毛冬青甲素對(duì)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖及遷移的影響

李慶雙，鄭關(guān)毅，張碧琴，陳曉東，江 瓊，劉真臻，5

(1. 福建醫(yī)科大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院中醫(yī)科，福建 福州 350001；2. 中國(guó)人民解放軍第一七四醫(yī)院老年科，福建 廈門 361000；3. 福州市第一醫(yī)院老年科，福建 福州 350009；4. 福建醫(yī)科大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院燒傷研究所，福建 福州 350001；5.山東省臨沂市人民醫(yī)院老年科，山東 臨沂 276000)

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone mesenchymal stem cells,BMSCs)來(lái)源方便，能在體外培養(yǎng)、增殖，可分化為多種細(xì)胞，且可分泌多種營(yíng)養(yǎng)因子和調(diào)節(jié)免疫等功能，故可成為臨床疾病的輔助治療手段。目前尚未發(fā)現(xiàn)BMSCs完全特異性細(xì)胞表面分子，實(shí)驗(yàn)中所應(yīng)用的表面分子，只能相對(duì)接近，除外造血前體細(xì)胞特異的CD34，白細(xì)胞特異的CD45，以及檢測(cè)出BMSCs CD29、CD90、CD44、CD105，即可認(rèn)為所檢測(cè)出的細(xì)胞為BMSCs。

間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells,MSCs)定向遷移到受損的組織是其發(fā)揮組織修復(fù)的重要前提。MSCs的遷移過(guò)程包含多個(gè)環(huán)節(jié)，其中趨化因子及其相應(yīng)受體起重要作用。趨化因子不僅有調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化、免疫功能的能力，還有促遷移作用。趨化因子受體CXCR4(chemokine C-X-C motif receptor 4)屬于7次跨膜的G蛋白偶聯(lián)受體[1]?；|(zhì)細(xì)胞衍生因子-1(stromal-derived factor-1,SDF-1)為多見(jiàn)的存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的一種趨化因子。組織損傷或炎癥時(shí)，組織內(nèi)SDF-1表達(dá)逐漸增加，與血液循環(huán)中MSCs表達(dá)的CXCR4相互作用，促進(jìn)MSCs 的遷移[2]。Wang等[3]在恒久性大腦中動(dòng)脈阻塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)模型中，注射綠色熒光蛋白(green fluorescent protein,GFP)標(biāo)記的BMSCs，免疫組化發(fā)現(xiàn)嗅區(qū)到大腦皮層途徑中都分布著B(niǎo)MSCs，大鼠神經(jīng)功能也有改善，而B(niǎo)MSCs的遷移可被CXCR4抑制劑AMD3100抑制。

毛冬甲青素(ilexonin A,IA)是從中藥毛冬青中加工分離提取的化合物，具有活血化瘀、抗血栓、抗炎癥等廣泛的藥理作用。我們的前期研究表明，大鼠腦缺血/再灌注后，內(nèi)源性堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)和生長(zhǎng)相關(guān)蛋白-43(growth associated protein-43,GAP-43)表達(dá)增高，皮層亦出現(xiàn)BrdU/NeuN的雙標(biāo)陽(yáng)性細(xì)胞[4]，而IA干預(yù)后bFGF和GAP-43明顯增高，相應(yīng)皮層BrdU/NeuN的雙標(biāo)陽(yáng)性細(xì)胞增加[5]。IA促進(jìn)缺血側(cè)皮層BrdU/NeuN標(biāo)記陽(yáng)性細(xì)胞生成是否與促進(jìn)腦缺血后側(cè)腦室下層區(qū)域神經(jīng)干細(xì)胞的再生和分化，并向皮層運(yùn)動(dòng)遷移有關(guān)。本課題擬研究IA對(duì)BMSCs增殖及遷移的影響，對(duì)BMSCs應(yīng)用于腦梗死的治療具有非常重要的意義。由于CXCR4在BMSCs的表達(dá)率低，故設(shè)想通過(guò)IA體外干預(yù)BMSCs，并推測(cè)其通過(guò)提高CXCR4的表達(dá)可有利于BMSCs遷移至腦缺血區(qū)組織。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SD大鼠8只，♂，體質(zhì)量60～100 g，清潔級(jí)，上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，許可證批號(hào)：SCXK(滬):2012-0002。

