UPLC-MS法研究艾迪注射液對(duì)大鼠體內(nèi)阿霉素藥代動(dòng)力學(xué)的影響

陸 苑, 潘 潔, 楊淑婷, 劉春花, 李勇軍, 劉 亭

(1. 貴州省藥物制劑重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；2. 民族藥與中藥開發(fā)應(yīng)用教育部工程研究中心；3. 貴州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院；4. 國家苗藥工程技術(shù)研究中心，貴州 貴陽 550004)

艾迪注射液(Aidi injection，ADI)為《國家基本醫(yī)療藥物目錄》品種，也是貴州省名優(yōu)注射劑大品種，由斑蝥、人參、黃芪、刺五加組成，具有清熱解毒、消瘀散結(jié)功能[1]。斑蝥為君藥，也是抑制腫瘤細(xì)胞的有效成分[2]；人參、黃芪、刺五加為佐藥，具有誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、抑制腫瘤細(xì)胞增殖、抑制腫瘤血管生成等多方面協(xié)同抗腫瘤作用[3-5]。ADI在治療惡性腫瘤時(shí)，通常與阿霉素(doxorubicin, DOX)、奧沙利鉑、5-氟尿嘧啶、羥基喜樹堿等化療藥物聯(lián)合使用[6-8]。2016年，ADI銷售額近20億元，已成為臨床抗腫瘤中藥的常用藥物。DOX又稱多柔比星，為蒽醌類抗腫瘤藥，可抑制RNA和DNA的合成，對(duì)RNA的抑制作用最強(qiáng)，抗癌譜較廣[9]，其機(jī)制主要是通過產(chǎn)生氧自由基、脂質(zhì)過氧化作用，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。但臨床上DOX易引起嚴(yán)重心臟毒性[10]，這是DOX及其活性代謝產(chǎn)物阿霉素醇(doxorubicinol, DOXol)共同的藥理作用結(jié)果[11]。因此，本研究將考察ADI與DOX聯(lián)合用藥，是否影響DOX體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)過程，這對(duì)促進(jìn)DOX臨床合理配伍用藥，保證用藥的有效性和安全性有重要意義。

1 材料

1.1儀器超高液相色譜-三重四級(jí)桿質(zhì)譜聯(lián)用儀(ACQUITY UPLC，美國沃特世公司，包括二元梯度泵、真空脫氣機(jī)、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、電噴霧三重四級(jí)質(zhì)譜儀、Masslynx 4.1質(zhì)譜工作站)；Allegra 64R低溫高速離心機(jī)(美國Beckman Coulter公司)；EL204萬分之一電子天平(梅特勒-托利多儀器上海有限公司)；MTN-2800D氮吹濃縮裝置(奧特塞恩斯儀器公司)。

1.2藥物與試劑艾迪注射液(批號(hào)20150627，規(guī)格10 mL/支)由貴州益佰制藥有限責(zé)任公司提供；鹽酸阿霉素(純度>98%，批號(hào)：25316-40-9)、鹽酸托烷司瓊對(duì)照品(純度>98%，批號(hào)：105826-92-4)均購自大連美侖生物科技有限公司；阿霉素醇對(duì)照品(純度>98%，批號(hào)：54193-28-1)購于加拿大TRC；色譜甲醇和乙腈(德國Merck 公司)；實(shí)驗(yàn)用水為超純水；其余溶劑均為分析純。

1.3實(shí)驗(yàn)動(dòng)物健康SD大鼠，♂，體質(zhì)量180～200 g，SPF級(jí)，購自長沙市天勤生物技術(shù)有限公司，動(dòng)物許可證編號(hào)：SCXK (湘) 2014-0011。動(dòng)物飼養(yǎng)于(22±2)°C、相對(duì)濕度(60 ± 10)%的環(huán)境中，飼養(yǎng)管理均嚴(yán)格按照實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的要求及規(guī)則，實(shí)驗(yàn)前飼養(yǎng)1周適應(yīng)環(huán)境。

