人脂肪干細(xì)胞膜片的構(gòu)建及其生物學(xué)特性初探

楊 芳，陳書強(qiáng)，蘆 潔，董 杰，孫惠君，郭雯娓，王晶晶，張建華，馬 媛，王曉紅

空軍軍醫(yī)大學(xué)(第四軍醫(yī)大學(xué))唐都醫(yī)院 生殖醫(yī)學(xué)中心，陜西西安 710038

組織工程技術(shù)的發(fā)展為組織器官的修復(fù)和再生開辟了新的治療方法。雖然采用傳統(tǒng)的細(xì)胞懸液或聯(lián)合生物支架材料移植方法在修復(fù)受損組織取得一定的成功[1-2]，但這兩種技術(shù)仍存在一定缺陷，如單細(xì)胞懸液注射后細(xì)胞易發(fā)生吸收、擴(kuò)散，難以留在治療部位，且注射細(xì)胞量有限，修復(fù)效能較低[3]；而支架材料常因移植部位炎癥、自身免疫或者機(jī)械損傷等因素引起較高比例的細(xì)胞死亡或損失。自從Okano發(fā)明了不含支架材料的細(xì)胞膜片構(gòu)建方法后，細(xì)胞膜片已作為細(xì)胞移植的一種新方法廣泛應(yīng)用于再生醫(yī)學(xué)應(yīng)用和研究。目前細(xì)胞膜片已應(yīng)用于牙科、食管腫瘤術(shù)后、心肌缺血等領(lǐng)域[4-6]。而在生殖領(lǐng)域中的應(yīng)用鮮有報(bào)道。人脂肪干細(xì)胞(adipose-derived stemcells，ADSCs)來源廣泛，可自體取材，避免了免疫排斥問題；其具有一定的分泌、分化能力，且能提高修復(fù)組織的細(xì)胞活性，促進(jìn)血管的再生[7]；目前未見其移植后成瘤報(bào)道[8]。因此，本課題組選擇了ADSCs作為種子細(xì)胞構(gòu)建細(xì)胞膜片，在穩(wěn)定構(gòu)建人ADSCs膜片的基礎(chǔ)上，對(duì)其基本生物學(xué)特性進(jìn)行鑒定，并通過檢測(cè)其分泌的促進(jìn)組織再生的相關(guān)細(xì)胞因子探討脂肪干細(xì)胞膜片應(yīng)用于組織損傷修復(fù)的可行性。

材料和方法

1 采集樣本 實(shí)驗(yàn)所用脂肪組織為唐都醫(yī)院婦產(chǎn)科患者行腹部手術(shù)時(shí)獲取，供者年齡25 ～ 35歲，排除乙肝和結(jié)核等傳染病。所有樣本均征得供者本人及家屬同意并填寫知情同意書后獲取。

2 主要試劑和儀器 DMEM培養(yǎng)基(Gibco公司，美國(guó))；胎牛血清(四季青，中國(guó))；2.5 g/L胰酶(MP公司，美國(guó))；流式抗體(Biolegend公司，美國(guó))；Ⅰ型膠原酶、DMSO、地塞米松、β-甘油磷酸鈉、茜素紅、油紅O(Sigma公司，美國(guó))；維生素C(Gibco公司，美國(guó))；成脂誘導(dǎo)液(Cyagen公司，美國(guó))；引物序列(上海生工生物工程股份有限公司)；Elisa試劑盒(依科賽公司，中國(guó))；反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Abcam公司，美國(guó))；酶標(biāo)儀(MD，美國(guó))；流式細(xì)胞儀(BD公司，美國(guó))；PCR儀(Bio-Rad公司，美國(guó))；倒置顯微鏡(ZEISS公司，德國(guó))；細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo公司，美國(guó))。

