鎘對小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞睪酮合成的影響

朱文祥，劉洪茂，穆柯瀚，姬艷麗,，徐德祥

目的探討鎘對小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞睪酮合成的影響。方法鎘處理組采用20 μmol/L CdCl2處理TM3細(xì)胞，分別在加入CdCl24 h和8 h后收集細(xì)胞上清液，對照組TM3細(xì)胞給予等容積磷酸鹽緩沖液(DPBS)。采用ELISA法測定細(xì)胞上清液中睪酮含量，采用RT-PCR和Western blot技術(shù)檢測睪酮合成關(guān)鍵酶mRNA和蛋白表達(dá)水平。結(jié)果鎘處理組細(xì)胞上清液中睪酮含量明顯降低(P<0.01)。與對照組相比，鎘顯著下調(diào)TM3細(xì)胞類固醇激素合成急性調(diào)控蛋白(StAR)、細(xì)胞色素P450膽固醇側(cè)鏈裂解酶(P450scc)與17β-羥類固醇脫氫酶(17β-HSD) mRNA表達(dá)(P<0.01)，鎘處理組TM3細(xì)胞StAR、P450SCC、細(xì)胞色素P45017α-羥化酶(P45017α)、3β-HSD與17β-HSD的蛋白表達(dá)水平也明顯降低，與對照組相比，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05,P<0.01)。結(jié)論鎘抑制小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞睪酮的分泌，其原因可能與鎘抑制間質(zhì)細(xì)胞部分睪酮合成關(guān)鍵酶mRNA和蛋白表達(dá)水平有關(guān)。

鎘；睪丸間質(zhì)細(xì)胞；睪酮；睪酮合成

鎘的男(雄)性生殖毒性作用已經(jīng)受到越來越多的關(guān)注。該課題組前期研究[1]顯示，非職業(yè)人群中男性精液鎘濃度與精子質(zhì)量呈明顯負(fù)相關(guān)性。目前更多的研究[2-3]證實(shí)了這一結(jié)論，即精漿中鎘濃度與精子濃度及精子活力呈負(fù)相關(guān)性，與畸形精子百分比呈正相關(guān)性，甚至精液中很低濃度的鎘都可能通過降低精子質(zhì)量而引起男性不育。動物實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證明：鎘能夠誘導(dǎo)成年雄性大鼠或小鼠出現(xiàn)明顯的睪丸損傷、精子數(shù)量減少、精子活力下降甚至不育[4-5]。該課題組前期體內(nèi)研究結(jié)果[6]也表明，青春期鎘處理能夠損害睪丸發(fā)育，抑制睪酮合成。但目前對鎘抑制睪酮合成的分子機(jī)制尚未闡明。

