墨旱蓮石油醚提取物對(duì)STZ糖尿病大鼠生化指標(biāo)及腎組織病理學(xué)的影響

程 敏，胡選生，程 楠，張曉文

(商洛學(xué)院生物醫(yī)藥與食品工程學(xué)院制藥工程系，商洛市GAP科研工程中心，陜西 商洛 726000)

糖尿病是一種以高血糖為特點(diǎn)，由胰島素分泌不全或功能缺陷所引發(fā)的內(nèi)分泌代謝性疾病[1]。糖尿病腎病是糖尿病引發(fā)的微血管并發(fā)癥之一，也是糖尿病患者致死的主要原因之一[2]。糖尿病腎病發(fā)生及發(fā)展是多種因素相互作用的結(jié)果，其確切的發(fā)病機(jī)制至今尚未明了[3]。

墨旱蓮為菊科鱧腸屬植物鱧腸的干燥地上部分，具有抗蛇毒[4]、抗高血脂[5]、抗腫瘤[6]、抗真菌活性[7]。Xi等[8]采用體外α-淀粉酶和二肽基肽酶IV(dipeptidyl peptidase IV,DPP-IV)對(duì)墨旱蓮的有效降糖部位進(jìn)行了篩選，結(jié)果表明墨旱蓮對(duì)DPP-IV酶的抑制活性主要集中在石油醚部位。但該提取物對(duì)糖尿病大鼠血清中與糖脂代謝相關(guān)的生化指標(biāo)以及糖尿病腎病的影響，國(guó)內(nèi)外鮮有報(bào)道。本研究利用鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)建立2型糖尿病大鼠模型，探究墨旱蓮石油醚提取物(petroleum ether extract ofEcliptaprostrata，PEEEP)對(duì)STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠血清中血糖、胰島素、甘油三酯(total glycerides,TG)、膽固醇(total cholesterol，TC)、肌酐(creatinine，CRE)、尿素(urea nitrogen, BUN)、尿酸(uric acid，UA)等生化指標(biāo)以及腎組織病理學(xué)的影響，為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用墨旱蓮這一傳統(tǒng)的藥食兩用中草藥提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1藥物墨旱蓮(購(gòu)于陜西西安，經(jīng)中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院商洛中藥材GAP科研工程中心李筱玲講師鑒定為墨旱蓮)全草300 g，以2倍量體積80%乙醇回流提取3次,每次2 h,合并提取液,減壓除去乙醇,得濃縮液。采用2倍量濃縮液體積的40%石油醚萃取，減壓濃縮,干燥,稱重,得PEEEP干粉25 g,4℃冷藏保存。臨用前，用蒸餾水將干粉配制成1、2、4 kg·L-1的藥液備用。鹽酸二甲雙胍片購(gòu)自中美上海施貴寶制藥有限公司，批號(hào): 1307093。

1.2動(dòng)物SD大鼠，♂，體質(zhì)量(125±6)g，購(gòu)于第四軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物中心，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(軍)2007-007。飼養(yǎng)于商洛學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室。

1.3試劑STZ(美國(guó) Sigma 公司)；肝素(酷爾化學(xué)科技有限公司)；TNF-α抗體(上海瑞奇生物科技有限公司)；胰島素、TC、TG、CRE、BUN、UA測(cè)定試劑盒，均為長(zhǎng)春匯力生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。