1.1.2藥物與試劑 注射用毛冬青甲素購(gòu)自廣東省博羅先鋒藥業(yè) (40 g/2 L)，產(chǎn)品批準(zhǔn)文號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字Z44023366，批號(hào)：090101。MTT、AMD3100購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；胎牛血清、青霉素-鏈霉素溶液、DMEM/F12、PBS、0.25%胰蛋白酶(0.03% EDTA)，購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；小鼠抗大鼠CD90-PE單克隆抗體、小鼠抗大鼠CD45-PE單克隆抗體、小鼠抗大鼠CD29-PE單克隆抗體，購(gòu)自美國(guó)Biolegend公司；小鼠抗大鼠CD34-PE單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司；進(jìn)口羊血清工作液、DAPI、FITC標(biāo)記山羊抗兔二抗，購(gòu)自北京中杉金橋公司；兔抗大鼠CXCR4抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司。

1.1.3儀器 CO2恒溫培養(yǎng)箱購(gòu)自日本三洋公司；熒光倒置顯微鏡購(gòu)自日本Olympus公司；超凈工作臺(tái)購(gòu)自中國(guó)蘇凈集團(tuán)；流式細(xì)胞儀購(gòu)自英國(guó)Apogee公司；全自動(dòng)凝膠圖像分析儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司；低溫離心機(jī)購(gòu)自德國(guó)HERMLE公司；全自動(dòng)酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)Thermo Scientific公司。

1.2方法

1.2.1大鼠BMSCs的培養(yǎng) 頸椎脫臼處死大鼠后，保留股骨及脛骨,去除股骨和脛骨的骨骺端，露出骨髓腔，用10%胎牛血清DMEM/F12培養(yǎng)基(添加青、鏈霉素1 ∶100稀釋)沖洗骨髓，使流出骨髓腔。將骨髓制成單細(xì)胞懸液，接種于25 cm2培養(yǎng)瓶中，保持細(xì)胞密度為1×109·L-1，置37℃、CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)48 h，更換培養(yǎng)基，以后每2～3 d更換1次。待細(xì)胞密度長(zhǎng)至80%～90%融合，加入0.25%胰酶消化，以1 ∶2 的比例培養(yǎng)傳代。

1.2.2大鼠BMSCs的鑒定 取第3代細(xì)胞生長(zhǎng)匯合至80%以上，制備單細(xì)胞懸液，1 000 r·min-1離心5 min，棄上清液，加入PBS重懸細(xì)胞沉淀，1 000 r·min-1離心5 min，棄上清，加入500 μL PBS緩沖液，將單細(xì)胞懸液分裝至每管約5×105個(gè)細(xì)胞的5支樣品管中。分別加入5 μL PBS(陰性對(duì)照)、5μL PE標(biāo)記抗大鼠CD29、5 μL PE標(biāo)記抗大鼠CD90、5 μL PE標(biāo)記抗大鼠 CD34、5 μL PE標(biāo)記抗大鼠CD45抗體，吹打均勻，4℃冰箱內(nèi)避光孵育30 min；加入3 mL PBS 1 000 r·min-1離心5min，棄上清，每管加入500 μL PBS緩沖液重懸細(xì)胞沉淀，待測(cè)。

1.2.3大鼠BMSCs生長(zhǎng)曲線的測(cè)定 將大鼠BMSCs傳至2代后，接種于7塊96孔培養(yǎng)板，每塊接種6孔，接種密度4×103/孔，培養(yǎng)板置CO2培養(yǎng)箱37℃、5% CO2及飽和濕度條件下培養(yǎng)。每日1板進(jìn)行MTT檢測(cè)。每孔加入MTT 溶液(5 g·L-1)20 μL，37℃孵箱中孵育4 h后，小心吸棄上清液。每孔加入150 μL DMSO，振蕩10 min。在酶標(biāo)儀上492 nm波長(zhǎng)測(cè)定各孔吸光度值，以A492 nm吸光度值表示細(xì)胞增殖水平。以吸光度值為縱軸、時(shí)間為橫軸，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

1.2.4IA預(yù)處理BMSCs最佳劑量及時(shí)間篩選 第3代BMSCs生長(zhǎng)匯合至80%～90%時(shí)消化，制成單細(xì)胞懸液，細(xì)胞濃度調(diào)整為5×107·L-1，接種至96孔板，每孔200 μL細(xì)胞懸液；1 d后細(xì)胞完全貼壁，棄培養(yǎng)基，加入含IA (3.125、6.25、12.5、25、50、100、200、400、800 mg·L-1)的10% FBS培養(yǎng)基或10% FBS DMEM/F12培養(yǎng)基(對(duì)照組)，分別孵育24、48、72 h，MTT法檢測(cè)樣品A492吸光度值，期間每隔24 h換新鮮含藥培養(yǎng)基。每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔。