睪酮是重要的雄激素之一，主要由睪丸間質(zhì)細(xì)胞合成分泌。該文以小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞系TM3細(xì)胞為研究對象，探討鎘對TM3細(xì)胞睪酮合成的影響及可能的分子機(jī)制，為科學(xué)地評價鎘對男(雄)性生殖系統(tǒng)的毒性作用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞株與主要試劑氯化鎘(CdCl2)購自美國Sigma公司；聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride, PVDF)膜購自美國Millipore公司；化學(xué)發(fā)光顯影試劑盒、細(xì)胞培養(yǎng)箱購自美國Thermo公司；β-actin、類固醇激素合成急性調(diào)控蛋白(steroidogenic acute regulatory protein, StAR)、細(xì)胞色素P450膽固醇側(cè)鏈裂解酶(P450 side-chain cleavage enzyme, P450scc)、3β-羥類固醇脫氫酶(3β-hydroxysteroid dehydrogenase, 3β-HSD)、細(xì)胞色素P45017α-羥化酶(P45017α-hydroxylase enzyme, P45017α)、17β-HSD抗體購自美國Santa Cruz公司；睪酮ELISA測定試劑盒購自蘇州卡爾文生物科技有限司；18S、StAR、P450scc和17β-HSD特異性引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)公司合成；等容積磷酸鹽緩沖液(dulbecco phosphate-buffered saline, DPBS)及DMEM/F12培養(yǎng)基購自美國Hyclone公司；胰蛋白酶、青霉素-鏈霉素溶液、馬血清及胎牛血清購自江蘇碧云天生物技術(shù)有限公司；細(xì)胞培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿和培養(yǎng)板購自美國Corning公司；光學(xué)倒置顯微鏡購自德國OLYMPUS公司；多規(guī)格制膠玻璃板、電泳儀和轉(zhuǎn)膜儀購自北京六一生物科技有限公司；Tanon全自動化學(xué)發(fā)光顯影儀及Tanon全自動化學(xué)發(fā)光圖像分析系統(tǒng)購自上海天能科技有限公司；羅氏Light Cycler 480實(shí)時熒光定量PCR儀及PCR儀統(tǒng)計分析軟件購自瑞士Roch公司；小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞系TM3細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)和處理TM3細(xì)胞在75 cm2培養(yǎng)瓶中貼壁培養(yǎng)，DMEM/F12培養(yǎng)基含5%滅活胎牛血清、2.5%滅活馬血清以及1%青霉素-鏈霉素溶液，放到恒溫環(huán)境37 ℃和5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)加樣器接種細(xì)胞于96孔板中，每板分為3組，每組10孔，每孔100 μl(約104個細(xì)胞)，外圍一圈孔加DPBS或培養(yǎng)液保濕，將96孔板置于恒溫37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18 h后開始染毒，CdCl2染毒劑量為20 μmol/L，對照組加相應(yīng)體積的DPBS，4 h后收細(xì)胞上清液即為鎘處理4 h組，再過4 h后收對照組和鎘處理8 h組的細(xì)胞上清液，此處收集的細(xì)胞上清液用于ELISA實(shí)驗(yàn)；加樣器接種細(xì)胞于6個90 mm培養(yǎng)皿中，每個皿加10 ml細(xì)胞懸液，每組2個皿的細(xì)胞，置于恒溫37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36 h，然后更換培養(yǎng)基培養(yǎng)液開始染毒，CdCl2染毒劑量為20 μmol/L，對照組加相應(yīng)體積的DPBS緩沖液，4 h后收細(xì)胞即為鎘處理4 h組，再過4 h后收對照組和鎘處理8 h組的細(xì)胞，此處收集的細(xì)胞用于Western blot實(shí)驗(yàn)；加樣器接種細(xì)胞于12個25 cm2培養(yǎng)瓶中，每組4瓶，每瓶加10 ml細(xì)胞懸液，置于恒溫37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36 h，待細(xì)胞長滿后然開始染毒8 h組和對照組，CdCl2染毒劑量為20 μmol/L，對照組加相應(yīng)體積的DPBS緩沖液，4 h后收細(xì)胞為鎘處理4 h組，再過4 h后收對照組和鎘處理8 h組的細(xì)胞，此處收集的細(xì)胞用于RT-PCR實(shí)驗(yàn)。

1.3ELISA法測定細(xì)胞上清液中睪酮含量20 μmol/L CdCl2處理不同時間(4、8 h)后收集細(xì)胞培養(yǎng)液，低速常溫離心機(jī)1 000 r/min離心10 min后收集上清液，置于-20 ℃冰箱中儲存待用。用ELISA試劑盒檢測細(xì)胞上清液中睪酮的含量。具體操作步驟為：先把睪酮試劑盒從4 ℃冰箱中取出，使用前先室溫平衡20 min，從鋁箔袋中取出所需的板條；20×洗滌緩沖液稀釋成1×洗滌緩沖液以備使用。在樣品孔中加入10 μl細(xì)胞上清液和40 μl稀釋液；標(biāo)準(zhǔn)品孔分別加入不同濃度(0、50、 100、200、400、800 pg/ml)的標(biāo)準(zhǔn)品50 μl；空白孔不加。在每個孔中都加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗體100 μl(除空白孔外)，用封板膜將反應(yīng)孔封住，放入37 ℃恒溫箱中孵育60 min。倒去反應(yīng)液體，在干燥的吸水紙上把液體拍干；在每個孔中再加入200 μl洗滌液洗滌，如此重復(fù)洗滌5次；每孔中分別加入50 μl的底物A液和50 μl的底物B液，放入37 ℃恒溫箱中避光孵育15 min。反應(yīng)結(jié)束后，在每孔中分別加入50 μl的終止液，混勻，利用底物四甲基聯(lián)苯胺與辣根過氧化物酶發(fā)生反應(yīng)而呈現(xiàn)藍(lán)色，再加入終止液，在酸的作用下最終轉(zhuǎn)變?yōu)辄S色。反應(yīng)顏色的深淺程度和細(xì)胞上清液中睪酮的含量呈線性關(guān)系。在15 min內(nèi)，用酶標(biāo)儀(波長450 nm)測量各孔的吸光度值，重復(fù)測量3次，每孔的吸光度值取3次測量的平均值。在Excel表中，以標(biāo)準(zhǔn)品的濃度作為橫坐標(biāo)，對應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)品的吸光度值作為縱坐標(biāo)，繪制出標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線，按照曲線方程計算各孔中細(xì)胞上清液睪酮的含量。