2 方法

2.1標(biāo)準(zhǔn)溶液配制DOX標(biāo)準(zhǔn)溶液：稱取DOX對(duì)照品5.1 mg，加入適量甲醇超聲，使其溶解并定容至10 mL，得0.51 g·L-1的DOX儲(chǔ)備液，-20℃保存。DOXol標(biāo)準(zhǔn)品溶液：DOXol對(duì)照品規(guī)格為每支1 mg，加入1 mL甲醇，超聲使其溶解，得0.1 g·L-1的DOXol儲(chǔ)備液，-20℃保存。托烷司瓊內(nèi)標(biāo)溶液：稱取托烷司瓊10.2 mg，甲醇超聲溶解并定容至10 mL，得濃度為1.02 g·L-1的儲(chǔ)備液，再逐級(jí)稀釋至濃度為50 μg·L-1的內(nèi)標(biāo)溶液，-20℃保存。

2.2分組給藥及樣品采集SD大鼠隨機(jī)分成聯(lián)合用藥組和單獨(dú)用藥組，每組6只，實(shí)驗(yàn)前禁食1夜，自由飲水。聯(lián)合給藥組連續(xù)腹腔注射ADI 14 d (10 mL·kg-1)，于d 15尾靜脈注射DOX (7 mg·kg-1)，單獨(dú)給藥組連續(xù)腹腔注射相同時(shí)間、同等體積的生理鹽水，于d 15尾靜脈注射相同劑量的DOX。兩組大鼠給藥后2、5、10、15、20、30 min及1、2、4、8、12、24、36 h經(jīng)右側(cè)尾靜脈取血約0.3 mL，置于涂有肝素鈉的離心管中，6 000 r·min-1離心3 min，分離血漿，于-20℃儲(chǔ)存。

2.3血漿處理方法準(zhǔn)確吸取血漿100 μL，加50 μL托烷司瓊內(nèi)標(biāo)溶液(50 μg·L-1)，渦混1 min，加入含5%甲酸的甲醇溶液450 μL，渦混3 min，超聲5 min，15 000 r·min-1離心10 min，取上清液于40℃空氣吹干，殘?jiān)?00 μL 50%甲醇溶液溶解，15 000 r·min-1離心10 min，取上清液1 μL進(jìn)樣，進(jìn)行UPLC-MS分析。

2.4UPLC-MS液質(zhì)條件

2.4.1UPLC色譜條件 Acquity UPLC BEH C18(2.1 mm×50 mm，1.7 μm)色譜柱；柱溫45℃；流動(dòng)相0.1 %甲酸乙腈(a)-0.1 %甲酸水(b)；0～0.5 min 10%～30 % a，0.5～1.5 min 30%～60 % a，1.5～2.0 min 60%～90% a，2.0～3.0 min 10% a；流速0.35 mL·min-1。

2.4.2質(zhì)譜條件 采用電噴霧(ESI)離子源，在正離子電離模式下為選擇離子監(jiān)測模式(selected or single ion recording, SIR)的質(zhì)譜掃描方式進(jìn)行測定，DOX、DOXol、托烷司瓊(IS)的質(zhì)荷比(m/z)分別為544.3、546.3、285.3；三者錐孔電壓分別為20 V、20 V、32 V。其他具體質(zhì)譜參數(shù)：毛細(xì)管電壓3 kV，離子源溫度120℃，去溶劑氣(N2)650 L·h-1，去溶劑氣溫度350℃，碰撞氣(氬氣)0.16 mL·min-1。

2.5方法學(xué)考察

2.5.1專屬性 取大鼠的空白血漿100 μL，不加內(nèi)標(biāo)，空白血漿加入混合標(biāo)準(zhǔn)溶液和內(nèi)標(biāo)，靜脈注射DOX 10 min的血漿樣品，按照“2.3”處理。

2.5.2線性 取系列不同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液(DOX、DOXol)和內(nèi)標(biāo)各50 μL，加入100 μL的空白血漿，同“2.3”項(xiàng)下操作處理后進(jìn)樣分析。以待測物的峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積之比(A/Ai)為縱坐標(biāo)Y，各物質(zhì)濃度(c)為橫坐標(biāo)X用加權(quán)最小二乘法進(jìn)行線性回歸，權(quán)重系數(shù)為1/X，求得標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.5.3回收率與基質(zhì)效應(yīng) 取100 μL空白血漿分別配制含DOX、DOXol的低、中、高3個(gè)濃度的質(zhì)控(QC)樣品，每個(gè)濃度平行6份，按“2.3”項(xiàng)下操作(A樣品)。另取空白血漿，除不加混合標(biāo)準(zhǔn)溶液與內(nèi)標(biāo)外，其余按“2.3”項(xiàng)下操作，向獲得的上清液中加入相應(yīng)3個(gè)濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液和內(nèi)標(biāo)(B樣品)；另取上述3個(gè)濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液與內(nèi)標(biāo)，以400 μL初始流動(dòng)相溶解(C樣品)。A樣品與B樣品色譜峰面積之比為提取回收率，B樣品與C樣品的色譜峰面積之比為基質(zhì)效應(yīng)。

