNA重組表達(dá)質(zhì)粒，進(jìn)行工程菌培養(yǎng)和誘導(dǎo)表達(dá)，獲得含該蛋白的大量表達(dá)菌體，最后經(jīng)陰、陽(yáng)離子交換層析和純化，制備IL-1Ra蛋白。

1.3試劑腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)ELISA試劑盒(ERC102a)、IL-1β ELISA試劑盒(ERC007) 、IL-6 ELISA試劑盒(ERC003)，均購(gòu)自欣博盛生物科技公司；丙二醛(malondialdehyde，MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、髓過(guò)氧化物酶(myeloperoxidase, MPO)試劑盒，均購(gòu)自南京建成生物工程公司；RIPA裂解液(01408)、BCA 蛋白定量試劑盒(CW0014S)，均購(gòu)自北京康為世紀(jì)公司；蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑購(gòu)自羅氏生物公司。

1.4儀器Mode1550酶標(biāo)儀、蛋白純化系統(tǒng)Biologic Duo-Flow System (Bio-Rad公司)；DU640紫外分光光度計(jì)(美國(guó) Beckman 公司)；3K18高速低溫離心機(jī)(美國(guó) Sigma 公司)；GeneAmp PCR system 2700DNA擴(kuò)增儀(Bio-Rad公司)；URP Imagestore 7500凝膠成像分析系統(tǒng)(VILBER公司)；BIOFLO III發(fā)酵罐，LS-B高壓滅菌器，陰、陽(yáng)離子色譜分離層析柱Hit rap QFF，Hit rap SPFF (GE Healthcare公司)；FPLC純化儀(AKTA公司)。

2 方法

2.1動(dòng)物模型的制備及實(shí)驗(yàn)分組動(dòng)物于實(shí)驗(yàn)前禁食12 h，正常飲水。2.5%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉大鼠后，上腹正中部位開(kāi)腹，暴露腸系膜上動(dòng)脈(superior mesenteric artery, SMA)后，分離SMA并用動(dòng)脈夾夾閉其根部造成缺血，1 h后取下動(dòng)脈夾，使血流再灌注1 h。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后處死，距回盲結(jié)5 cm取小腸，生理鹽水清洗后，部分置于4%多聚甲醛中固定，剩余部分-70°C保存。

實(shí)驗(yàn)大鼠隨機(jī)分成5組：假手術(shù)(S)組、模型(I/R)組、10 mg·kg-1IL-1Ra+ I/R (C1) 組、20 mg· kg-1IL-1Ra+ I/R(C2) 組、50 mg·kg-1IL-1Ra+ I/R(C3)組。S組開(kāi)腹后只分離SMA；I/R組夾閉SMA 1 h后再灌注1 h；C1、C2、C3給藥組手術(shù)同I/R組，在松夾前15 min尾靜脈注射不同劑量的IL-1Ra。

2.2腸組織損傷評(píng)分4%多聚甲醛中固定的小腸組織經(jīng)脫水、透明、石蠟包埋后，制成2～3 μm組織切片后，經(jīng)蘇木精-伊紅(HE)染色，分別在100倍和400倍顯微鏡下隨機(jī)選5個(gè)非重疊視野觀察腸黏膜病理學(xué)改變。用Chiu氏法對(duì)腸組織病理?yè)p傷進(jìn)行評(píng)分，取平均值用于統(tǒng)計(jì)[14]，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)參見(jiàn)Tab 1。

2.3腸組織MPO檢測(cè)取10%腸組織，室溫解凍后勻漿，依照MPO試劑盒說(shuō)明，用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)在460 nm處測(cè)定吸光度，計(jì)算MPO活性。

Tab 1 Chiu’s scores standards

2.4腸組織勻漿IL-1β、IL-6、TNF-α的含量檢測(cè)取10%腸組織，室溫解凍后勻漿，分別按ELISA試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作，計(jì)算小腸組織IL-1β、IL-6、TNF-α的含量。

2.5腸組織SOD和MDA檢測(cè)取10%腸組織勻漿，用生理鹽水稀釋成1%組織勻漿液后，按SOD試劑盒說(shuō)明，采用黃嘌呤氧化酶法測(cè)定組織中SOD活性。

