miR-7靶向沉默EGFR抑制大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞活化

錢 紅，胡 柯，劉理靜，謝 明，武 衡，李文軍，武 斌，聶 萌

(1. 湖南醫(yī)藥學(xué)院醫(yī)學(xué)院，湖南 懷化 418000；2. 南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，湖南 衡陽 421001；3. 懷化市第一人民醫(yī)院老年科，湖南 懷化 418000； 4. 懷化市第一人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，湖南 懷化 418000)

腦出血是危害人類健康的常見病、多發(fā)病，具有較高的致殘率和死亡率。星形膠質(zhì)細(xì)胞活化是腦出血后繼發(fā)性損傷的主要機(jī)制[1]。神經(jīng)膠質(zhì)原纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein, GFAP)為星形膠質(zhì)細(xì)胞的中間絲細(xì)胞骨架蛋白，是星形膠質(zhì)細(xì)胞活化的分子標(biāo)記物[2-3]。表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor, EGFR)是一種跨膜蛋白，本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用小干擾RNA(small interfering RNA , siRNA)或EGFR抑制劑染料木黃酮處理大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞，可降低磷酸化的信號傳導(dǎo)蛋白和轉(zhuǎn)錄激活物3(phosphorylated signal transducers and activators of transcription 3,p-STAT3)水平，進(jìn)而下調(diào)GFAP表達(dá)，表明EGFR在觸發(fā)星形膠質(zhì)細(xì)胞由靜息狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榛罨癄顟B(tài)中起關(guān)鍵作用[4-5]。微小RNA-7(microRNA-7, miR-7)是一種由23個核苷酸組成的miRNA，定位于第9號染色體，參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡和自噬等生物學(xué)過程，并與腦卒中相關(guān)[6]。EGFR已經(jīng)被鑒定為miR-7的靶基因[7-9]。新近研究表明，miR-7過表達(dá)有助于減少星形膠質(zhì)細(xì)胞炎癥介質(zhì)的分泌[10]。然而，miR-7對星形膠質(zhì)細(xì)胞活化的影響尚不清楚。為此，本研究以miR-7 mimic/inhibitor轉(zhuǎn)染大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞，分析miR-7對GFAP、EGFR、STAT3和p-STAT3表達(dá)的影響，旨在為腦損傷后神經(jīng)功能恢復(fù)提供一個新的藥效學(xué)靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1試劑新生胎牛血清、DMEM/F12培養(yǎng)基購自美國Gibco公司；重組的睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子(ciliary neurotrophic factor, CNTF)購自北京盛科博源生物公司；STAT3特異性抑制劑S31-201購自美國Selleck公司；LipofectamineTM2000、LipofectamineTMRNAiMAX、TRIzol試劑購于美國Invitrogen公司；熒光素酶報告載體pGL3、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green Real Time PCR Master Mix購自美國Promega公司；熒光素酶檢測試劑盒購于碧云天生物技術(shù)研究所；RIPA裂解液購自上海生工生物工程公司；兔抗大鼠GFAP、EGFR、STAT3、p-STAT3、β-actin抗體及山羊抗兔 IgG均為美國Santa Cruz公司產(chǎn)品。

1.2大鼠皮層星形膠質(zhì)細(xì)胞的分離與培養(yǎng)取10只出生后24 h內(nèi)的新生Wistar大鼠(SPF級，由南華大學(xué)醫(yī)學(xué)研究實(shí)驗(yàn)中心動物學(xué)部提供)，消毒后固定于木板上，在麻醉狀態(tài)下斷頭取大鼠頭部，取出大腦并剝離軟腦膜，分離出大腦皮層組織。用眼科剪把大腦皮層剪成碎片，再用1.25 g·L-1的胰酶消化30 min，然后加入新生胎牛血清，以終止消化過程，以1 000 r·min-1離心5 min后，小心吸棄上層液體，并將沉淀中加入DMEM培養(yǎng)液中，再用100目不銹鋼篩網(wǎng)進(jìn)行過濾，收集過濾液，往過濾液中加入適量的新生胎牛血清，從而將細(xì)胞懸液的密度調(diào)整為3×108～5×108·L-1，并將其種植于培養(yǎng)瓶中，然后把培養(yǎng)瓶置入37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，每隔3～4 d更換1次培養(yǎng)液，待細(xì)胞生長成致密單層后進(jìn)行傳代，取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)。