3 分離培養(yǎng)人ADSCs 將取得的少量脂肪組織裝入盛有PBS的無菌離心管中，用無菌PBS反復(fù)沖洗并剪去血污后，剪碎至1 mm3大小，加入0.25%的Ⅰ型膠原酶，37℃恒溫?fù)u床消化90 min，加等量含10% FBS以及1%雙抗的DMEM/F12培養(yǎng)液終止消化，用100目和200目的篩網(wǎng)依次過濾，800 r/min 5 min離心2次，棄上清，加入DMEM/F12培養(yǎng)液制成細(xì)胞懸液，接種在25 cm2的培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，原代接種24 h后首次換液，洗去懸浮細(xì)胞碎片和雜質(zhì)。之后隔日給細(xì)胞換液1次，每日觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)至80% ～ 90%的融合度時(shí)，用0.25%的胰蛋白酶消化細(xì)胞并傳代。

4 流式細(xì)胞術(shù)鑒定人ADSCs表面標(biāo)記物 取第3代(P3)人脂肪干細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×105/ml，取6支流式管，向每支流式管中分別加入1 ml細(xì)胞懸液，800 r/min離心5 min，棄上清后，分別加入5μl相應(yīng)流式抗體，抗體種類分別是CD29-PE、CD44-APC、CD45-percp-cy5.5、CD90-FITC、CD105-APC單克隆抗體，加入相應(yīng)的同型抗體作為陰性對(duì)照，震蕩混勻。4℃避光孵育30 min后，每管加入1 ml流式洗液清洗2次，800 r/min離心5 min棄上清，加入400 μl流式固定液，200目的篩網(wǎng)過濾去除雜質(zhì)，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)人ADSCs相關(guān)的表面標(biāo)記分子。

5 繪制ADSCs體外生長(zhǎng)曲線 取P3 ADSCs，以2×103/孔的細(xì)胞密度分別接種于7塊96孔板中，置入37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每24 h取出1塊96孔培養(yǎng)板，按照CCK-8法檢測(cè)試劑盒說明書加入10 μl的CCK-8，用酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm波長(zhǎng)的吸光度值，并根據(jù)結(jié)果繪制細(xì)胞體外生長(zhǎng)曲線。6 鑒定ADSCs多向分化能力 取P3 ADSCs，以2×104/孔的細(xì)胞密度接種于兩塊6孔板中，24 h細(xì)胞貼壁后，分別換成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)液(含10%FBS，1%雙抗，1 mol/L地塞米松，0.1 mmol/L吲哚美辛，10 mg/L胰島素，0.5 mmol/L IBMX的DMEM/F12)和成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液(含10 nmol/L地塞米松、50μg/ml維生素C、10 mmol/Lβ-甘油磷酸鈉、10% FBS、1%雙抗的DMEM/F12)培養(yǎng)，之后隔日給細(xì)胞換液1次，進(jìn)行成脂誘導(dǎo)的ADSCs連續(xù)培養(yǎng)7 d，油紅O染色進(jìn)行鑒定。進(jìn)行成骨誘導(dǎo)的ADSCs連續(xù)培養(yǎng)21 d，茜素紅染色鑒定。

7 構(gòu)建ADSCs膜片 取P3 ADSCs，以1×106/孔的細(xì)胞密度接種于6孔板中，24 h細(xì)胞貼壁后，換添加維生素C和地塞米松的細(xì)胞膜片誘導(dǎo)培養(yǎng)液培養(yǎng)，之后隔日給細(xì)胞換液1次，連續(xù)培養(yǎng)10 ～ 14 d，觀察細(xì)胞膜片形態(tài)。

8 掃描電鏡觀察ADSCs膜片結(jié)構(gòu) ADSCs被誘導(dǎo)成膜片后，棄誘導(dǎo)液，PBS沖洗兩遍，用2.5%的戊二醛4℃固定24 h，標(biāo)本送至第四軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)院電鏡中心掃描觀察。

9 qRT-PCR檢測(cè)細(xì)胞因子及干性基因mRNA表達(dá) 取P3 ADSCs和ADSCs膜片，用Trizol法提取細(xì)胞總RNA，檢測(cè)RNA純度及濃度合格后，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀檢測(cè)相關(guān)細(xì)胞因子及干性基因的mRNA的相對(duì)表達(dá)量，引物序列見表1。