1.2.5Transwell檢測(cè)細(xì)胞遷移 將第2代BMSCs生長(zhǎng)匯合至80%～90%時(shí)消化，制備單細(xì)胞懸液，按1×108·L-1接種至6孔板內(nèi)，24 h后更換為含IA(3.125、6.25 mg·L-1)的10% FBS培養(yǎng)基，孵育48 h，PBS洗2遍，胰酶消化，制成細(xì)胞濃度為5×108·L-1含2% FBS DMEM/F12培養(yǎng)基的懸液，取200 μL置于Transwell小室中，每組設(shè)4個(gè)復(fù)孔。阻斷實(shí)驗(yàn)中，消化接種的細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，更換為含IA(6.25 mg·L-1)的10% FBS DMEM/F12培養(yǎng)基，孵育48 h，PBS洗2遍，再加入CXCR4阻斷劑AMD3100(5 mg·L-1)，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱30 min后，PBS洗2遍，胰酶消化，制成上述相同細(xì)胞濃度的懸液，置于Transwell小室中。Transwell下室為500 μL含2% FBS DMEM/F12、0.1 mg·L-1SDF-1α的培養(yǎng)基，孵箱中靜置6 h，PBS洗滌后，4%多聚甲醛室溫固定15min，蒸餾水洗滌，0.1%結(jié)晶紫染色小室外側(cè)面細(xì)胞15 min，蒸餾水洗滌，晾干，于倒置相差顯微鏡下拍照。將Transwell小室聚碳酸酯穿透膜浸入200 μL結(jié)晶紫脫色液中脫色，酶標(biāo)儀492 nm波長(zhǎng)測(cè)定各孔吸光度值，以A492吸光度值表示細(xì)胞穿透數(shù)量。

1.2.6CXCR4免疫熒光染色 將BMSCs接種到放入蓋玻片的12孔培養(yǎng)板內(nèi)，待細(xì)胞達(dá)到60%～70%融合，PBS沖洗。取載玻片，PBS沖洗5 min×3次，4%多聚甲醛固定20 min，PBS沖洗5 min×3次，山羊血清37℃封閉30 min，滴加兔抗大鼠CXCR4多克隆抗體(1 ∶200)， 4℃孵育過(guò)夜。PBS (含0.1% Triton X-100)室溫下沖洗5 min×3次，滴加FITC標(biāo)記的山羊抗兔二抗(1 ∶200)室溫避光孵育2 h，PBS沖洗5 min×3次，滴加適量的DAPI避光復(fù)染5 min，PBS沖洗5 min×3次。加抗熒光淬滅劑晾干、封片、熒光顯微鏡觀察。PBS代替一抗作陰性對(duì)照，染色后胞質(zhì)、胞核呈綠色的為CXCR4陽(yáng)性細(xì)胞，胞核呈藍(lán)色的為DAPI標(biāo)記的細(xì)胞核。

1.2.7Western blot檢測(cè) 用蛋白裂解液提取蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度。配制10%的分離膠進(jìn)行SDS-PAGE電泳，將蛋白轉(zhuǎn)印至NC膜上；5%脫脂奶粉封閉液封閉1 h；加入以TBST稀釋的兔抗大鼠CXCR4多克隆抗體、小鼠β-actin單克隆抗體(1 ∶2 000)過(guò)夜；TBST洗膜10 min×5次；加入TBST稀釋的相應(yīng)二抗(1 ∶6000)，室溫孵育2 h；TBST洗膜10 min×5次，化學(xué)發(fā)光法顯影，X線片曝光，用Image Master?VDS凝膠成像及分析系統(tǒng)采集膠片上的蛋白條帶圖像，與相應(yīng)β-actin蛋白條帶密度相比較，計(jì)算各條帶的灰度值。

2 結(jié)果

2.1BMSCs的體外培養(yǎng)原代培養(yǎng)時(shí)，把渾濁骨髓液接種入塑料培養(yǎng)瓶并輕微搖勻，鏡下觀察，絕大多數(shù)為圓形細(xì)胞并懸浮于培養(yǎng)液，只有少量細(xì)胞附壁。48 h換液后，可見(jiàn)部分細(xì)胞呈集落樣貼壁，多呈梭形或多角形。3～4 d時(shí)細(xì)胞形態(tài)逐漸變細(xì)、變長(zhǎng)，相互靠近，7～8 d細(xì)胞即相互接觸，9～10 d細(xì)胞排列緊密，融合80%～90%時(shí)呈漩渦狀(Fig 1)。

Fig 1 Culture of BMSCs in vitro(×200, scale bar: 50 μm)

A: The first generation of BMSCs gave priority to spindle cells, with more mixed cells of round shape; B: The third generation of BMSCs, the mixed cells were less visible than the first generation cells.