1.3miR-7mimic/inhibitor轉(zhuǎn)染效率檢測實(shí)驗(yàn)分為5組：對照組、miR-7 mimic組、miR-7 mimic control組、miR-7 inhibitor組、miR-7 inhibitor control組，對照組用培養(yǎng)液處理24 h，后4組按照操作說明用LipofectamineTM2000將40 nmol·L-1的miR-7 mimic、inhibitor或者它們的陰性對照物(negative controls)分別轉(zhuǎn)染星形膠質(zhì)細(xì)胞24 h，熒光實(shí)時定量PCR(quantitative real-time polymerase chain reaction, qRT-PCR)檢測各組細(xì)胞miR-7的表達(dá)水平。miR-7 mimic/inhibitor及相應(yīng)的陰性對照物由廣州銳博公司合成。

1.4熒光素酶報告基因分析采用PCR的方法從星形膠質(zhì)細(xì)胞基因組DNA中擴(kuò)增目的基因EGFR 3′-非翻譯區(qū)(3′-untranslated region, 3′-UTR)序列，插入熒光素酶報告載體pGL3(pGL3-EGFR)，同時構(gòu)建其突變載體(pGL3-EGFR-m)，將上述兩種質(zhì)粒分別與miR-7 mimic或mimic control共轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞(由中科院上海細(xì)胞生物所細(xì)胞中心提供)24 h，使用熒光素酶檢測試劑盒測定熒光素酶的活性。

1.5EGFRsiRNA干擾效果檢測實(shí)驗(yàn)分為3組：對照組、Scramble siRNA組和EGFR siRNA組，對照組用培養(yǎng)液處理24 h，后2組將LipofectamineTMRNAiMAX(4 μL)或 20 μmol·L-1的siRNA(5 μL)加入100 μL Opti-MEM中，靜置5 min后，將上述兩種溶液混合再靜置20 min，隨后把混合液加入星形膠質(zhì)細(xì)胞中，孵育48 h后用Western blot檢測EGFR蛋白表達(dá)水平。EGFR siRNA和scrambled siRNA由上海吉瑪公司合成。EGFR siRNA正義鏈序列為5′-CCUUAGCAGUCUUAUCUAATDT-3′，反義鏈序列為5′-dTdTGGAAUCGUCAGAAUAGAUU-3′；Scramble siRNA正義鏈序列為5′-UUCUCCGAACGUGUCACGU-3′，反義鏈序列為5′-ACGUGACACGUIJCGGAGAA-3′。

1.6實(shí)驗(yàn)分組與處理為了觀察miR-7對GFAP、EGFR、STAT3和p-STAT3表達(dá)的影響，取上述培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞隨機(jī)分為6組：對照組、CNTF(用于活化星形膠質(zhì)細(xì)胞)組、miR-7 mimic+CNTF組、miR-7 mimic control+CNTF組、miR-7 inhibitor+CNTF組和miR-7 inhibitor control+CNTF組，對照組、CNTF組分別予DMEM培養(yǎng)液、20 μg·L-1CNTF處理48 h，后4組按照操作說明用LipofectamineTM2000將40 nmol·L-1的miR-7 mimic、inhibitor或者它們的陰性對照物分別轉(zhuǎn)染細(xì)胞24 h，再用20 μg·L-1CNTF處理24 h。為了探討EGFR/STAT3信號通路在miR-7抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞活化中的作用，將星形膠質(zhì)細(xì)胞隨機(jī)分為5組：對照組、CNTF組、miR-7 inhibitor+CNTF組、EGFR siRNA+miR-7 inhibitor+CNTF組和S31-201+miR-7 inhibitor+CNTF組，前3組處理同上，后2組先用EGFR siRNA(20 μmol·L-1)或S31-201(10 μmol·L-1)處理細(xì)胞24 h，再給予40 nmol·L-1的miR-7 inhibitor和20 μg·L-1CNTF處理細(xì)胞24 h。待處理完畢后，進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)檢測。