表1 實(shí)時(shí)熒光PCR引物Tab. 1 Primer for real-time PCR

10 ELISA法測(cè)定細(xì)胞因子濃度 取P3 ADSCs對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的上清液和ADSCs成細(xì)胞膜片后上清液，用ELISA檢測(cè)兩種上清中細(xì)胞因子TGF-β1、FGF、HGF、VEGF的濃度。

11 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，所有計(jì)量資料以-x±s表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 人ADSCs形態(tài)及生長(zhǎng)曲線 ADSCs原代培養(yǎng)約4 h貼壁，24 h后細(xì)胞完全貼壁生長(zhǎng)，體外分離培養(yǎng)的ADSCs生長(zhǎng)狀態(tài)良好，光學(xué)顯微鏡下可見原代ADSCs呈現(xiàn)短梭形、多角形(圖1A)。P3代以后細(xì)胞大小形態(tài)基本均一，胞體狹長(zhǎng)，呈成纖維細(xì)胞樣(圖1B)。ADSCs生長(zhǎng)曲線成典型的S型，1 ～ 2 d為潛伏期，3 ～ 5 d進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，繼續(xù)培養(yǎng)至6 ～ 7 d進(jìn)入平臺(tái)期，隨后進(jìn)入衰退期(圖1C)。

圖1 人脂肪干細(xì)胞形態(tài)及生長(zhǎng)曲線 A：原代脂肪干細(xì)胞(50ⅹ)； B：第三代脂肪干細(xì)胞(50ⅹ); C: 脂肪干細(xì)胞生長(zhǎng)曲線Fig. 1 Isolation and culture of ADSCs A: P0 ADSCs; B:P3 ADSCs; C: Growth curve of ADSCs

圖2 人ADSCs表面特定分子流式鑒定Fig. 2 Specific human ADSCs surface markers detected by flow cytometry

2 人ADSCs表面特定分子檢測(cè)結(jié)果 流式細(xì)胞儀檢測(cè)顯示人ADSCs的間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)記分子CD29、CD44、CD90、CD105均為陽性；造血干細(xì)胞表面標(biāo)記分子CD45表達(dá)陰性，結(jié)果符合人ADSCs表面特定分子的表達(dá)(圖2)。

3 人ADSCs成脂誘導(dǎo) 人ADSCs經(jīng)成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)液連續(xù)培養(yǎng)7 d后，進(jìn)行油紅O染色，可見紅色脂滴形成(圖3A)。同樣經(jīng)過成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基連續(xù)培養(yǎng)21 d后，進(jìn)行茜素紅染色，細(xì)胞表面形成了紅褐色礦化結(jié)節(jié)(圖3B)，結(jié)果提示人ADSCs具有多向分化能力。

4 構(gòu)建人ADSCs膜片 對(duì)P3代ADSCs采用細(xì)胞膜片誘導(dǎo)培養(yǎng)液連續(xù)培養(yǎng)10 ～ 14 d，可獲得白色膜狀的細(xì)胞膜片，鏡下觀察可見膜片中的細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形重疊生長(zhǎng)(圖4A)，成熟的細(xì)胞膜片可被輕輕刮下，且具有一定韌性和彈性(圖4B)。

圖3 脂肪干細(xì)胞體外分化能力鑒定A:成脂誘導(dǎo)7 d油紅O染色(50ⅹ); B :成骨誘導(dǎo)21 d茜素紅染色(100ⅹ)Fig. 3 Identification of differentiation potential ofADSCs in vitroA: Adipogenic differentiation of ADSCs was assessed by Oil Red staining (50ⅹ);B: Osteogenic differentiation of ADSCs was assessed by Alizarin Red Staining (100ⅹ)

圖4 人脂肪干細(xì)胞膜片A： 光鏡下形態(tài)； B： 大體外觀Fig. 4 Human ADSCs cell-sheetA: Microscopic image; B: Gross image

圖5 人脂肪干細(xì)胞膜片掃描電鏡下形態(tài)學(xué)觀察A：300ⅹ; B：1 000ⅹ; C：5 000ⅹ; D：10 000ⅹFig. 5 Morphological observation of human ADSCs cell-sheet by scanning electron microscopeA：300ⅹ; B：1 000ⅹ; C：5 000ⅹ; D：10 000ⅹ