3 結(jié)果

3.1IL-1Ra蛋白制備將含有PV220/IL-1Ra重組表達(dá)質(zhì)粒的工程菌進(jìn)行培養(yǎng)，并誘導(dǎo)表達(dá)重組蛋白。隨后經(jīng)過(guò)陰、陽(yáng)離子交換層析和純化，制備了IL-Ra重組蛋白，純度>90 %(Fig 1)。

Fig 1 Purified IL-1Ra recombinant protein

M: Protein relative molecular mass markers; IL-1Ra: The recombinant protein prepared from purification

A: Histopathological pictures; B: Intestine injury score.##P<0.01vsS group;**P<0.01vsI/R group;△△P<0.01vsC2 group;▲▲P<0.01vsC1 group

3.2IL-1Ra對(duì)小腸組織病理學(xué)變化的影響腸組織石蠟切片經(jīng)HE染色，分別在100倍和400倍光鏡下觀察，S組大鼠未見(jiàn)明顯病理改變,絨毛頂端上皮微有脫落。I/R組可見(jiàn)明顯上皮細(xì)胞和絨毛頂端上皮脫落，固有層崩解，可見(jiàn)散在的出血灶和潰瘍，腺體明顯受損。應(yīng)用IL-1Ra后,大鼠腸黏膜損傷均明顯減輕，C2組大鼠黏膜僅有輕度損傷，絨毛上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，未見(jiàn)毛細(xì)血管和淋巴管擴(kuò)張。分別在100倍和400倍顯微鏡下隨機(jī)選5個(gè)非重疊視野觀察，根據(jù)Chiu氏評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)不同組大鼠的腸組織損傷進(jìn)行分級(jí)評(píng)分后，取平均值用于統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果顯示，I/R 2 h后，I/R組小腸組織受損嚴(yán)重，與S組相比，差異具有顯著性。而不同劑量給藥組大鼠的腸組織損傷程度較模型組均有所改善，20 mg·kg-1給藥組療效最佳(Fig 2)。

3.3IL-1Ra對(duì)小腸組織炎性因子的影響大鼠經(jīng)I/R處理后，相比于S組，I/R組的促炎因子IL-1β、IL-6、TNF-α含量明顯上升，再灌注前15 min尾靜脈給藥后，大鼠的小腸組織中上述炎癥因子含量均下降，C1、C2給藥組與I/R組相比，差異尤為明顯(Fig 3)。

3.4IL-1Ra對(duì)小腸中性粒細(xì)胞的影響I/R 2 h后，I/R組大鼠的中性粒細(xì)胞標(biāo)志物MPO指標(biāo)明顯上升，表明有大量中性粒細(xì)胞在腸組織聚集并活化，促進(jìn)炎癥反應(yīng)。而尾靜脈注射給藥后，MPO含量下降，中性粒細(xì)的浸潤(rùn)得以緩解(Fig 4)。

3.5IL-1Ra對(duì)小腸組織氧化應(yīng)激的影響如Fig 5所示，I/R組與假手術(shù)S組相比，腸組織中抗氧化酶SOD被大量消耗，活力明顯降低；腸組織中脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物MDA水平明顯增加。給藥治療后，與I/R組相比，給藥組大鼠 SOD活性有所增高，MDA含量有不同程度的降低，C2組治療效果明顯。

4 討論

IL-Ra是體內(nèi)天然存在的抗炎因子，通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性拮抗IL-1與膜上IL-1受體結(jié)合，阻斷IL-1發(fā)揮生物活性。2001年被美國(guó)FDA批準(zhǔn)用于臨床治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，同時(shí)，大量研究表明，其對(duì)于化療性腸炎、敗血癥性休克、腦中風(fēng)、哮喘[15]等疾病誘發(fā)的炎癥也有很好的治療作用。本實(shí)驗(yàn)采用動(dòng)脈夾夾閉腸系膜上動(dòng)脈1 h，松開(kāi)動(dòng)脈夾恢復(fù)血流灌注制備了大鼠腸I/R模型，在再灌注前15 min尾靜脈注射3個(gè)不同劑量的IL-Ra，探究IL-1Ra對(duì)腸I/R損傷的作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，相比于I/R組，IL-Ra不同給藥劑量組的炎癥因子、MPO、SOD、MDA及Chui氏評(píng)分指標(biāo)均有所改善，差異具有顯著性。表明IL-Ra可有效抑制氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，對(duì)腸I/R誘導(dǎo)的損傷具有很好的保護(hù)作用。

