SIRT1/NF-κB通路參與白藜蘆醇改善大鼠腦缺血再灌注損傷炎性反應(yīng)

李傳文，張 嶸，侯 亮，管葉明1,，汪青松

腦卒中具有高發(fā)病率、高死亡率、高致殘率及高復(fù)發(fā)率等特點(diǎn)，系威脅人類健康的重要疾病之一，給家庭和社會(huì)帶來嚴(yán)重的負(fù)擔(dān)[1]。在我國，腦卒中所致的死亡率已躍居死亡原因的首位，其中缺血性腦卒中占整個(gè)卒中約70%，發(fā)病率呈逐年上升趨勢，并出現(xiàn)年輕化趨勢。在缺血性卒中的治療上，目前主要是采用超早期溶栓和神經(jīng)保護(hù)等措施，但由于有效治療時(shí)間窗短和易誘發(fā)腦內(nèi)出血等特點(diǎn)使其臨床應(yīng)用受到限制[2]，而神經(jīng)保護(hù)藥物雖然在臨床前實(shí)驗(yàn)中效果顯著，但在臨床試驗(yàn)中均以失敗告終。因此，深入研究缺血性腦卒中的發(fā)病機(jī)制，尋找有效的新藥物和(或)新方法并能在臨床推廣應(yīng)用是目前亟待解決的問題。

沉默信息調(diào)節(jié)蛋白 1(silent information regulator protein 1，SIRT1)是一種依賴NAD+的組蛋白去乙酰化酶。該物質(zhì)主要作用依賴于煙酰胺腺嘌呤二核苷酸/NADH 的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，通過多種轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)表達(dá)，起到神經(jīng)保護(hù)的作用。SIRT1因參與多種細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)而成為研究的熱點(diǎn)。既往研究[3]提示SIRT1的上調(diào)能夠抑制炎性反應(yīng)和細(xì)胞凋亡，減輕缺血再灌注損傷，促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)，具有一定的腦保護(hù)作用。該實(shí)驗(yàn)通過建立大鼠大腦中動(dòng)脈栓塞模型，通過尾靜脈注入SIRT1的激活劑白藜蘆醇及抑制劑EX527，觀察SIRT1表達(dá)變化對缺血再灌注大鼠腦組織中炎性因子白細(xì)胞介素(interleukin，IL)-1β、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、IL-6水平影響及其與核轉(zhuǎn)錄因子-κB (nuclear factor-κB，NF-κB)通路的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和分組選擇普通級健康雄性SD大鼠40只，7～8周齡，260～300 g ，購自安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。采取自然光照，自由進(jìn)食喂養(yǎng)，1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。所有大鼠隨機(jī)分為4 組：假手術(shù)組、模型組、白藜蘆醇組、EX527組，每組10 只。

1.2試劑及來源EX527、白藜蘆醇、DMSO(美國Sigma公司)；兔抗IL-1β、兔抗SIRT1(北京Bioss公司)；兔抗NF-κB p65、兔抗IL-6(英國Abcam公司)；兔抗TNF-α(美國Bioworld公司)；β-actin和二抗 (北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)；逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcriotion-polymerase chain reaction，RT-PCR)的TRIzol試劑盒(美國Invitrogen公司)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(RevertAidTMfirst Strand cDNA Synthesis Kit)(美國Thermo公司)。

1.3大鼠大腦中動(dòng)脈梗塞模型建立除假手術(shù)組外，其余三組采用改良線栓法[4]構(gòu)建大鼠右側(cè)大腦中動(dòng)脈栓塞模型，假手術(shù)組大鼠僅單純分離血管。在缺血期內(nèi)死亡或出現(xiàn)昏迷及抽搐的大鼠均被棄去。模型成功的標(biāo)準(zhǔn)：提大鼠尾部，使其懸空，30 s內(nèi)出現(xiàn)轉(zhuǎn)頸超過10°，左前肢(腦缺血對側(cè))屈曲內(nèi)收，肌張力下降，爬行時(shí)呈典型追尾征，若無此典型癥狀予以剔除。術(shù)后保持動(dòng)物體溫 (37 ±0.5) ℃。白藜蘆醇和EX527溶于5%DMSO，白藜蘆醇組分別于缺血前15 min和再灌注前1 min按照20 mg/kg經(jīng)尾靜脈注入白藜蘆醇； EX527組給藥時(shí)間同白藜蘆醇組，按照1 μg/kg經(jīng)尾靜脈注入EX527。