2.5.4精密度與準(zhǔn)確度 按“2.5.2”項(xiàng)下分別配制含有DOX、DOXol的低、中、高3個(gè)濃度的質(zhì)控(QC)樣品，各成分濃度分別平行處理6份，連續(xù)測定3 d，與標(biāo)準(zhǔn)曲線同時(shí)進(jìn)行。根據(jù)當(dāng)日標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算QC樣品的濃度，評(píng)價(jià)方法的準(zhǔn)確度與日內(nèi)、日間精密度。

2.5.5穩(wěn)定性 按“2.5.2”項(xiàng)下分別配制低、中、高3個(gè)濃度的質(zhì)控(QC)樣品，樣品處理后置于自動(dòng)進(jìn)樣器中，在0、12 h分別進(jìn)樣分析；同法配制低、中、高3個(gè)濃度QC樣品，分別4℃下冷藏24 h，反復(fù)凍融3次后進(jìn)樣分析，考察大鼠血漿樣品中DOX與DOXol在室溫和冷藏不同時(shí)間下的穩(wěn)定性，每一濃度6個(gè)樣本分析。

3 結(jié)果

3.1專屬性取大鼠的空白血漿100 μL，按照“2.3”處理(不加內(nèi)標(biāo))，得色譜圖Fig 1A；空白血漿加入混合標(biāo)準(zhǔn)溶液和內(nèi)標(biāo)，按“2.3”項(xiàng)下操作，得到色譜圖Fig 1B。靜脈注射DOX 10 min的血漿樣品，按照“2.3”處理，得色譜圖Fig 1C。結(jié)果顯示，血漿內(nèi)源性物質(zhì)不干擾DOX、DOXol與托烷司瓊(IS)。

3.2線性DOX的標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=0.1923X-0.0029，R2=0.9999(0.10～256.01 mg·L-1)，DOXol的標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=0.1738X-0.0019，R2=0.9987(0.01～24.97 mg·L-1)。

3.3回收率與基質(zhì)效應(yīng)DOX與DOXol低、中、高3個(gè)濃度的質(zhì)控樣品的回收率范圍為84.19%～100.94%，基質(zhì)效應(yīng)范圍為91.62%～99.22%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，DOX與DOXol提取回收率良好，無明顯的基質(zhì)效應(yīng)(Tab 1)。

Tab 1 The mean recoveries and matrix effects of doxorubicin and doxorubicinol in rat plasma (±s, n=6)

3.4精密度與準(zhǔn)確度Tab 2結(jié)果表明，DOX與DOXol的準(zhǔn)確度范圍>80%，日內(nèi)和日間精密度RSD均小于10.0%，提示該方法準(zhǔn)確、可靠、重現(xiàn)性較好。

Tab 2 The accuracy, intra- and inter-day precision of doxorubicin and doxorubicinol in rat plasma (±s, n=6, 3 days)

3.5穩(wěn)定性各濃度下的QC樣品在自動(dòng)進(jìn)樣器中放置12 h，4℃冷藏24 h，反復(fù)凍融3次后，穩(wěn)定性結(jié)果見Tab 3。結(jié)果表明，DOX與DOXol在上述條件下在血漿中均能保持穩(wěn)定。

3.6DOX藥代動(dòng)力學(xué)測定出血藥濃度后，采用DAS 2.0藥代動(dòng)力學(xué)軟件計(jì)算藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)和房室模型。兩組大鼠血漿中DOX和DOXol的血藥濃度隨時(shí)間變化情況及C-t曲線見Tab 4、Fig 2，DOX主要藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)結(jié)果見Tab 5，結(jié)果表明兩組大鼠體內(nèi)DOX和DOXol無明顯差異。