Fig 3 Effects of IL-1Ra on contents of IL-1β(A),

#P<0.05,##P<0.01vsS group;*P<0.05,**P<0.01vsI/R group

最新研究發(fā)現(xiàn)，IL-Ra對(duì)一些疾病伴隨的氧化應(yīng)激具有一定的抑制作用[11-13]。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示，IL-Ra給藥組大鼠腸組織氧化應(yīng)激指標(biāo)與模型組相比有明顯改善，進(jìn)一步表明IL-Ra對(duì)腸I/R損傷誘發(fā)的氧化應(yīng)激同樣也具有抑制作用。至于IL-Ra抑制氧化應(yīng)激的作用機(jī)制，目前還未有明確的闡述。IL-Ra 競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合IL-1R，阻斷IL-1作用于NF-κB和MAPK信號(hào)通路，我們推測(cè)其對(duì)氧化應(yīng)激的抑制作用很可能與NF-κB和MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)，具體作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

Fig 4 Effects of IL-1Ra on contents of neutrophile

##P<0.01vsS group;**P<0.01vsI/R group

Fig 5 Effects of IL-1Ra on contents of SOD(A)

##P<0.01vsS group;*P<0.05,**P<0.01vsI/R group;△△P<0.01vsC2 group

分析本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，IL-1β、IL-6、TNF-α、MPO 4個(gè)炎性指標(biāo)，高劑量C3組比中劑量C2組均略高，但差異都沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而高劑量組和中劑量組的SOD變化情況則基本一致，只有腸組織損傷評(píng)分和MDA指標(biāo)，C2和C3組比較有較大差異。這可能是因?yàn)镮L-1Ra在作用部位的濃度遠(yuǎn)高于IL-1后，拮抗阻斷IL-1的生物學(xué)作用達(dá)到飽和，繼續(xù)增加IL-1Ra給藥劑量，其拮抗作用不會(huì)隨之增強(qiáng)，即文中SOD指標(biāo)基本無(wú)變化，IL-1β、IL-6、TNF-α和MPO檢測(cè)指標(biāo)差異無(wú)顯著性。本實(shí)驗(yàn)只是初步研究了IL-1Ra對(duì)大鼠腸I/R誘導(dǎo)的腸損傷的保護(hù)作用，由于手術(shù)過(guò)程的繁瑣，本次實(shí)驗(yàn)組只制備了7只大鼠，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)只數(shù)較少，同時(shí)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物存在個(gè)體差異，可能出現(xiàn)高劑量組MDA值和組織損傷評(píng)分略高于中劑量組，但與I/R組相比，IL-1Ra高、中劑量組均能很好地降低MDA和組織損傷評(píng)分。在后續(xù)研究中，我們會(huì)增加實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的數(shù)量，再次檢測(cè)以上指標(biāo)，驗(yàn)證高、中劑量組的療效，并進(jìn)一步探究IL-1Ra對(duì)大鼠腸I/R誘導(dǎo)的腸損傷發(fā)揮保護(hù)作用的具體機(jī)制。

總之，腸I/R損傷是臨床常見(jiàn)疾病，該損傷不僅會(huì)損傷局部腸組織，還可能導(dǎo)致腸黏膜屏障損傷，致使細(xì)菌移位、炎性介質(zhì)釋放，誘發(fā)急性肺損傷、系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)綜合征等遠(yuǎn)端器官或全身的炎癥反應(yīng)[4]，致死率高。因此，針對(duì)腸I/R損傷的治療，是重創(chuàng)傷救治領(lǐng)域密切關(guān)注的熱點(diǎn)問(wèn)題。本研究發(fā)現(xiàn)，IL-1Ra對(duì)腸I/R誘發(fā)的的炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激反應(yīng)具有明顯的抑制作用，在腸I/R損傷的治療方面具有巨大的潛力，有望成為治療這類疾病的新藥。

(致謝：本實(shí)驗(yàn)在軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所基因組工程研究室完成，衷心感謝各位老師和同學(xué)的幫助與鼓勵(lì)！)

[1] Kalogeris T, Baines C P, Krenz M, et al. Ischemia/reperfusion[J].ComprPhysiol, 2016,7(1):113-70.