1.7qRT-PCR檢測miR-7、GFAP和EGFR表達(dá)采用TRIzol試劑提取星形膠質(zhì)細(xì)胞中的總RNA，并逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。按照Tab 1所示序列由上海生工生物工程公司合成相應(yīng)的引物。在Roach480熒光實(shí)時定量PCR儀上進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性10 min，95℃變性30 s，55℃復(fù)性30 s，72℃延伸2 min，總共35個循環(huán)。用ΔΔCt值法，以U6水平作為內(nèi)參照定量miR-7表達(dá)，以GAPDH水平作為內(nèi)參照定量GFAP、EGFR mRNA表達(dá)。

1.8Westernblot檢測GFAP、EGFR、STAT3、p-STAT3表達(dá)用RIPA裂解液提取星形膠質(zhì)細(xì)胞蛋白質(zhì)，BCA法進(jìn)行蛋白定量，上樣、電泳并轉(zhuǎn)膜，分別加入兔抗大鼠GFAP(1 ∶500)、EGFR(1 ∶500)、STAT3(1 ∶500)、p-STAT3(1 ∶500)、β-actin(1 ∶2 500)一抗，4℃孵育過夜，洗滌后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG(1 ∶2 500)二抗，在37℃條件下孵育1 h，ECL 顯色，暗室曝光。利用Labwork凝膠圖像分析系統(tǒng)對所有膠片進(jìn)行掃描，用β-actin為內(nèi)參照定量目標(biāo)蛋白表達(dá)水平。

Tab 1 Primer sequences for qRT-PCR

1.9統(tǒng)計學(xué)處理所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次，結(jié)果取其平均值。用Graphpad Prism 5軟件制圖并進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，多組均數(shù)比較采用單因素方差分析及兩兩之間比較的q檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1miR-7mimic/inhibitor的轉(zhuǎn)染效率為了評價miR-7的轉(zhuǎn)染效率，分別以miR-7 mimic/inhibitor及它們的陰性對照轉(zhuǎn)染星形膠質(zhì)細(xì)胞24 h。Fig 1的qRT-PCR結(jié)果顯示，miR-7 mimic轉(zhuǎn)染明顯增加miR-7水平，幾乎是對照組的14倍(P<0.01)，miR-7 inhibitor轉(zhuǎn)染則明顯降低miR-7水平，約為對照組的1/4(P<0.01)，而它們的陰性對照對miR-7 表達(dá)無影響(P>0.05)，提示miR-7 mimic/inhibitor轉(zhuǎn)染星形膠質(zhì)細(xì)胞具有較高的效率。

Fig 1 Effects of miR-7 mimic/inhibitor transfection on miR-7 expression in astrocytes

1: Control group; 2: miR-7 mimic control group; 3: miR-7 mimic group; 4: miR-7 inhibitor control group; 5: miR-7 inhibitor group.**P<0.01vscontrol group

2.2miR-7抑制CNTF誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞GFAP表達(dá)GFAP是星形膠質(zhì)細(xì)胞活化的分子標(biāo)記物，為了觀察miR-7對星形膠質(zhì)細(xì)胞活化的影響，用CNTF和(或)miR-7 mimic/inhibitor處理細(xì)胞后，qRT-PCR、Western blot分別檢測各組細(xì)胞GFAP mRNA、蛋白的表達(dá)情況。如Fig 2、3所示，對照組GFAP mRNA與蛋白呈低水平表達(dá)，CNTF組GFAP mRNA與蛋白表達(dá)水平較對照組明顯增加(P<0.01)，說明此時星形膠質(zhì)細(xì)胞處于活化狀態(tài)，與CNTF組比較，miR-7 mimic預(yù)處理降低GFAP mRNA與蛋白表達(dá)水平(P<0.01)，miR-7 inhibitor預(yù)處理增加GFAP mRNA與蛋白表達(dá)水平(P<0.01)，而它們的陰性對照無此作用(P>0.05)。結(jié)果表明miR-7可抑制CNTF誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞活化。

Fig 2 Expression of GFAP mRNA in astrocytes among groups

1: Control group; 2: CNTF group; 3: miR-7 mimic+CNTF group; 4: miR-7 mimic control+CNTF group; 5: miR-7 inhibitor+CNTF group; 6: miR-7 inhibitor control+CNTF group.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsCNTF group

Fig 3 Expression of GFAP protein in astrocytes among groups

1: Control group; 2: CNTF group; 3: miR-7 mimic+CNTF group; 4: miR-7 mimic control+CNTF group; 5: miR-7 inhibitor+CNTF group; 6: miR-7 inhibitor control+CNTF group.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsCNTF group