1.4儀器血糖儀(三諾)；7080全自動(dòng)分析儀(日本日立公司)；顯微鏡及拍照系統(tǒng)(日本Olympus公司)。

1.5動(dòng)物模型的制備及分組將♂ SD大鼠60只，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為正常對(duì)照組(10只)和造模組(50只)。正常對(duì)照組大鼠給予普通飼料喂養(yǎng)，造模組大鼠給予高能飼料喂養(yǎng)8周后，隔夜禁食不禁水12 h，腹腔注射STZ(溶于預(yù)冷的0.1 mL pH為4.5的磷酸緩沖液)30 mg·kg-1，3 d后尾尖取血，利用血糖儀測(cè)其空腹血糖，空腹血糖值≥11.1 mmol·L-1視為造模成功[9]。將造模成功的大鼠隨機(jī)分為模型組、二甲雙胍組及PEEEP低、中、高劑量組(100、200、400 mg·kg-1)，每組9只。鹽酸二甲雙胍組給予劑量為400 mg·kg-1，正常組和模型組給予等量的蒸餾水。每天早、晚灌胃2次，連續(xù)4周。實(shí)驗(yàn)期間大鼠自由攝食飲水。

1.6相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)給藥4周后，大鼠禁食不禁水12～16 h，乙醚麻醉，心臟取血5 mL，3 500 r·min-1離心10 min分離血清，利用相應(yīng)試劑盒分別測(cè)定大鼠血清中血糖、胰島素、TG、TC、CRE、BUN、UA含量。

1.7腎臟HE病理學(xué)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)4周后處死動(dòng)物，腎臟用10%福爾馬林固定后，石蠟包埋，常規(guī)切片，HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察腎臟的病理學(xué)變化。

1.8Westernblot檢測(cè)采用 Western blot 法，對(duì)各組大鼠腎組織中TNF-α的蛋白表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)。提取腎組織中總蛋白，用半干法電泳轉(zhuǎn)移至PVDF膜，用脫脂奶粉封閉，加入TNF-α和β-actin一抗，然后加入相應(yīng)的二抗，用化學(xué)發(fā)光法顯影。對(duì)條帶進(jìn)行掃描，分析條帶中吸光度值，以目的蛋白TNF-α和β-actin內(nèi)參照的吸光度值比值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果

2.1PEEEP對(duì)糖尿病大鼠相關(guān)生化指標(biāo)的影響由Tab 1可見(jiàn)，與正常組相比，糖尿病模型大鼠血糖明顯升高(P<0.01)；與模型組比較，各給藥組的血糖均有下降的趨勢(shì)，PEEEP大劑量組對(duì)大鼠空腹血糖的降低趨勢(shì)尤為明顯(P<0.01)。表明PEEEP對(duì)2型糖尿病大鼠有良好的降糖效果。與正常對(duì)照組比較，模型組胰島素含量明顯降低(P<0.05)；與模型組相比，PEEEP低、中、高劑量組胰島素均有不同程度的提高，提高率分別為7.9%、13.2%、21.1%，表明PEEEP能夠明顯促進(jìn)胰島素的分泌。

TG和 TC是高血脂癥的重要指標(biāo)[10]。由Tab 1可見(jiàn)，模型組大鼠TC、TG含量明顯高于正常對(duì)照組，高劑量PEEEP組TC、TG含量明顯低于模型組(P<0.05，P<0.01)。表明PEEEP對(duì)糖尿病所引起的血脂代謝紊亂有一定的改善作用，且高劑量組的改善效果尤為明顯(P<0.05，P<0.01)。

Tab 1 Effects of PEEEP on blood glucose, insulin, TG and TC in STZ induced diabetic rats(±s, n=9)

*P<0.05,**P<0.01vsmodel

2.2PEEEP對(duì)2型糖尿病腎病的影響由Tab 2可見(jiàn)，與正常對(duì)照組相比，模型組大鼠的CRE、BUN、UA水平明顯升高(P<0.01)；與模型組比較，PEEEP實(shí)驗(yàn)組大鼠的CRE、BUN、UA含量均低于模型組，且隨著PEEEP濃度的增加而降低，但PEEEP低、中劑量組大鼠BUN水平無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與模型組比較，陽(yáng)性對(duì)照組和PEEEP高劑量組大鼠的腎臟指數(shù)明顯降低(P<0.01，P<0.05)，PEEEP中、低劑量組也有一定的降低作用，但沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。以上結(jié)果表明，PEEEP對(duì)STZ誘導(dǎo)的糖尿病腎病的腎臟損傷有一定的保護(hù)作用。