[2] Woodman O L, Long R, Pons S, et al. The cardioprotectant 3’,4’-dihydroxyflavonol inhibits opening of the mitochondrial permeability transition pore after myocardial ischemia and reperfusion in rats [J].PharmacolRes,2014,81:26-33.

[3] Bertoni S, Arcaro V, Vivo V, et al. Suppression of inflammatory events associated to intestinal ischemia-reperfusion by 5-HT1A blockade in mice [J].PharmacolRes,2014，81:17-25.

[4] 李 茜,張彥敏,關(guān) 玥，等. 人參皂苷Rg1對(duì)大鼠腸缺血/再灌注損傷的影響[J].中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2010,26(3)：358-61.

[4] Li Q, Zhang Y M, Guan Y, et al. Effect of ginsenoside Rgl on gut injury following intestinal ischemia reperfusion in rats[J].ChinPharmacolBull, 2010,26(3)：358-61.

[5] Thurman J M. Triggers of inflammation after renal ischemia-reperfusion [J].ClinImmunol，2007,123(1):7-13.

[6] 劉衛(wèi)鋒,溫仕宏,李云勝, 等. 重組旋毛蟲(chóng)蛋白rTsP38對(duì)小鼠腸缺血/再灌注腸損傷的保護(hù)作用及機(jī)制研究[J].中國(guó)藥理學(xué)通報(bào),2014,30(9)：1235-41.

[6] Liu W F, Wen S H, Li Y S, et al. The protective effects of rTsP38 on intestinal ischemia/reperfusion injury in mice and its underlying mechanisms[J].ChinPharmacolBull, 2014,30(9)：1235-41.

[7] Sargis R M, Subbaiah P V. Protection of membrane cholesterol by sphingomyelinagainst free radical-mediated oxidation [J].FreeRadicBiolMed, 2006,40(12):2092-102.

[8] Vivo V, Zini I, Cantoni A M，et al. Protection by the EPH-EPHRIN system against mesenteric ischemia-reperfusion injury [J].Shock, 2017,48(6):681-9.

[9] Lin Y Z, Yao S Y, Veach R A, et al. Inhibition of nuclear translocation of transcription factor NF-kappa a synthetic peptide containing a cell membrane-permeable motif and nuclear localization sequence[J]. J BiolChem,1995,270(24):14255-8.

[10] Wen S H, Ling Y H, Li Y,et al. Ischemic postconditioning during reperfusion attenuates oxidative stress and intestinal mucosal apoptosis induced by intestinal ischemia/reperfusion viaaldose reductase[J].Surgery, 2013,153(4):555-64.

[11] Wahab F , Santos-Junior N N, Almeida Rodrigues R P, et al. Interleukin-1 receptor antagonist decreases hypothalamic oxidative stress during experimental sepsis [J].MolNeurobiol,2016,53(6):3992-8.

[12] Pradillo J M, Murray K N, Coutts G A, et al. Reparative effects of interleukin-1 receptor antagonist in young and aged/co-morbid rodents after cerebral ischemia[J].BrainBehavImmun, 2017,61:117-26.

[13] Nayki U A, Nayki C, Cetin N, et al. Effect of Kineret on ovarian ischemia reperfusion injury in a rat model[J].JObstetGynaecolRes, 2016,42(11):1525-33.

[14] Chiu C J，McArdle A H, Brown R, et al. lntestinal mucosal lesion in low-flow states[J].ArchSurg, 1970,101(4):478-83.

[15] 劉中成，張艷芬. IL-1ra-Fcε融合基因在大鼠體內(nèi)表達(dá)條件優(yōu)化及免疫原性分析[J].中國(guó)藥理學(xué)通報(bào),2010,26(5)：638-42.

[15] Liu Z C, Zhang Y F. Optimization on expression condition of IL-1ra-Fcε fusion gene in rats and its immunogenicity analysis[J].ChinPharmacolBull, 2010,26(5)：638-42.