2.2BMSCs的鑒定第3代BMSCs，CD29陽(yáng)性細(xì)胞率為100.0%(Fig 2A)，CD90 陽(yáng)性細(xì)胞率為99.5%(Fig 2B)，CD45陽(yáng)性細(xì)胞率為1.0%(Fig 2C)，CD34陽(yáng)性細(xì)胞率為0.8%(Fig 2D)。

2.3BMSCs的生長(zhǎng)曲線BMSCs在接種d 1～2，為細(xì)胞適應(yīng)新環(huán)境時(shí)期，細(xì)胞增殖不明顯。3～6 d鏡下可見(jiàn)細(xì)胞數(shù)量逐漸增多，符合生長(zhǎng)曲線的上斜趨勢(shì)，為細(xì)胞快速增長(zhǎng)期。7 d后鏡下未見(jiàn)細(xì)胞間間隙，無(wú)多余細(xì)胞貼壁空間，增殖明顯減慢(Fig 3)。

2.4IA預(yù)處理BMSCs最佳劑量及時(shí)間的篩選結(jié)果Tab 1結(jié)果顯示，IA孵育BMSCs 24、48 h，與對(duì)照組相比，100～800 mg·L-1劑量組OD值明顯降低(P<0.05)；IA孵育BMSCs 48 h，與對(duì)照組相比，IA 3.125、6.25 mg·L-1組OD值明顯增加(P<0.05)；IA孵育BMSCs 72 h，與對(duì)照組相比，12.5～800 mg·L-1組OD值明顯降低(P<0.05)，IA 3.125、6.25 mg·L-1組OD值無(wú)明顯變化。

Fig 2 The surface markers of BMSCs through flow cytometry

A: CD29, the positive rate was 100.0%; B: CD90, the positive rate was 99.5%; C: CD45, the positive rate was 1.0%; D: CD34, the positive rate was 0.8%.

Fig 3 Cell growth curve of BMSCs

GroupConcentration/mg·L-1A492nm24h48h72hControl-0.427±0.0220.458±0.0330.528±0.029IA8000.313±0.019*0.306±0.045*0.277±0.027*4000.323±0.028*0.320±0.032*0.280±0.028*2000.341±0.019*0.338±0.032*0.315±0.034*1000.399±0.022*0.395±0.030*0.390±0.033*500.429±0.0240.435±0.0240.440±0.024*250.434±0.0230.467±0.0240.473±0.025*12.50.448±0.0260.478±0.0230.486±0.025*6.250.441±0.0190.511±0.026*0.537±0.0333.1250.444±0.0220.520±0.048*0.533±0.042

*P<0.05vscontrol

2.5IA促進(jìn)BMSCs的遷移結(jié)晶紫染色遷移細(xì)胞，如Fig 4所示，與對(duì)照組相比，6.25、3.125 mg·L-1IA明顯促進(jìn)BMSCs的遷移，A492吸光度值明顯增加(P<0.05)。與IA 3.125 mg·L-1組相比，IA 6.25 mg·L-1組遷移細(xì)胞數(shù)增加，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

Fig 4 Effect of IA on BMSCs migration(×200, scale bar: 50 μm)

A: Control; B: IA 3.125 mg·L-1; C: IA 6.25 mg·L-1; D: The average optical density of crystal violet staining of BMSCs.*P<0.05vscontrol.

2.6CXCR4阻斷劑AMD3100對(duì)BMSCs遷移的影響Fig 5的Transwell結(jié)果表明，AMD3100干預(yù)組細(xì)胞遷移數(shù)量與IA (6.25 mg·L-1)組相比明顯減少(P<0.05)。

2.7BMSCs中CXCR4的免疫熒光染色如Fig 6所示，DAPI使細(xì)胞核藍(lán)染，細(xì)胞膜及細(xì)胞內(nèi)均可見(jiàn)綠色熒光，提示BMSCs的細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞膜均有CXCR4表達(dá)。