1.4RT-PCR反應(yīng)20 μmol/L CdCl2處理不同時間(4、8 h)后收集細(xì)胞，倒去培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液，用DPBS將瓶中的細(xì)胞洗2～3遍，用TRIzol裂解液提取細(xì)胞總RNA，隨后用AMV法對細(xì)胞樣品RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，置于-20 ℃或-80 ℃冰箱中儲存待用。擴(kuò)增反應(yīng)使用LightCycler?480 PCR儀，擴(kuò)增條件為：95 ℃預(yù)變性10 min，然后按95 ℃變性15 s、60 ℃退火15 s、72 ℃延伸30 s的程序進(jìn)行45次循環(huán)反應(yīng)[7]。末次循環(huán)后，在電腦上進(jìn)行溶解曲線分析以檢測cDNA的含量，按 2-ΔΔCT法計算目標(biāo)基因相對比值，用18 S作為實(shí)驗(yàn)的內(nèi)對照。本實(shí)驗(yàn)擴(kuò)增所使用的引物序列如下所示：18 S的正向引物：5′-GTAACCCGTTGAACCCCATT-3′，反向引物：5′-CCATCCAATCGGTAGTAGCG-3′；StAR的正向引物：5′-TGTCAAGGAGATCAAGGTCCTG-3′，反向引物：5′-CGATAGGACCTGGTTGATGAT-3′；P450scc的正向引物：5′-AGGTGTAGCTCAGGACTTCA-3′，反向引物：5′-AGGAGGCTATAAAGGACACC-3′；17β-HSD的正向引物：5′- ATTTTACCAGAGAAGACATCT-3′，反向引物：5′- GGGGTCAGCACCTGAATAATG-3′。

1.5Westernblot檢測相關(guān)蛋白的表達(dá)20 μmol/L CdCl2處理不同時間(4、8 h)后收集細(xì)胞，倒去培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液，用DPBS將瓶中的細(xì)胞洗2～3遍，用RIPA裂解液提取細(xì)胞總蛋白，采用BCA濃度測定試劑盒進(jìn)行蛋白定量。每孔上10～20 μg蛋白，進(jìn)行垂直電泳(濃縮膠電壓50 V、1 h，分離膠電壓100 V、1.5 h)，再以平行電泳(電流200 mA、3.5 h左右)的方式將凝膠中的細(xì)胞蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。轉(zhuǎn)移有蛋白的PVDF膜在5%脫脂牛奶中4 ℃封閉過夜。PVDF膜分別用一抗(β-actin：1 ∶4 000、StAR：1 ∶11 000、P450SCC：1 ∶1 000、P45017α：1 ∶1 000、17β-HSD：1 ∶1 000、3β-HSD：1 ∶1 000) 室溫孵2～3 h。洗滌后的PVDF膜用辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG(β-actin: 1 ∶40 000)、山羊抗兔IgG(P45017α: 1 ∶60 000、17β-HSD: 1 ∶80 000 和StAR: 1 ∶1 100 000)以及兔抗山羊IgG(P450SCC: 1 ∶60 000及 3β-HSD: 1 ∶120 000)于搖床上室溫孵育1～2 h。采用Tanon化學(xué)發(fā)光顯影儀檢測蛋白的表達(dá)水平，采用Tanon全自動化學(xué)發(fā)光圖像分析系統(tǒng)分析目的蛋白的灰度值與內(nèi)參蛋白的灰度值，目的蛋白的相對表達(dá)量的計算公式為：目的蛋白的相對表達(dá)量=目的蛋白的灰度值/內(nèi)參蛋白的灰度值。

2 結(jié)果

2.1鎘抑制TM3細(xì)胞睪酮分泌為研究鎘對TM3細(xì)胞睪酮分泌的影響，TM3細(xì)胞被給予20 μmol/L CdCl2，分別在加入CdCl24 h和8 h后收集細(xì)胞上清液，采用ELISA法測定細(xì)胞上清液中睪酮含量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：鎘處理4 h組和8 h組細(xì)胞上清液中睪酮含量分別為(383.3±9.2)、(367.4±6.1) pg/ml，明顯低于對照組睪酮含量(463.9±13.4) pg/ml (F=87.96,P<0.01)。 見圖1。

2.2鎘對TM3細(xì)胞睪酮合成關(guān)鍵酶mRNA表達(dá)的影響為探討鎘處理對TM3細(xì)胞睪酮合成關(guān)鍵酶mRNA表達(dá)的影響，TM3細(xì)胞被給予20 μmol/L CdCl2，分別在加入CdCl24 h和8 h后收集細(xì)胞，采用RT-PCR法檢測睪酮合成關(guān)鍵酶mRNA表達(dá)水平。結(jié)果顯示，鎘處理組StAR、P450SCC與17β-HSD mRNA的表達(dá)水平均呈下降趨勢(圖2)，鎘處理4 h組和8 h組StAR、P450SCC與17β-HSD mRNA的表達(dá)水平與對照組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(F=18.86、50.34、6.20，P<0.01、P<0.01、P<0.05)。