Tab 2 Effects of PEEEP on CRE, BUN, UA and kidney index in STZ induced diabetic rats(±s, n=9)

*P<0.05,**P<0.01vsmodel

2.3PEEEP對(duì)STZ糖尿病大鼠腎臟形態(tài)學(xué)的影響經(jīng)HE染色，光鏡觀察，腎組織病理形態(tài)如Fig 1所示。正常大鼠腎小球形態(tài)規(guī)則，腎小管排列整齊緊密，管腔刷狀緣清晰(Fig 1A)；模型大鼠腎小球明顯腫脹，體積增大，毛細(xì)血管袢損傷，基底膜增厚，系膜基質(zhì)增多，腎小囊變窄，腎小管上皮細(xì)胞有不同程度水腫浸潤(rùn)、空泡變性以及壞死，腎小管內(nèi)可見(jiàn)脫落的細(xì)胞碎片(Fig 1B)；與模型組比較，鹽酸二甲雙胍組腎小球腫脹明顯改善，腎小囊有所恢復(fù)，腎小管結(jié)構(gòu)趨于清晰(Fig 1C)；PEEEP高劑量組腎小球和腎小管水腫明顯減輕，腎小囊逐漸變窄，腎間質(zhì)炎性細(xì)胞減少，刷狀緣逐漸清晰(Fig 1F)；PEEEP中劑量組腎小球腫脹明顯減輕，管腔變窄，腎小管管腔逐漸清晰，刷狀緣可見(jiàn)(Fig 1E)；PEEEP低劑量組腎小球腫脹有所緩解，腎小管結(jié)構(gòu)也較模型組清晰(Fig 1D)?？傊?，PEEEP各劑量組與模型組相比較，腎小球和腎小管結(jié)構(gòu)均趨于正常，且與藥物劑量呈一定的量效關(guān)系，即劑量越大，腎臟組織病變程度也愈輕。

2.4PEEEP對(duì)STZ糖尿病大鼠腎臟組織中TNF-α蛋白表達(dá)的影響Western blot檢測(cè)各組大鼠腎臟組織中TNF-α蛋白的表達(dá)，如Fig 2所示，與正常組相比，模型組大鼠TNF-α蛋白表達(dá)明顯增加，PEEEP各劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組均能不同程度地下調(diào)TNF-α蛋白的表達(dá)，且PEEEP高、中劑量組效果明顯(P<0.05)。

3 討論

胰島素是胰島β細(xì)胞分泌的唯一能夠降低血糖的激素。本研究結(jié)果表明，糖尿病大鼠血清中胰島素含量隨PEEEP給藥濃度的增加而升高，表明PEEEP能夠促進(jìn)胰島素分泌，可能是其有效降低血糖的作用機(jī)制之一。Hu等[12]研究顯示，高水平的甘油三酯和膽固醇是糖尿病誘發(fā)動(dòng)脈粥樣硬化和冠心病的首要因素。Zhao等[5]和Kim等[11]研究表明，墨旱蓮提取物能夠有效降低低密度膽固醇，同時(shí)提高高密度膽固醇。本研究表明，PEEEP能明顯降低STZ誘導(dǎo)的2型糖尿病大鼠的甘油三酯和膽固醇水平。由此可見(jiàn)，PEEEP具有改善糖尿病患者血脂異常，降低患動(dòng)脈粥樣硬化和冠心病風(fēng)險(xiǎn)的潛力。

Fig 1 Effects of PEEEP on kidney in STZ induced diabetic rats(HE staining, ×200)

A: Normal; B: Model; C: Metformin 400 mg·kg-1; D: PEEEP 100 mg·kg-1; E: PEEEP 200 mg·kg-1; F: PEEEP 400 mg·kg-1. 1: Glomeruli; 2: Renal capsules; 3: Glomerular capillary loop; 4: Proximal convoluted tubule; 5: Distal convoluted tubule.