圖6 比較人ADSCs和ADSCs膜片相關(guān)各細(xì)胞因子與干性基因mRNA表達(dá)量(aP＜0.05)Fig. 6 Comparison of mRNA levels of cytokines and stem-related genes between human ADSCs and human ADSCs cell-sheet (aP＜0.05)

5 人ADSCs膜片電鏡下形態(tài) 細(xì)胞膜片表面光滑，膜片中的細(xì)胞呈網(wǎng)格樣疊加生長(zhǎng)，細(xì)胞之間相互連接緊密(圖5)，放大300倍和1 000倍都隱約可見細(xì)胞的輪廓(圖5 A和圖5 B)，放大5 000倍和10 000倍能看到細(xì)胞與細(xì)胞之間連接成片的細(xì)胞外基質(zhì)，以及膜片是由多層細(xì)胞疊加形成(圖5 C和圖5 D)。

6 比較人ADSCs和ADSCs膜片的相關(guān)細(xì)胞因子與干性基因mRNA相對(duì)表達(dá)情況 qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，與人ADSCs相比，人ADSCs膜片的 TGF-β1、FGF2、HGF、VEGF、CoL1A1的mRNA表達(dá)水平顯著升高(P均＜0.05)(圖6A)。同時(shí)人ADSCs膜片的干性基因OCT4及NANOG的mRNA水平也顯著增高(P均＜0.05)(圖6B)。

7 比較ADSCs和ADSCs膜片的上清液細(xì)胞因子濃度 采用ELISA法檢測(cè)兩組的相關(guān)細(xì)胞因子濃度，結(jié)果顯示人ADSCs膜片上清液中的促生長(zhǎng)細(xì)胞因子TGF-β1、FGF、HGF、VEGF表達(dá)量顯著高于ADSCs上清液(P＜0.05)(圖7)。

圖7 比較人ADSCs和ADSCs膜片的上清液細(xì)胞因子濃度(aP＜0.05)Fig. 7 Comparison of protein levels of cytokines concentrations in cell suspension between human ADSCs cell-sheet and human ADSCs (aP＜0.05)

討 論

細(xì)胞膜片技術(shù)的發(fā)明，為組織器官的修復(fù)和再生開辟了新的治療前景。細(xì)胞膜片摒棄了傳統(tǒng)的細(xì)胞支架材料載體模式，使細(xì)胞最大限度地發(fā)揮自身特性，提高細(xì)胞的生物活性，其自身形成的細(xì)胞外基質(zhì)構(gòu)建的內(nèi)源性支架及特殊的微環(huán)境，對(duì)細(xì)胞的增殖、分化起著調(diào)節(jié)作用，從而促進(jìn)組織的修復(fù)與再生[9-10]。有文獻(xiàn)表明維生素C是細(xì)胞分泌膠原和其他所需要物質(zhì)過程中的關(guān)鍵因子，能促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的合成和分泌，并且抑制細(xì)胞分化[11]，維生素C聯(lián)合地塞米松可使誘導(dǎo)培養(yǎng)的細(xì)胞膜片韌性和支持性更好[12]。因此本實(shí)驗(yàn)在完全培養(yǎng)基中加入活性因子維生素C和地塞米松，成功將人ADSCs誘導(dǎo)成細(xì)胞膜片，其具有較好的韌性和彈性。膜片經(jīng)掃描電鏡觀察顯示其表面光滑，由多層細(xì)胞構(gòu)成，保留了細(xì)胞之間的緊密連接和細(xì)胞外基質(zhì)的自然形態(tài)，此結(jié)果與以往文獻(xiàn)報(bào)道一致[13]。雖然目前關(guān)于細(xì)胞膜片是否能夠促進(jìn)組織再生或修復(fù)及其作用機(jī)制尚未闡明[14]，但根據(jù)其自分泌形式生成的能夠刺激血管再生、減輕創(chuàng)面炎癥反應(yīng)、促進(jìn)周圍細(xì)胞增殖分化的細(xì)胞因子[15-16]，我們推測(cè)細(xì)胞膜片能夠有效促進(jìn)受損組織的再生或修復(fù)。