1.4神經(jīng)功能缺損評分除假手術(shù)組外，采用改良的神經(jīng)功能缺損評分mNSS量表[5]分別對其余三組于1、3、7、14 d時(shí)對其進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評分，共18分，其中13～18分為重度神經(jīng)功能缺損， 7～12分為中度神經(jīng)功能缺損，1～6分為輕度神經(jīng)功能缺損。

1.5RT-PCR法檢測梗死腦組織周邊SIRT1、NF-κB、IL-1β、TNF-α、IL-6mRNA表達(dá)在腦梗死周邊缺血半暗帶區(qū)取標(biāo)本，TRIzol法提取目的細(xì)胞總RNA。42 ℃反轉(zhuǎn)錄50 min，95 ℃ 5 min滅活反轉(zhuǎn)錄酶。RT-PCR檢測。PCR熱循環(huán)參數(shù)：96 ℃、4 min，然后三步反應(yīng)：94 ℃、30 s，58 ℃、30 s，72 ℃、30 s，40個(gè)循環(huán)，于每個(gè)循環(huán)的第三步即：72 ℃ 30 s收集熒光信號(hào)。RT-PCR結(jié)果分析得到目的基因表達(dá)的相對定量值(RQ值)，以2-ΔΔCT計(jì)算所得結(jié)果，見表1。

1.6Westernblot法檢測梗死周邊腦組織SIRT1、NF-κB、IL-1β和TNF-α、IL-6表達(dá)在腦梗死周邊缺血半暗帶區(qū)取標(biāo)本，加入RIPA細(xì)胞裂解液裂解，12 000 r/min，離心10 min，收集上清液，即含有組織總蛋白，取等量蛋白樣品，聚丙烯酰胺凝膠垂直電泳分離；分離后濕法轉(zhuǎn)至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉過夜；之后加入一抗4 ℃過夜；加入TBST洗滌3次；二抗室溫封閉2 h，TBST洗滌3次，ECL顯色，拍照進(jìn)行灰度掃描，以β-actin 為內(nèi)參，將目的基因與內(nèi)參β-actin條帶的灰度值比值作為目的基因的相對表達(dá)量 。

2 結(jié)果

2.1各組不同時(shí)間段神經(jīng)功能缺損評分比較假手術(shù)組各時(shí)間點(diǎn)神經(jīng)功能缺損評分均為0分。與模型組與EX527組比較，白藜蘆醇組在3、7、14 d神經(jīng)功能缺損評分明顯降低(F=1.533、9.112、8.820、13.793，P<0.01)，見表2。

2.2缺血區(qū)周邊腦組織IL-6、IL-1β、TNF-α、SIRT1、NF-κBmRNA水平白藜蘆醇組IL-1β、TNF-α、IL-6、NF-κB mRNA表達(dá)量均低于模型組和EX527組(P<0.01),SIRT1 mRNA表達(dá)高于模型組和EX527組(F=104.260、111.703、218.101、58.318、277.261，P<0.01)，見圖1。

2.3缺血區(qū)周邊腦組織IL-6、IL-1β、TNF-α、SIRT1、NF-κB蛋白表達(dá)水平白藜蘆醇組NF-κB、IL-1β、TNF-α、IL-6表達(dá)均低于模型組和EX527組(P<0.01)，SIRT1表達(dá)高于模型組和EX527組(F=179.998、305.022、110.542、401.454、78.912,P<0.01)，見圖2。