2.3miR-7降低星形膠質(zhì)細(xì)胞EGFR、p-STAT3水平Fig 4熒光素酶報告基因顯示，miR-7 mimic能明顯降低野生型EGFR熒光素酶活性(P<0.01)，但對突變型無影響，進(jìn)一步證實(shí)EGFR為miR-7的靶基因。本課題組前期研究表明，EGFR通過磷酸化STAT3上調(diào)GFAP表達(dá)，因此，我們接下來探討miR-7對星形膠質(zhì)細(xì)胞EGFR、STAT3、p-STAT3表達(dá)的影響。由Fig 5、6可知，CNTF組EGFR表達(dá)水平和p-STAT3/STAT3比值較對照組明顯增加(P<0.01)，與CNTF組比較，miR-7 mimic+CNTF組EGFR表達(dá)水平和p-STAT3/STAT3比值降低(P<0.01)，miR-7 inhibitor+CNTF組EGFR表達(dá)水平和p-STAT3/STAT3比值升高(P<0.01)，而它們的陰性對照對上述指標(biāo)無影響(P>0.05)。

Fig 4 Comparison of luciferase activity among groups**P<0.01 vs control groupFig 5 Expression of EGFR mRNA in astrocytes among groups 1: Control group; 2: CNTF group; 3: miR-7 mimic+CNTF group; 4: miR-7 mimic control+CNTF group; 5: miR-7 inhibitor+CNTF group; 6: miR-7 inhibitor control+CNTF group. **P<0.01 vs control group; ##P<0.01 vs CNTF group

Fig 6 EGFR protein expression and p-STAT3/STAT3 ratio in astrocytes among groups

1: Control group; 2: CNTF group; 3: miR-7 mimic+CNTF group; 4: miR-7 mimic control+CNTF group; 5: miR-7 inhibitor+CNTF group; 6: miR-7 inhibitor control+CNTF group.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsCNTF group

2.4EGFRsiRNA的干擾效果Fig 7 Western blot結(jié)果表明，與對照組比較，EGFR siRNA抑制了約80%的星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)源性EGFR蛋白表達(dá)，差異有顯著性(P<0.01)，但Scrambled siRNA組EGFR蛋白表達(dá)水平與對照組相比無明顯差異(P>0.05)，提示EGFR siRNA能有效干擾EGFR基因表達(dá)。

Fig 7 Expression of EGFR protein in astrocytes among groups

1: Control group; 2: Scramble siRNA group; 3: EGFR siRNA group.**P<0.01vscontrol group

2.5EGFR/STAT3信號通路參與miR-7抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞活化為了明確EGFR/STAT3信號通路在miR-7抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞活化中的作用，以EGFR siRNA或STAT3 抑制劑S31-201預(yù)處理星形膠質(zhì)細(xì)胞，再予miR-7 inhibitor和 CNTF孵育，qRT-PCR、Western blot檢測GFAP mRNA與蛋白表達(dá)。Fig 8、9結(jié)果顯示，miR-7 inhibitor+CNTF組GFAP mRNA與蛋白表達(dá)水平較CNTF組增加(P<0.01)，EGFR siRNA或S31-201預(yù)處理后加miR-7 inhibitor和 CNTF，GFAP mRNA與蛋白表達(dá)水平明顯降低，與miR-7 inhibitor+CNTF組比較，差異均有顯著性(P<0.01)，提示miR-7通過EGFR/STAT3途徑抑制CNTF誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞活化。

Fig 8 Expression of GFAP mRNA in astrocytes among groups

1: Control group; 2: CNTF group; 3: miR-7 inhibitor+CNTF group; 4: EGFR siRNA+miR-7 inhibitor+CNTF group; 5: S31-201+miR-7 inhibitor+CNTF group.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsCNTF group;▲▲P<0.01vsmiR-7 inhibitor+CNTF group

Fig 9 Expression of GFAP protein in astrocytes among groups

1: Control group; 2: CNTF group; 3: miR-7 inhibitor+CNTF group; 4: EGFR siRNA+miR-7 inhibitor+CNTF group; 5: S31-201+miR-7 inhibitor+CNTF group.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsCNTF group;▲▲P<0.01vsmiR-7 inhibitor+CNTF group