2.8IA對(duì)BMSCs中CXCR4表達(dá)的影響如Fig 7所示，與對(duì)照組比較，IA(6.25、3.125 mg·L-1)預(yù)處理BMSCs 48 h明顯上調(diào)CXCR4蛋白的表達(dá)(P<0.05)，且與IA 3.125 mg·L-1組比較，IA 6.25 mg·L-1組CXCR4蛋白表達(dá)明顯升高(P<0.05)。

3 討論

間充質(zhì)干細(xì)胞于骨髓組織中的干骺端含量豐富，且提取相對(duì)比較方便。本實(shí)驗(yàn)充分應(yīng)用了BMSCs對(duì)塑料培養(yǎng)瓶的良好黏附特征，采用換液和及時(shí)傳代等方式，可以很好去除大部分雜細(xì)胞。傳至第3代時(shí)，可得純度較高的BMSCs，其形態(tài)為較為均一梭形，生長(zhǎng)狀態(tài)好。傳代后的BMSCs 4～5 d便可長(zhǎng)滿，增殖能力強(qiáng)，其生長(zhǎng)曲線呈S形，符合多數(shù)細(xì)胞的生長(zhǎng)特性。流式細(xì)胞儀可檢測(cè)到CD29和CD90表達(dá)陽(yáng)性，CD34和CD45表達(dá)陰性，表明是純度相當(dāng)高的BMSCs，有異于造血細(xì)胞。

Fig 5 Effect of AMD3100 on migration of BMSCs incubated with IA(×200, scale bar: 50 μm)

A: Control; B: IA(6.25 mg·L-1)+AMD3100; C: IA 6.25 mg·L-1; D: The average optical density of crystal violet staining of BMSCs.*P<0.05vsIA+AMD3100;#P<0.05vscontrol.

Fig6ThefluorescencemicroscopyofCXCR4(×200, scale bar: 50 μm)

A：CXCR4；B：DAPI；C：Merged

無(wú)論是人來(lái)源的或非人來(lái)源的MSCs用于移植治療中風(fēng)后的鼠科動(dòng)物，均取得較好的效果，其機(jī)制為MSCs遷移定位于大腦中，分化為神經(jīng)細(xì)胞和膠質(zhì)細(xì)胞。這其中有轉(zhuǎn)分化、神經(jīng)細(xì)胞形成、血管形成和激活內(nèi)源神經(jīng)干細(xì)胞修復(fù)[6]。SDF-1/CXCR4軸在趨化循環(huán)干細(xì)胞定位于受損部位，進(jìn)而促進(jìn)干細(xì)胞存活及往組織損傷細(xì)胞相應(yīng)分化、誘導(dǎo)損傷區(qū)微血管生成中發(fā)揮重要作用[7]。Roland等[8]發(fā)現(xiàn)，SDF-1α結(jié)合受體CXCR4產(chǎn)生趨化的機(jī)制是通過(guò)激活受體下游的效應(yīng)元件，導(dǎo)致相關(guān)核轉(zhuǎn)錄因子和激酶磷酸化，引起肌動(dòng)蛋白、肌球蛋白等細(xì)胞骨架蛋白的含量、成分或分布發(fā)生改變，引起細(xì)胞變形，繼而遷移。正常情況下，機(jī)體大多數(shù)組織表達(dá)低水平SDF-1α，當(dāng)腦卒中1個(gè)月后，可發(fā)現(xiàn)缺血邊緣區(qū)SDF-1α表達(dá)上調(diào)，并持續(xù)到第4個(gè)月，原位雜交發(fā)現(xiàn)BMSCs優(yōu)先遷移至缺血區(qū)，并于缺血區(qū)發(fā)現(xiàn)部分標(biāo)記的BMSCs，表達(dá)神經(jīng)膠質(zhì)纖維蛋白、微管相關(guān)蛋白、星形膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元標(biāo)志物，且體內(nèi)外證實(shí)BMSCs表達(dá)CXCR4[9]。用慢病毒技術(shù)轉(zhuǎn)染BMSCs使其過(guò)表達(dá)CXCR4，過(guò)表達(dá)CXCR4的BMSCs在缺血區(qū)中的分布明顯多于單純BMSCs移植組，同時(shí)選擇siRNA技術(shù)阻斷CXCR4蛋白表達(dá)，缺血區(qū)eGFP標(biāo)記的BMSCs明顯減少[10]。

