伴發(fā)閉角型青光眼視網膜色素變性遺傳家系的表型分析和基因檢測

李潤璞，劉鐵城，李淑賢，陳曉菲，代艾艾，高旭輝

解放軍總醫(yī)院 眼科，北京 100853

視網膜色素變性(retinitis pigmentosa，RP)是一組遺傳性視網膜變性疾病，主要表現為從中周部向黃斑及中心凹蔓延的進行性感光細胞和色素上皮功能喪失[1-2]，目前在全世界的發(fā)病率約為1/3 500[3]，在中國約為1/3 467[4]。RP的遺傳方式多樣，非綜合征型RP主要包括常染色體顯性遺傳(20% ～ 25%)、常染色體隱性遺傳 (15% ～ 20%)、X-連鎖遺傳(10% ～ 15%)和散發(fā)型(30%)，極少數是雙基因型和線粒體相關型[1]。目前已經確認有83個致病基因與RP有關，其中可以表現為常染色體顯性遺傳的有28個[5]。然而除了典型的眼底表現外，有20% ～ 30%的患者伴隨其他眼部癥狀甚至非眼部疾病，以Usher綜合征(USH)和Bardet-Biedl綜合征(BBS)最為常見。Usher綜合征患者占所有RP患者的10% ～ 20%，最常見的伴隨癥狀是不同程度的聽覺障礙，部分伴有前庭性共濟失調；占5% ～ 6%的Bardet-Biedl綜合征患者除眼部癥狀外，還深受向心性肥胖、認知功能障礙、畸形、生殖腺發(fā)育不全和腎病的困擾[2]。同樣的，伴發(fā)青光眼的急性發(fā)作或慢性進展也是RP患者視力急劇惡化的主要危險因素。本研究對一個來自中國山東的伴發(fā)閉角型青光眼的視網膜色素變性顯性遺傳家系進行臨床診斷及基因檢測，并對基因突變和臨床表型的關系進行探討。

資料和方法

1 對象 本研究符合《赫爾辛基宣言》原則。經我院倫理委員會批準，所有受檢者均簽署知情同意書。先證者來自山東省，2016年9月在本院眼科門診診斷為視網膜色素變性，了解家族史后對其家系內6例成員進行檢查，其中5例患者(Ⅲ：6、Ⅲ：9、Ⅳ：5、Ⅳ：9、Ⅳ：10)，1例正常成員(Ⅲ：14)(圖 1)。

2 臨床資料 采集按照RP的診斷標準，詢問家系成員病史，繪制家系圖譜，門診檢查視力、眼壓、視野、OCT等，裂隙燈及房角鏡檢查眼前節(jié)情況，散瞳后間接檢眼鏡查眼底并進行眼底照相，行視網膜電圖(electroretinogram，ERG)檢查。

3 外周血DNA制備 采集5例患者及1例正常成員的外周靜脈血樣品8 ～ 10 ml，乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝。采用硅膠模技術及快速離心柱操作提取基因組DNA(QIAamp DNA Blood Midi Kit，Qiagen，Hilden，Germany)。紫外分光光度計及瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA純度合格，-80℃保存待用。

4 目標序列捕獲與測序 使用Covaris LE220超聲波儀(Massachusetts，USA)將先證者Ⅲ：9的DNA打斷成200 ～ 250 bp的片段，然后Ampure Beads純化，通過末端修復、加“A”以及加接頭反應，制備先證者的DNA文庫。使用定制RP基因片段捕獲芯片(Roche NimbleGen，Madison，USA)與先證者DNA庫雜交，隨后進行芯片的洗滌、洗脫反應和已捕獲樣品的LM-PCR反應。使用Agilent 2100 Bioanalyzer 和ABI StepOne，進行文庫的濃度、片段大小、富集度的檢測，最后高通量測序儀Illumina HiSeq2500 Analyzers(Illumina，SanDiego，USA)連續(xù)雙向測序90個循環(huán)并通過Illumina Pipeline software(version 1.3.4)讀出原始測序數據[6]。

5 序列分析及驗證 參考美國醫(yī)學遺傳學和基因組學學院(American College of Medical Genetics and Genomics，ACMG)相關指南解讀數據，評估下機的原始數據(Raw reads)的測序質量，首先去除被接頭污染以及低質量reads，隨后用Burrows Wheeler Aligner軟件[7]比對HG19序列，評價序列捕獲效果，用SOAPsnp軟件[8]和Samtools軟件[9]分別進行SNV(single nucletide variant)和Indel(insertion and deletion)查詢，生成目標區(qū)域堿基多態(tài)性結果，比對數據庫NCBI dbSNP、HapMap、1000 Human Genome Dataset和 Database of 100 Chinese Healthy Adults，找出可疑突變，進行注釋、篩選[6]。在所篩選出的致病突變所在片段的上下游設計引物并進行PCR擴增，對產物做Sanger測序，比對相關基因標準序列驗證結果。使用同樣的引物，對家系內其他成員的基因組DNA相關突變片段進行Sanger測序。