3 討論

星形膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中含量最為豐富的細(xì)胞，與神經(jīng)元之間存在復(fù)雜的相互作用，有助于維持神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。在腦出血等病理情況下，星形膠質(zhì)細(xì)胞從靜息狀態(tài)快速轉(zhuǎn)變?yōu)榛罨癄顟B(tài)，活化的星形膠質(zhì)細(xì)胞一方面能夠分泌多種細(xì)胞因子、炎癥因子和補(bǔ)體蛋白等，導(dǎo)致繼發(fā)性的神經(jīng)損傷，另一方面促進(jìn)瘢痕形成，阻礙神經(jīng)再生[11]。因此，抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞活化已成為防治腦出血后繼發(fā)性損傷的重要策略。miRNAs是一類長度為19～25個核苷酸的內(nèi)源性非編碼RNA，通過與靶mRNA的3′-非翻譯區(qū)結(jié)合，導(dǎo)致其翻譯過程受到抑制或引起mRNA的降解，在轉(zhuǎn)錄后水平特異性影響靶基因表達(dá)[12-13]。近年研究發(fā)現(xiàn)，miRNAs失調(diào)與腦出血的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，可作為腦出血早期診斷及預(yù)后評估的重要分子標(biāo)記物[14]。本研究以miR-7 mimic、inhibitor和(或)CNTF處理大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)miR-7 mimic+CNTF組GFAP mRNA與蛋白表達(dá)水平較CNTF組降低，而miR-7 inhibitor+CNTF組GFAP mRNA與蛋白表達(dá)水平較CNTF組升高，這些結(jié)果表明miR-7可抑制CNTF誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞活化。

EGFR是一種由53個氨基酸組成的活性多肽，廣泛表達(dá)于上皮、間質(zhì)及神經(jīng)組織，與其配體結(jié)合后，可磷酸化STAT3，進(jìn)而促進(jìn)包括GFAP在內(nèi)的多個基因轉(zhuǎn)錄[15]。研究發(fā)現(xiàn)，腦出血后血腫周圍腦組織EGFR表達(dá)迅速上調(diào)，且主要定位于活化的星形膠質(zhì)細(xì)胞，并持續(xù)較長時間[16]。我們前期研究表明，EGFR siRNA通過抑制STAT3磷酸化拮抗CNTF誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞活化[4]。miRNAs本身不具備生物學(xué)功能，通過沉默其靶基因才能發(fā)揮作用。熒光素酶報告基因發(fā)現(xiàn)，miR-7 mimic明顯減少野生型EGFR熒光素酶活性，但對突變型無影響，表明EGFR為miR-7的靶基因，與文獻(xiàn)報道一致[7-9]。此外，相對于CNTF組，miR-7 mimic+CNTF組EGFR表達(dá)水平和p-STAT3/STAT3比值降低，而miR-7 inhibitor+CNTF組EGFR表達(dá)水平和p-STAT3/STAT3比值增加，提示miR-7通過靶向沉默EGFR抑制STAT3磷酸化。為了明確EGFR/ STAT3信號通路在miR-7抑制CNTF誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞活化中的作用，本研究以EGFR siRNA或STAT3的抑制劑S31-201預(yù)處理星形膠質(zhì)細(xì)胞，再用miR-7 inhibitor和 CNTF孵育，發(fā)現(xiàn)干擾EGFR/STAT3信號通路幾乎完全逆轉(zhuǎn)了miR-7 inhibitor對GFAP表達(dá)的促進(jìn)作用，表明抑制EGFR/STAT3信號通路可能是miR-7阻滯星形膠質(zhì)細(xì)胞活化的主要機(jī)制。

綜上所述，本研究結(jié)果表明，miR-7通過靶向沉默EGFR，使p-STAT3水平減少，從而抑制CNTF誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞活化。然而，miR-7在體內(nèi)是否有這種保護(hù)作用尚需進(jìn)一步研究。此外，一個miRNA有多個靶基因，多個miRNAs可以作用于同一個靶基因，因此，miR-7也可能通過其它靶基因影響星形膠質(zhì)細(xì)胞活化。隨著對這些問題的深入探討，將進(jìn)一步揭示miR-7在腦出血后繼發(fā)性損傷中的作用。

(致謝： 本實(shí)驗(yàn)在侗醫(yī)藥研究湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室和南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)研究所完成，感謝各位老師的指導(dǎo)和幫助。)

[1] Finsterwald C, Magistretti P J, Lengacher S. Astrocytes: new targets for the treatment of neurodegenerative diseases[J].CurrPharmDes, 2015,21(25):3570-81.