2.3鎘對TM3細(xì)胞睪酮合成關(guān)鍵酶蛋白表達(dá)的影響為探討鎘對TM3細(xì)胞睪酮合成通路關(guān)鍵酶蛋白表達(dá)的影響，TM3細(xì)胞被給予20 μmol/L CdCl2，分別在加入CdCl24 h和8 h后收集細(xì)胞，采用Western blot法檢測睪酮合成關(guān)鍵酶蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果顯示：與對照組相比，鎘明顯抑制TM3細(xì)胞StAR、P450SCC與P45017α的蛋白表達(dá)，并且隨鎘處理時間的延長，抑制作用更加明顯(F=180.86,P<0.01；F=22.34,P<0.01；F=46.87,P<0.01) (圖3A、B、D)。此外，鎘處理4 h組和8 h組TM3細(xì)胞3β-HSD與17β-HSD的蛋白表達(dá)水平也明顯降低(F=36.91、92.34,P<0.01) (圖 3C、E)。

圖1 CdCl2對TM3細(xì)胞睪酮分泌的影響

1：對照組；2：鎘處理4 h組；3：鎘處理8 h組;與對照組比較：**P<0.01

3 討論

睪酮屬于類固醇激素，主要由睪丸間質(zhì)細(xì)胞合成和分泌[8]，是雄激素的一種。睪酮對雄性生殖系統(tǒng)的生長發(fā)育起至關(guān)重要的作用，如刺激雄性外生殖器官及內(nèi)生殖器官發(fā)育成熟，促進(jìn)精子的生成和發(fā)育,維持雄性第二性征等。本課題組體內(nèi)研究[6]結(jié)果表明，鎘能夠損害睪丸發(fā)育，減少精子發(fā)生，其可能與鎘抑制睪酮的合成和分泌有關(guān)。本研究結(jié)果表明，鎘處理組TM3細(xì)胞睪酮含量明顯低于對照組，提示鎘能抑制小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞合成和分泌睪酮。

圖2 CdCl2對TM3細(xì)胞睪酮合成關(guān)鍵酶mRNA表達(dá)的影響 A：StAR；B：P450SCC；C：17β-HSD；1：對照組；2：鎘處理4 h組；3：鎘處理8 h組;與對照組比較：*P<0.05，**P<0.01

A：StAR；B：P450SCC；C：3β-HSD；D：P45017α；E：17β-HSD；1：對照組；2：鎘處理4 h組；3：鎘處理8 h組；與對照組比較：*P<0.05，**P<0.01；與鎘處理8 h組比較：##P<0.01

睪丸間質(zhì)細(xì)胞在合成睪酮時要經(jīng)過一系列酶促反應(yīng)：首先膽固醇通過位于睪丸間質(zhì)細(xì)胞線粒體外膜上的線粒體外膜上StAR轉(zhuǎn)運(yùn)至線粒體內(nèi)膜；在線粒體內(nèi)膜細(xì)胞色素P450scc的催化下，膽固醇被轉(zhuǎn)化為孕烯醇酮；后者被轉(zhuǎn)運(yùn)至滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，一方面在3β-HSD作用下被轉(zhuǎn)化為孕酮，另一方面其被P45017α催化為17-羥孕酮和雄烯二酮；最后雄烯二酮在17β-HSD作用下生成睪酮。外源化學(xué)物影響上述任一環(huán)節(jié)均可能對睪酮合成和分泌產(chǎn)生損害作用。本實(shí)驗(yàn)研究了鎘處理對TM3細(xì)胞睪酮合成關(guān)鍵酶的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，鎘處理組TM3細(xì)胞的StAR、P450scc、3β-HSD、P45017α和17β-HSD蛋白的表達(dá)水平與對照組比降低，且鎘處理組TM3細(xì)胞的StAR、P450scc和17β-HSD mRNA的表達(dá)水平與對照組比也降低。

綜上所述，鎘處理可能抑制了TM3細(xì)胞睪酮合成通路中關(guān)鍵酶mRNA和蛋白的合成，直接造成睪酮的分泌降低，睪酮分泌的減少又會影響到男(雄)性的生育功能。然而目前對鎘通過何種分子機(jī)制下調(diào)睪酮合成酶mRNA和蛋白的表達(dá)進(jìn)而抑制睪酮合成仍不清楚，尚需要開展進(jìn)一步的研究。

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