結 果

圖1 視網膜色素變性家系系譜圖Fig. 1 RP family tree chart

1 家系臨床特征 先證者Ⅲ9的姐姐Ⅲ：6和子女Ⅳ：9、Ⅳ：10經檢查均為患者，該家系RP性狀連續(xù)4代傳遞，男女均有發(fā)病，比例為1∶2，符合常染色體完全顯性遺傳特征。5例患者，年齡28 ～ 60歲；夜盲為首發(fā)癥狀，平均發(fā)病年齡6歲，20歲之后出現不同程度視野缺損，平均41.5歲時視力明顯下降，無色覺異常，Ⅲ：6、Ⅲ：9曾因長期眼痛、高眼壓分別于7年前、3年前于外院行小梁切除+虹膜周切術，現眼壓均在正常范圍內(表 1)。

2 體征及檢查 除Ⅳ：10外的4例患者均具有慢性閉角型青光眼相關的前節(jié)癥狀，裂隙燈下可見前房淺，晶狀體表面散在少量色素，小梁可見不同程度色素沉積(圖2A、圖2B)。依照Scheie房角寬窄分類法，房角鏡下患者房角呈窄Ⅰ～窄Ⅳ，先證者雙眼均存在房角關閉(圖2C、表2)。所有患者存在典型的RP表現：視網膜均呈青灰色，視盤顏色正常，杯盤比0.3，血管弓外可見輕度骨細胞樣改變，此外Ⅲ：6、Ⅲ：9同時存在視網膜血管變細 (圖 2D、圖 2E)。Humphrey Zeiss 750i視野分析儀檢測患者Ⅲ：9、Ⅳ：9、Ⅳ：10為上方視野受損，Ⅲ：6、Ⅳ：5為管狀視野(圖2F、圖2G)，經Zeiss Cirrus 5000 Hd-OCT檢查可見除Ⅳ：10外的患者視網膜中心凹結構改變，中心凹外視網膜變薄，神經纖維層厚度減小(圖2H、圖2I、圖2J)。使用Roland公司生產的視覺電生理檢查系統(tǒng)(Ganzfeld Q450 ERG)檢查見患者的a波、b波等均波幅重度降低或呈熄滅狀態(tài)。Ⅲ：14檢查無閉角型青光眼及RP表現。受檢者眼底檢查結果見表2。

3 測序結果及生物信息學分析 先證者目標序列捕獲高通量測序共檢測到突變89個，其中1個缺失突變和1個插入突變的突變位置均位于內含子，對氨基酸編碼無影響，其余87個堿基置換突變中，有77個可以引起氨基酸編碼順序的改變。比較在互聯網和本地數據庫中的突變頻率后，經生物信息學分析，9個＜0.05的突變中有2個疑似致病(RHO基因c.541G＞Ap.Glu181Lys突變和CNGA1基因的c.1271G＞Ap.Arg424Gln突變)。

4 患者自身及家系內驗證 對先證者及家系內其他成員的RHO基因c.541G＞Ap.Glu181Lys突變和CNGA1基因的c.1271G＞Ap.Arg424Gln突變進行Sanger測序，結果顯示：RHO基因c.541G＞Ap.Glu181Lys突變與臨床表型共分離，驗證結果見圖3。

表l RP遺傳家系的臨床表型特點Tab. 1 Phenotypic characteristics of members in the RP family

表2 RP患者檢查結果Tab. 2 Results of ophthalmologic examinations in RP patients

圖2 RP家系患者臨床表型特點 A:患者Ⅲ：6右眼，可見11點位虹膜根切孔； B:患者Ⅲ：9右眼前房淺; C:患者Ⅲ：9右眼房角關閉;D:患者Ⅲ：6右眼視網膜全周青灰色、骨細胞樣改變，視網膜血管明顯變細； E:患者Ⅲ：9左眼視網膜骨細胞樣色素沉積，下方血管瘤樣改變； F:患者Ⅲ：9右眼上方視野受損； G:患者Ⅲ：6右眼管狀視野； H:患者Ⅲ：9雙眼視網膜纖維層厚度減小； I:患者Ⅲ：9右眼中心凹視網膜厚度增加； J:患者Ⅲ：6右眼黃斑外側視網膜厚度明顯減小Fig. 2 Clinical characteristics of RP patients A: patient Ⅲ 6, OD, showing an iris hole at 11 o'clock direction; B: patient Ⅲ 9,OD, showing shallow anterior chamber; C: patient Ⅲ 9, OD, showing chamber angle closure; D: patient Ⅲ 6, OD, showing attenuation of vessels, bone spicule deposits in the retina； E: patient Ⅲ 9, OS, showing bone spicule deposits in the retina,aneurysmal change of inferior vessels; F: patient Ⅲ 9, OD, showing superior visual field defect; G: patient Ⅲ 6, OD, showing a tubular visual field; H: patient Ⅲ 9, OD/OS, showing retinal nerve fiber layer thickness decrease; I: patient Ⅲ 9, OD, showing retinal thickness increase in central fovea; J: patient Ⅲ 6, OD, showing a thin retina beside macula lutea