4 討論

本研究前期考察了大鼠血漿樣品前處理方法，包括有機(jī)溶劑蛋白沉淀(甲醇、乙腈沉淀蛋白)、液液萃取(乙酸乙酯)、固相萃取等多種樣品處理方法，發(fā)現(xiàn)采用甲醇沉淀蛋白的方法，簡單、易行，且回收率能滿足生物樣品的分析要求，因此，選用甲醇沉淀蛋白的方法處理樣品。另外，考察了5%甲酸、10%甲酸、5% NaOH、10% NaOH溶液條件對(duì)DOX與DOXol提取回收率的影響。DOX和DOXol為多羥基化合物，樣品處理過程中加入一定量酸進(jìn)行酸化，可以提高UPLC-MS檢測靈敏度，而加入堿會(huì)使得DOX不穩(wěn)定(溶液變深紫色)，因此，采用含5%甲酸的甲醇溶液進(jìn)行蛋白沉淀處理，并及時(shí)渦旋、混勻，防止形成的蛋白沉淀包裹待測成分。由于生物樣品中待測成分濃度低，血漿基質(zhì)干擾大，因此，優(yōu)化樣品檢測的質(zhì)譜檢測條件就變得尤為重要[12]。參考相關(guān)文獻(xiàn)[13-14]方法，優(yōu)化各待測離子的錐孔電壓、離子源溫度、毛細(xì)管電壓等參數(shù)，最終確定了實(shí)驗(yàn)的質(zhì)譜條件，同時(shí)，檢測1個(gè)血漿樣品中的DOX和DOXol僅需3 min，最大程度縮減了樣品分析時(shí)間，真正實(shí)現(xiàn)高通量分析。

Fig 1 Typical chromatograms of plasma (A), plasma spiked with the mixed standard solution and IS(B), and rat plasma sample collected at 10min after intravenous administration of doxorubicin (C)1: Tropisetron; 2: Doxorubicinol; 3: Doxorubicin

GroupConcentration/mg·L-1Autosampler0hAutosampler12hFrozenstorage24hFreezingandthawing3timesDOX0.1020.12±0.010.13±0.020.13±0.010.11±0.0125.6025.45±0.7825.65±0.2425.92±0.3125.11±0.48256.01256.00±15.92256.68±15.53257.35±15.18250.62±6.08DOXol0.050.05±0.010.05±0.010.04±0.010.04±0.012.502.42±0.042.39±0.192.39±0.242.37±0.0824.9724.17±1.3623.16±1.0623.09±2.2922.96±1.28

Fig 2 DOX and DOXol concentrations in rat plasma after intravenous administration of 7 mg·kg-1 doxorubicin (n=6)

Tab 4 The plasma concentrations of DOX and DOXol (±s, n=6)

臨床上，阿霉素用于化療時(shí)，成人常用量為1次50～60 mg，每3～4周1次，相當(dāng)于大鼠7 mg·kg-1的給藥劑量。根據(jù)ADI藥品說明書，1次使用劑量為50～100 mL，加入0.9%氯化鈉注射液或5%～10%葡萄糖注射液中靜脈滴注，15 d為一周期，對(duì)晚期惡病質(zhì)病人，連用30 d為1個(gè)療程，或視病情而定，因此，本實(shí)驗(yàn)考察了ADI連續(xù)使用14 d后對(duì)DOX的藥代動(dòng)力學(xué)的影響。結(jié)果表明，DOX與ADI 聯(lián)合給藥后，DOX的藥代動(dòng)力學(xué)行為及其活性代謝產(chǎn)物DOXol無明顯改變，說明連續(xù)使用ADI對(duì)參與DOX代謝生成DOXol的藥物代謝酶無明顯影響。其中，羰基還原酶1(CBR1)是肝臟中參與DOX代謝生成DOXol的關(guān)鍵性酶[15]。從本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以推測，ADI對(duì)CBR1無明顯影響。后期，本課題組通過Western blot技術(shù)也證實(shí)了兩組大鼠肝臟中CBR1的蛋白表達(dá)無明顯差異(表達(dá)結(jié)果無差異，因而未放入文中)。

綜上所述，本研究建立了快速檢測血漿中DOX和DOXol的分析方法，通過考察ADI對(duì)DOX和DOXol藥代動(dòng)力學(xué)的影響，提示臨床上兩者聯(lián)合用藥，ADI可能不會(huì)引起DOX血藥濃度過高而導(dǎo)致藥物不良反應(yīng)。

(致謝：本實(shí)驗(yàn)由“貴州省藥物制劑重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室”和“民族藥與中藥開發(fā)應(yīng)用教育部工程研究中心”共同努力下完成。)

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