Fig 2 Effects of PEEEP on expression of TNF-α protein in STZ induced diabetic rats kidney

1: Normal; 2: Model; 3: Metformin 400 mg·kg-1; 4:PEEEP 100 mg·kg-1; 5: PEEEP 200 mg·kg-1; 6: PEEEP 400 mg·kg-1.*P<0.05,**P<0.01vsmodel

本研究結(jié)果顯示，PEEEP高劑量能夠明顯降低腎功能指標(biāo)尿酸和肌酐水平。糖尿病腎病是糖尿病并發(fā)癥之一，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)PEEEP除了能夠降低血糖、血脂，升高胰島素含量外，對(duì)糖尿病模型大鼠的腎臟具有一定保護(hù)作用，高劑量組效果尤為明顯。尿酸是人體嘌呤代謝途徑的最后代謝產(chǎn)物，血液中高尿酸是高尿酸血癥的特征，降低尿酸水平是預(yù)防和治療痛風(fēng)的有效途徑之一[13]。本實(shí)驗(yàn)中模型組大鼠尿酸水平明顯高于正常組，該結(jié)果與Yuan等[14]的研究結(jié)果一致，而PEEEP各劑量組均能夠明顯降低尿酸水平，高劑量效果尤為明顯,表明PEEEP對(duì)痛風(fēng)有一定的改善作用。

宋霖等[15]研究表明，TNF-α是體內(nèi)重要的、具有廣泛生物活性的細(xì)胞因子，TNF-α在2型糖尿病血清中明顯升高，并隨著腎臟損傷出現(xiàn)進(jìn)一步升高。本研究中，模型組大鼠腎臟組織中TNF-α表達(dá)增加，而PEEEP各劑量組TNF-α表達(dá)下降，表明PEEEP可能通過(guò)抑制模型大鼠腎臟組織中TNF-α的表達(dá)，從而發(fā)揮腎臟保護(hù)作用。本研究首次評(píng)價(jià)PEEEP對(duì)STZ糖尿病大鼠的生化指標(biāo)以及腎組織病理學(xué)的影響，其毒性以及有效成分有待進(jìn)一步分析。

綜上所述，本研究通過(guò)建立的糖尿病腎病大鼠模型，證實(shí)PEEEP可降低糖尿病大鼠血糖、血脂、尿素、尿酸、肌酐含量，提高胰島素含量，同時(shí)對(duì)腎臟有一定的保護(hù)作用，為墨旱蓮的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供了理論依據(jù)。

(致謝：本實(shí)驗(yàn)主要在商洛學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室完成，感謝課題組所有成員對(duì)實(shí)驗(yàn)的指導(dǎo)與幫助。)

[1] 張 婷, 李慧芳, 呂 博, 等. 新疆兩色金雞菊提取物抗脂質(zhì)過(guò)氧化及對(duì)糖尿病小鼠的保護(hù)作用[J]. 中國(guó)藥理學(xué)通報(bào), 2016,32(9): 1272-8.

[1] Zhang T, Li H F, Lyu B, et al. Inhibition of lipid peroxidation and protective effects on diabetic mice of extracts fromCoreopsistinctoriaNutt. in Xinjiang[J].ChinPhamacolBull, 2016,32(9): 1272-8.

[2] 郭福團(tuán), 許雄偉, 潘建峰, 等. 桑枝多糖對(duì)糖尿病腎病小鼠腎皮質(zhì)氧化應(yīng)激作用的影響[J]. 中國(guó)藥理學(xué)通報(bào), 2016,32(8): 1148-52.

[2] Guo F T, Xu X W, Pan J F, et al. The anti-oxidative effect ofRamulusmoripolysaccharides on diabetic nephropathy mice[J].ChinPhamacolBull, 2016,32(8): 1148-52.