TGF-β是目前公認(rèn)的、最具代表性的促生長(zhǎng)細(xì)胞因子，其在組織損傷的修復(fù)和更新中起重要作用，與傷口愈合過程密切[17-18]。傷口愈合是一個(gè)復(fù)雜的生物學(xué)活動(dòng)，創(chuàng)傷發(fā)生初期，血小板釋放富含TGF-β1和VEGF進(jìn)入損傷部位，然后在TGF-β1的趨化作用下，成纖維細(xì)胞促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的合成。而膠原蛋白Ⅰ是參與創(chuàng)傷愈合過程的細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分之一，它既是細(xì)胞黏附、血管形成的主要支架和媒介，又是形成的細(xì)胞膜片的主要成分。因此，在傷口愈合的過程中，含有大量膠原蛋白Ⅰ的細(xì)胞膜片可以覆蓋傷口，發(fā)揮促進(jìn)傷口愈合的作用。VEGF和FGF2是目前已知最強(qiáng)的促細(xì)胞生成因子，F(xiàn)GF家族分子，如VEGF和FGF2，不僅能在傷口愈合中發(fā)揮重要作用，在誘導(dǎo)肉芽組織產(chǎn)生新生上皮組織和血管生成反應(yīng)中也起著協(xié)同作用，可加速傷口愈合[19-20]。HGF能使所有組織和器官的細(xì)胞恢復(fù)再生能力，從而激發(fā)細(xì)胞活力。由此可見TGF-β1、FGF、HGF、VEGF在傷口的愈合過程中相互協(xié)同，共同促進(jìn)傷口的愈合。我們的研究結(jié)果顯示，TGF-β1、FGF2、HGF、VEGF在人ADSCs膜片中的表達(dá)顯著上調(diào)，推測(cè)誘導(dǎo)產(chǎn)生的細(xì)胞膜片的修復(fù)功能強(qiáng)于單純的人ADSCs。干細(xì)胞無限增殖和多向分化潛能也對(duì)傷口良好愈合有利。研究發(fā)現(xiàn)OCT4、SOX2、NANOG是3個(gè)重要的干細(xì)全能型基因，可維持干細(xì)胞自我更新、無限增殖和多向分化潛能，可作為干細(xì)胞的表面標(biāo)記分子[21]。本實(shí)驗(yàn)qRTPCR研究結(jié)果中OCT4、NANOG在人ADSCs膜片的表達(dá)顯著上調(diào)，可進(jìn)一步推測(cè)誘導(dǎo)產(chǎn)生的細(xì)胞膜片具有較強(qiáng)的修復(fù)功能。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)將分離純化的人ADSCs成功誘導(dǎo)為ADSCs膜片，通過對(duì)ADSCs膜片形態(tài)和重要促生長(zhǎng)細(xì)胞因子及干性基因的表達(dá)水平進(jìn)行分析，我們推測(cè)誘導(dǎo)成的人ADSCs膜片具有較強(qiáng)的組織修復(fù)能力，為后續(xù)我們利用人ADSCs膜片進(jìn)行組織工程修復(fù)工作奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，提供了理論依據(jù)。

1 Rodriguez J， Boucher F， Lequeux C， et al. Intradermal injection of human adipose-derived stem cells accelerates skin wound healing in nude mice［J］. Stem Cell Res Ther， 2015， 6 ： 241.

2 Yoo JH， Shin JH， An MS， et al. Adipose-tissue-derived Stem Cells Enhance the Healing of Ischemic Colonic Anastomoses： An Experimental Study in Rats［J］. J Korean Soc Coloproctol， 2012，28（3）： 132-139.

3 Haraguchi Y， Shimizu T， Sasagawa T， et al. Fabrication of functional three-dimensional tissues by stacking cell sheets in vitro［J］. Nat Protoc， 2012， 7（5）： 850-858.

4 Zakharova L， Mastroeni D， Mutlu N， et al. Transplantation of cardiac progenitor cell sheet onto infarcted heart promotes cardiogenesis and improves function［J］. Cardiovasc Res， 2010， 87（1）： 40-49.