Fig 7 CXCR4 protein detected by Western blot

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，IA孵育BMSCs 24、48 h，與對(duì)照組相比，100～800 mg·L-1劑量組細(xì)胞增殖明顯減少(P<0.05)，100～800 mg·L-1劑量組可能因高藥物濃度而不利于BMSCs的增殖；IA孵育BMSCs 48 h，與對(duì)照組相比，6.25、3.125 mg·L-1劑量組細(xì)胞增殖明顯增加(P<0.05)，促進(jìn)BMSCs的增殖；IA孵育BMSCs 72 h，與對(duì)照組相比，12.5～800 mg·L-1劑量細(xì)胞增殖明顯減少(P<0.05)。綜上可知，100～800 mg·L-1藥物濃度組24 h前就開(kāi)始抑制細(xì)胞增殖，在48 h后依然可見(jiàn)其抑制作用，而IA 6.25、3.125 mg·L-1在24 h未見(jiàn)促進(jìn)BMSCs增殖，直到48 h才可見(jiàn)其促進(jìn)作用。72 h未見(jiàn)各濃度有促進(jìn)增殖作用，提示IA 12.5～800 mg·L-1組預(yù)處理時(shí)間過(guò)長(zhǎng)都可能影響B(tài)MSCs的細(xì)胞周期，對(duì)細(xì)胞有毒性作用，從而干預(yù)BMSCs增殖。而IA 6.25、3.125 mg·L-1在72 h與對(duì)照組相比，無(wú)明顯促進(jìn)細(xì)胞增殖作用，考慮時(shí)間因素和對(duì)照組在48～72 h細(xì)胞增殖幅度快于6.25、3.125 mg·L-1劑量組。故后續(xù)實(shí)驗(yàn)IA預(yù)處理的劑量為6.25、3.125 mg·L-1，時(shí)間在48 h較為合理。

Transwell小室的上層小室內(nèi)BMSCs的趨化動(dòng)力來(lái)源于下層含0.1 mg·L-1的重組大鼠源SDF-1α。在下層趨化因子SDF-1α的誘導(dǎo)下，體外BMSCs的遷移能力同樣很強(qiáng)，并且IA 3.125、6.25 mg·L-1預(yù)處理能夠激活BMSCs的遷移潛能。與對(duì)照組比較，IA 3.125、6.25 mg·L-1預(yù)處理48 h均明顯促進(jìn)BMSCs遷移，兩劑量組間差異沒(méi)有顯著性。與IA最佳劑量組(6.25 mg·L-1)相比，使用CXCR4特異性抑制劑AMD3100能明顯降低細(xì)胞遷移數(shù)量，提示AMD3100可阻斷IA對(duì)BMSCs遷移的促進(jìn)作用。鏡下AMD3100干預(yù)組可見(jiàn)有部分細(xì)胞遷移，提示細(xì)胞可能通過(guò)其他表面受體如CXCR7起作用，SDF-1α也能夠與該受體作用，而該受體可能與CXCR4協(xié)同，調(diào)節(jié)CXCR4激活下游信號(hào)通路而起作用[11-12]。

Western blot結(jié)果表明，與對(duì)照組比較，IA 6.25、3.125 mg·L-1組干預(yù)BMSCs 48 h均可見(jiàn)CXCR4蛋白表達(dá)增多，與IA 3.125 mg·L-1組相比，IA 6.25 mg·L-1組CXCR4蛋白表達(dá)明顯升高。但上述Transwell實(shí)驗(yàn)中，兩個(gè)劑量組間卻沒(méi)有明顯差異。免疫熒光染色結(jié)果表明，CXCR4于細(xì)胞內(nèi)、細(xì)胞膜都表達(dá)，與已報(bào)道的結(jié)果一致[13]，而IA 6.25 mg·L-1組可能主要是增加CXCR4總蛋白(膜蛋白與細(xì)胞內(nèi)蛋白之和)的表達(dá)遠(yuǎn)大于膜蛋白的表達(dá)增加。由此表明，IA預(yù)處理BMSCs能夠促進(jìn)CXCR4蛋白表達(dá)水平的提高，有利于BMSCs更多、更快進(jìn)入組織損傷區(qū)[14]，證實(shí)CXCR4在趨化BMSCs遷移中可能起關(guān)鍵作用。用合適劑量的IA干預(yù)移植前BMSCs，可能促進(jìn)BMSCs向損傷的中樞腦組織定向遷移，并可能取得良好療效[15]。

(致謝：本實(shí)驗(yàn)在福建醫(yī)科大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院燒傷研究所完成，在此對(duì)實(shí)驗(yàn)室老師的指導(dǎo)和幫助表示衷心的感謝！)

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