[3] 趙辛元，柯志強(qiáng)，徐 魁，等.舒血寧對(duì)糖尿病腎病大鼠腎臟保護(hù)作用的研究[J]. 中國(guó)糖尿病雜志, 2017,25(5):454-7.

[3] Zhao X Y, Ke Z Q, Xu K, et al. Protective effect of Shuxuening on kidney in rats with diabetic nephropathy[J].ChinJDiabetes, 2017,25(5):454-7.

[4] Pithayanukul P, Laovachirasuwan S, Bavovada R,et al. Anti-venom potential of butanolic extract ofEcliptaprostrataagainst Malayan pit viper venom[J].JEthnopharmacol, 2004,90:347-52.

[5] Zhao Y, Peng L, Lu W,et al. Effect ofEcliptaprostrataon lipid metabolism in hyperlipidemic animals[J].ExpGeronto, 2015,62:37-44.

[6] Liu Q, Zhao H, Zhong X,et al.EcliptaprostrataL. phytochemicals: isolation, structure elucidation, and their antitumor activity[J].FoodChemToxicol, 2012,50: 4016-22.

[7] Nagabhushan, Raveesha K A, Shrisha D L. Antidermatophytic activity ofEcliptaprostrataL.against human infective Trichophyton and Microsporum spp[J].IntJChemAnalSci, 2013,4: 136-8.

[8] Xi F M, Li C T, Han J, et al.Thiophenes, polyacetylenes and terpenes from the aerial parts ofEclipataprostrata[J].BioorganMedChem, 2014,22:6515-22.

[9] Wang Q, Jiang C, Fang S,et al. Antihyperglycemic, antihyperlipidemic and antioxidant effects of ethanol and aqueous extracts of Cyclocarya paliurus leaves in type 2 diabetic rats[J].JEthnopharmacol, 2013,150(3):1119-27.

[10] 陳春娟，朱振元，陳 璐，等.低分子量蛹蟲(chóng)草多糖降血糖活性研究[J]. 現(xiàn)代食品科學(xué), 2017,33(4):1-7.

[10] Chen C J, Zhu Z Y, Chen L.Study of the hypoglycemic activity of low molecular weight polysaccharides fromCordycepsmilitaris[J].ModFoodSciTechnol, 2017,33(4):1-7.

[11] Kim D, Lee S, Choi J,et al. The butanol fraction ofEcliptaprostrata(Linn) effectively reduces serum lipid levels and improves antioxidant activities in CD rats[J].NutrRes, 2008,28: 550-4.

[12] Hu X S, Cheng D L, Zhang Z Y,et al. Antidiabetic activity ofHelicterangustifoliaroot[J].PharmBiol, 2016,54(6):938-44.

[13] 普菁瑩, 牛艷芬, 高麗輝, 等. 3,5,2’,4’-四羥基查爾酮對(duì)尿酸誘導(dǎo)高尿酸血癥小鼠尿酸排泄的影響研究[J]. 中國(guó)藥理學(xué)通報(bào), 2015,31(8): 1091-5.

[13] Pu J Y, Niu Y F, Gao L H, et al. Effects of 3,5,2’,4’-tetrahydroxychalcone on urate excretion in hyperuricemic mice[J].ChinPhamacolBull, 2015,31(8): 1091-5.

[14] Yuan X, Hu X S, Liu Y, et al.Invitroandinvivoanti-diabetic activity of extracts fromActinidiakolomikta[J].IntJBiol, 2014,6(3):1-10.

[15] 宋 霖，張 寧.糖尿病腎病患者尿液白細(xì)胞介素-6與腫瘤壞死因子-α檢測(cè)的臨床意義[J]. 檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)與臨床, 2017,4(3):348-9.

[15] Song L, Zhang N. Clinical significance of urinary IL-6 and TNF-α in patients with diabetic nephropathy[J].LabMedClin, 2017,4(3):348-9.