5 Tsumanuma Y， Iwata T， Washio K， et al. Comparison of different tissue-derived stem cell sheets for periodontal regeneration in a canine 1-wall defect model［J］. Biomaterials， 2011， 32（25）：5819-5825.

6 Ohki T， Yamato M， Ota M， et al. Application of regenerative medical technology using tissue-engineered cell sheets for endoscopic submucosal dissection of esophageal neoplasms［J］. Dig Endosc，2015， 27（2）： 182-188.

7 Li Q， Zhang A， Tao C， et al. The role of SDF-1-CXCR4/CXCR7 axis in biological behaviors of adipose tissue-derived mesenchymal stem cells in vitro［J］. Biochem Biophys Res Commun， 2013， 441（3）： 675-680.

8 MacIsaac ZM， Shang H， Agrawal H， et al. Long-term in-vivo tumorigenic assessment of human culture-expanded adipose stromal/stem cells［J］. Exp Cell Res， 2012， 318（4）： 416-423.

9 Rozario T， DeSimone DW. The extracellular matrix in development and morphogenesis： a dynamic view［J］. Dev Biol， 2010， 341（1）：126-140.

10 Kawanishi K， Nitta K. Cell sheet-based tissue engineering for mesothelial cell injury［J］. Contrib Nephrol， 2015， 185 ： 66-75.

11 Ji AR， Ku SY， Cho MS， et al. Reactive oxygen species enhance differentiation of human embryonic stem cells into mesendodermal lineage［J］. Exp Mol Med， 2010， 42（3）： 175-186.

12 Nakamura A， Akahane M， Shigematsu H， et al. Cell sheet transplantation of cultured mesenchymal stem cells enhances bone formation in a rat nonunion model［J］. Bone， 2010， 46（2）： 418-424.

13 Deries M， Gon?alves AB， Vaz R， et al. Extracellular matrix remodeling accompanies axial muscle development and morphogenesis in the mouse［J］. Dev Dyn， 2012， 241（2）： 350-364.

14 Intini G. Future approaches in periodontal regeneration： gene therapy， stem cells， and RNA interference［J］. Dent Clin North Am， 2010， 54（1）： 141-155.

15 隆艷艷， 焦順昌. mTOR抑制劑對(duì)炎癥相關(guān)細(xì)胞因子分泌的影響［J］. 解放軍醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)， 2015， 36（12）： 1252-1254.

16 Paschos NK， Brown WE， Eswaramoorthy R， et al. Advances in tissue engineering through stem cell-based co-culture［J］. J Tissue Eng Regen Med， 2015， 9（5）： 488-503.

17 寧江海， 劉洪臣， 潘和平， 等. 具有羥基磷灰石結(jié)合活性的擬TGF-β多肽分子的實(shí)驗(yàn)研究［J］. 軍醫(yī)進(jìn)修學(xué)院學(xué)報(bào)， 2002，23（2）： 101-103.

18 Pakyari M， Farrokhi A， Maharlooei MK， et al. Critical Role of Transforming Growth Factor Beta in Different Phases of Wound Healing［J］. Adv Wound Care （New Rochelle）， 2013， 2（5）：215-224.

19 梁春陽， 周定標(biāo). 頸動(dòng)脈內(nèi)膜切除術(shù)后再狹窄的相關(guān)細(xì)胞因子［J］. 軍醫(yī)進(jìn)修學(xué)院學(xué)報(bào)， 2004， 25（6）： 461-462.

20 劉镕， 趙琴平， 董惠芬， 等. TGF-β信號(hào)傳導(dǎo)通路及其生物學(xué)功能［J］. 中國(guó)病原生物學(xué)雜志， 2014， 9（1）： 77-83.

21 Pashaiasl M， Khodadadi K， Kayvanjoo AH， et al. Unravelling evolution of Nanog， the key transcription factor involved in selfrenewal of undifferentiated embryonic stem cells， by pattern recognition in nucleotide and tandem repeats characteristics［J］.Gene， 2016， 578（2）： 194-204.