圖3 先證者Ⅲ：9 Sanger測序驗證結果Fig. 3 Sanger sequencing results of the prob and Ⅲ：9

討 論

根據本家系內患者的夜盲合并視野缺損病史、眼底表現和ERG特點，可以比較明確地做出RP的初步診斷。值得注意的是，患者Ⅲ：6、Ⅲ：9同時伴有閉角型青光眼，Ⅳ：5、Ⅳ：9也存在著不同程度的房角狹窄，提示RP患者可能存在青光眼易感性和家族聚集性。研究顯示，RP患者伴發(fā)青光眼的發(fā)病率為2% ～ 12%[10]。根據彭清華[11]的統(tǒng)計分析，RP患者伴發(fā)青光眼的發(fā)病率是普通人群的2.13倍；Ko等[12]回顧分析382例臺灣RP患者后提出，與正常人比較，RP患者伴發(fā)急性閉角型青光眼的概率是正常人的3.64倍。且在歐美開角型青光眼占多數，在我國閉角型青光眼較開角型少[10]，考慮與種族差異有關。但RP患者伴發(fā)青光眼在臨床上較易漏診，主要原因是除急性發(fā)作型外多無疼痛等癥狀，且因RP的發(fā)病過程影響，視野改變不易診斷。本家系內Ⅲ：6、Ⅲ：9可見虹膜膨隆、淺前房、房角色素沉積，其輕微的視盤損害和正常范圍杯盤比與長期高眼壓病史不符，與典型閉角型青光眼不同，且視盤顏色變化較典型RP合并青光眼患者更加不明顯，這一臨床特點豐富了RP合并青光眼疾病的表型范圍，更有助于以后的臨床診斷。

目前，RP伴發(fā)青光眼的發(fā)病機制仍不明確，可能與原發(fā)性閉角型青光眼的病理過程不同[12]，有報道認為原因在于變性的視網膜及視網膜色素上皮的毒性物質損害了小梁網的功能；從病理組織學來看，虹膜血管壁肥厚和葡萄膜血管壁異常與此有關；RP對其他器官及全身的影響，如黏多糖變性，也可導致了青光眼的發(fā)生[13]。本家系可能的致病原因：1)患者的原發(fā)性RP及年齡因素可能導致晶狀體懸韌帶退行性變化而松弛或稀疏，出現淺前房，“推擠”虹膜及睫狀體導致繼發(fā)性房角關閉[14]；2)由于色素沉積在房水流出道，繼而引起眼壓上升，查閱文獻雖未發(fā)現病理組織檢查小梁網色素堵塞報告，但仍不排除為色素播散導致的復雜組織反應所致；3)從遺傳學角度考慮，盡管RP和青光眼可以單獨發(fā)病，但二者在基因的表達上有可能是相互影響的，這一理論仍需進一步研究來證實。

臨床上為了防止漏診，RP患者應常規(guī)進行眼壓測量，必要時檢查房角，以便早期診斷、早期治療，延緩患者失明進程。此外，對于青光眼，尤其是閉角型青光眼，未能散瞳進行周邊視網膜檢查時，應調查患者有無夜盲及其RP家族史，從而判斷有無合并RP對視野造成的影響。一旦確診為RP合并青光眼，則建議患者接受家系調查，并進行遺傳咨詢。YAG激光周邊虹膜成形術(LPI)的安全性、有效性及對視覺質量的較小影響[15]，建議周邊前房淺、房角鏡檢查確認房角窄的RP患者，盡早進行預防性LPI治療。

本家系通過高通量測序平臺，結合Sanger測序驗證，初步認為致病原因與RHO基因EX3/CDS3上的c.541G＞Ap.Glu181Lys雜合突變有關，此突變導致RHO蛋白181位的谷氨酸替換為賴氨酸，致病性有相關文獻報道[16-18]。

人類RHO基因位于3q21-q24，長約6 952 bp，由5個外顯子和4個內含子組成，編碼的視紫紅質(rhodopsin，RHO)蛋白是RP中發(fā)現的第一個突變蛋白。視紫紅質是視桿細胞外節(jié)的視色素，包括一個由348個氨基酸組成的視蛋白和一個發(fā)色團(11-順式視黃醛)，被光子激發(fā)后發(fā)色團異構化為全反式視黃醛并導致光傳導的激活，主要介導暗環(huán)境下的視力[19-20]。RHO基因是國內外已知的RP最常見致病基因之一[2,21-23]，自Dryja等[24]在1990年首次報道adRP患者的RHO基因突變以來，迄今為止已經發(fā)現100多個與RP相關的RHO突變[25]。RHO基因不同的突變之間RP表型差異性較大，大多數情況下會導致常染色體顯性遺傳RP，但是也偶爾表現為常染色體隱性遺傳RP[18]或者顯性先天性靜止性夜盲[26]。

本研究對一個伴發(fā)慢性閉角型青光眼的RP家系進行了臨床檢查和基因檢測，豐富了RP合并青光眼疾病的表型范圍，初步確認了致病基因突變。期望未來能結合更多的病例對RP合并青光眼的臨床和基因診斷進行研究，進一步探討兩種疾病的內在關系，對臨床診療提供指導。

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