表1 RT-PCR引物序列及產(chǎn)物片段

表2 各組不同時(shí)間段神經(jīng)功能缺損評分比較

與模型組比較：**P<0.01；與EX527組比較：##P<0.01

圖1 各組缺血腦組織半暗帶IL-6、TNF-α、IL-1β、 SIRT1、NF-κB mRNA表達(dá)的變化

與假手術(shù)組比較：**P<0.01；與模型組和EX527組比較：##P<0.01

圖2 各組缺血腦組織半暗帶IL-6、IL-1β、TNF-α、 SIRT1、NF-κB蛋白表達(dá)量的變化

與假手術(shù)組比較：**P<0.01；與模型組和EX527組比較：##P<0.01

3 討論

既往研究[6]顯示SIRT1能夠減輕氧化應(yīng)激和炎性反應(yīng)， 還能夠抑制缺血再灌注所致腦組織損傷凋亡， 保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞[7]。近年研究[8]顯示在小鼠的脂肪肝模型中，白藜蘆醇可以通過激活SIRT1抑制NF-κB炎性反應(yīng)通路，該研究提示白藜蘆醇可減少炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6及NF-κB p65的表達(dá)。

白藜蘆醇是一種多酚化合物， 廣泛存在于植物如花生、中藥的虎杖 、葡萄以及紅葡萄酒中等。隨著老齡化上升和細(xì)胞的衰老，SIRT1的水平和活性在緩慢下降[9]。在大鼠腦缺血模型治療前，尾靜脈注射白藜蘆醇，可以增加SIRT1的活性，改善炎性反應(yīng)，減少大鼠神經(jīng)元的死亡[10]。白藜蘆醇能穿過血腦屏障到腦組織,對中樞神經(jīng)病變起保護(hù)作用。本實(shí)驗(yàn)中， 課題組發(fā)現(xiàn)與模型組和抑制劑組比較， 白藜蘆醇明顯提高了SIRT1的蛋白表達(dá)，下調(diào)TNF-α、IL-1β、IL-6及NF-κB p65炎性因子的表達(dá)。提示白藜蘆醇抑制大鼠腦缺血再灌注損傷的炎性反應(yīng)，對抗大鼠腦損傷的保護(hù)作用可能與其激活SIRT1/NF-κB 信號(hào)通路有關(guān)。而 EX527組與模型組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，理論上兩組應(yīng)該有意義，本實(shí)驗(yàn)未作出相應(yīng)的結(jié)果，可能主要是由于當(dāng)大鼠腦缺血損傷時(shí)，本身的SIRT1消耗過多，導(dǎo)致體內(nèi)含量較少，使得抑制劑未發(fā)揮作用，其次是注射藥物濃度低及樣本量少的原因。本研究表明SIRT1的激活能夠有效改善大鼠缺血再灌注損傷的炎性反應(yīng)。

腦缺血再灌注損傷后激活白細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞等炎性細(xì)胞產(chǎn)生大量炎性因子，如細(xì)胞因子、趨化因子和黏附分子等。NF-κB是一種介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的核轉(zhuǎn)錄因子， 在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，通過增強(qiáng)TNF-α、IL-1β及IL-6等促炎性因子基因的表達(dá)進(jìn)一步促進(jìn)炎性反應(yīng)[11]。越來越多的證據(jù)顯示，SIRT1 激活能使 NF-κB的 RelA/p65 亞單位去乙?；?， 抑制 NF-κB 的轉(zhuǎn)錄活性， 在炎癥損傷中起保護(hù)作用。既往研究[12]表明，SIRT1具有抗炎并抑制細(xì)胞間黏附分子表達(dá)的作用,當(dāng)炎性反應(yīng)途徑激活轉(zhuǎn)錄因子NF-κB，刺激線粒體產(chǎn)生大量氧自由基，而SIRT1則通過使Rel A/p65去乙?；?，抑制其與NF-κB啟動(dòng)子的結(jié)合，從而干擾 NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)來減少氧自由基的產(chǎn)生，最終起到抗炎作用[13]。

綜上所述，本研究結(jié)果表明在白藜蘆醇激活SIRT1的條件下，能夠減輕大鼠缺血再灌注損傷后的炎性發(fā)應(yīng)，改善大鼠神經(jīng)功能缺損的恢復(fù)， 其機(jī)制可能是通過抑制NF-κB通路實(shí)現(xiàn)的。

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