[2] Stanca D M, M?rginean I C, Sori?u O, et al. GFAP and antibodies against NMDA receptor subunit NR2 as biomarkers for acute cerebrovascular diseases[J].JCellMolMed, 201519(9):2253-61.

[3] Foerch C, Pfeilschifter W, Zeiner P, et al. Glial fibrillary acidic protein in patients with symptoms of acute stroke: diagnostic marker of cerebral hemorrhage[J].Nervenarzt, 2014,85(8):982-9.

[4] 錢 紅, 劉理靜, 李艷春, 等. EGFR siRNA通過阻礙STAT3磷酸化抑制大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞活化[J]. 中國藥理學(xué)通報,2016,32(2):216-22.

[4] Qian H, Liu L J, Li Y C, et al. EGFR siRNA inhibits activation of astrocytes derived from rats through blockade of STAT3 phosphorylation[J].ChinPharmacolBull, 2016,32(2):216-22.

[5] 郭志慧, 武 衡. 星形膠質(zhì)細(xì)胞活化與表皮生長因子受體表達(dá)的相關(guān)性研究[J]. 中風(fēng)與神經(jīng)疾病雜志,2010,27(8):683-5.

[5] Guo Z H, Wu H. The relationship of the activity of astrocytes and the expression of EGFR[J].JApoNervDis, 2010,27(8):683-5.

[6] Horsham J L, Ganda C, Kalinowski F C, et al. MicroRNA-7: A miRNA with expanding roles in development and disease[J].IntJBiochemCellBiol, 2015,69:215-24.

[7] Cui Y X, Bradbury R, Flamini V, et al. MicroRNA-7 suppresses the homing and migration potential of human endothelial cells to highly metastatic human breast cancer cells[J].BrJCancer, 2017,117(1):89-101.

[8] Sun X, Li J, Sun Y, et al. miR-7 reverses the resistance to BRAFi in melanoma by targeting EGFR/IGF-1R/CRAF and inhibiting the MAPK and PI3K/AKT signaling pathways[J].Oncotarget, 2016,7(33):53558-70.

[9] 劉曉智, 姜忠敏, 陳 鐳, 等. miR-7沉默EGFR/PI3K通路逆轉(zhuǎn)腦膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞的惡性表型[J]. 腫瘤, 2011,31(11):987-92.

[9] Liu X Z, Jiang Z M, Chen L, et al. MicroRNA-7 silencing EGFR/PI3K pathway reverses the malignant phenotype of U251 glioma cells[J].Tumor, 2011,31(11):987-92.

[10] Dong Y F, Chen Z Z, Zhao Z, et al. Potential role of microRNA-7 in the anti-neuroinflammation effects of nicorandil in astrocytes induced by oxygen-glucose deprivation[J].JNeuroinflammation, 2016,13(1):60.

[11] Grafstein B. Subverting the hegemony of the synapse: complicity of neurons, astrocytes, and vasculature in spreading depression and pathology of the cerebral cortex[J].BrainResRev, 2011,66(1-2):123-32.

[12] Yu X, Zheng H, Chan M T, et al. MicroRNAs: new players in cataract[J].AmJTranslRes, 2017,9(9):3896-903.

[13] Chatterjee N, Rana S, Espinosa-Diez C, et al. MicroRNAs in cancer: challenges and opportunities in early detection, disease monitoring, and therapeutic agents[J].CurrPathobiolRep, 2017,5(1):35-42.

[14] Tan J R, Koo Y X, Kaur P, et al. microRNAs in stroke pathogenesis[J].CurrMolMed, 2011,11(2):76-92.

[15] Wendt M K, Balanis N, Carlin C R, et al. STAT3 and epithelial-mesenchymal transitions in carcinomas[J].JAKSTAT, 2014,3(1):e28975.

[16] Liu B, Neufeld A H. Activation of epidermal growth factor receptors in astrocytes: from development to neural injury[J].JNeurosciRes, 2007,85(16):3523-9.