止顫湯對帕金森病異動癥大鼠DARPP-32磷酸化表達(dá)的影響

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帕金森病(Parkinson’s disease，PD)是目前中老年的一種多發(fā)病，已成為繼阿爾海默茨病之后影響老年人心身健康的第二大神經(jīng)退行性功能障礙疾病[1]。目前PD的治療仍以左旋多巴為主的替代治療。但長期使用左旋多巴，會出現(xiàn)一些嚴(yán)重的并發(fā)癥，其中最為突出的是異動癥(LID)，異動癥是一種舞蹈樣、手足徐動樣或簡單重復(fù)的不自主動作，很多中晚期病人因此致殘[2]。

PD運(yùn)動并發(fā)癥是臨床上的工作難點(diǎn)，目前未有臨床上廣泛推廣的治療藥物及技術(shù)，主要以減量外源性多巴胺攝入為主，但這樣可能加重PD 癥狀。故中醫(yī)藥治療異動癥是一個很好的切入點(diǎn)。止顫湯治療異動癥有很好的療效，但其作用機(jī)制尚不明確。目前研究發(fā)現(xiàn)，紋狀體黑質(zhì)投射神經(jīng)元內(nèi)紋狀體環(huán)磷酸腺苷(cAMP)依賴性蛋白激酶(PKA)通路和其下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白多巴胺和環(huán)磷腺苷調(diào)節(jié)的磷酸化蛋白-32(DARPP-32)的蛋白Thr34位點(diǎn)磷酸化表達(dá)改變可能參與了異動癥的發(fā)病[3-4]。故本課題擬采用中藥止顫湯治療異動癥大鼠，觀察大鼠異常不自主行為及紋狀體DARPP-32(Thr34)磷酸化表達(dá)的影響，旨在探討其治療LID的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 成年雄性SD大鼠50只，體質(zhì)量180 g～220 g，經(jīng)反復(fù)行為檢測確認(rèn)無旋轉(zhuǎn)行為。

1.2 藥物配制 止顫湯為上海市中醫(yī)醫(yī)院名老中醫(yī)李如奎教授經(jīng)驗(yàn)方，中劑量藥物：黃芪15 g，丹參9 g，鉤藤18 g，知母12 g，白芍12 g，制大黃15 g，升麻9 g組成，水煎濃縮至每毫升含生藥1.28 g。大、小劑量藥物分別為在中劑量基礎(chǔ)上增減20%，儲存于冰箱備用。

1.3 方法

1.3.1 LID大鼠模型制備 利用6-羥基多巴胺(6-OHDA)制備PD模型大鼠[5]，2周后進(jìn)行行為學(xué)觀察：按0.5 mg/kg腹腔注射阿撲嗎啡，記錄1 h內(nèi)大鼠旋轉(zhuǎn)總?cè)?shù)，大于100圈即為PD模型制作成功。同時隨機(jī)選取6只大鼠用生理鹽水代替6-OHDA 注射作為正常組(假手術(shù)組)。將左旋多巴和芐絲肼溶于含0.2% 維生素C的消毒生理鹽水中，使左旋多巴終濃度為10 mg/mL，芐絲肼為2.5 mg/mL。3周后對造模成功的PD大鼠腹腔注射左旋多巴甲酯(50 mg/kg)/芐絲肼(12.5 mg/kg)4周，每日兩次(09：00與17：00)，制備LID大鼠模型[6]。隨機(jī)將LID模型分為：模型組、西藥組、中藥小劑量組、中藥中劑量組、中藥大劑量組，每組6只。模型組大鼠給予腹腔注射含0.2% 維生素C的消毒生理鹽水，持續(xù)29 d；西藥組為腹腔注射左旋多巴甲酯/芐絲肼，每日兩次(09：00與17：00)，持續(xù)29 d；中藥小劑量組、中藥中劑量組、中藥大劑量組在給予左旋多巴甲酯/芐絲肼的基礎(chǔ)上分別加用止顫湯灌胃，1次/日，持續(xù)29 d，每次灌胃量為9 mL/kg。于治療第8天、第15天、第22天、第29天上午用藥后進(jìn)行大鼠異常不自主運(yùn)動(AIM)評分。

1.4 測試指標(biāo)

1.4.1 AIM評分測定 各組大鼠于治療期間每周進(jìn)行1次AIM評分[7]，每次評定結(jié)果由經(jīng)用藥后每間隔30 min的AIM總分組成，每次連續(xù)評定4組數(shù)據(jù)(持續(xù)120 min)，共有5組數(shù)據(jù)，5組數(shù)據(jù)之和為該次評定結(jié)果。將AIM分為4個部分(前肢、口面部、軸性及運(yùn)動)進(jìn)行評定，每部分又根據(jù)其有或無及嚴(yán)重程度劃分為5個等級(0分～4分)：0分，無；1分，偶爾出現(xiàn)，出現(xiàn)時間少于觀察期的一半；2分，經(jīng)常出現(xiàn)，出現(xiàn)時間大于觀察期的一半；3分，整個觀察期內(nèi)持續(xù)存在，但觸覺刺激可使之停止；4分，整個觀察期內(nèi)持續(xù)存在，刺激不能使之停止。理論上1只大鼠1次用藥后最大評分為64分。

1.4.2 免疫印跡檢測 樣本變性后加入1倍體積的2×SDS上樣緩沖液，沸水浴5 min，置冰上，檢測蛋白表達(dá)，以目的條帶與β-actin比值表示各組蛋白表達(dá)水平。結(jié)束注射后3 h，快速分離雙側(cè)紋狀體，每10 mg組織加入100 μL蛋白裂解液RIPA和1 μL蛋白酶抑制劑PMSF，超聲裂解，提取總蛋白。測定蛋白濃度后于-80 ℃保存。上樣前煮沸3 min，取20 μg樣本經(jīng)10%SDS一聚丙烯酰胺凝膠電泳后，電轉(zhuǎn)移至二氟化樹(PVDF)膜，用5% BSA溶液室溫孵育，TBST洗脫；加入一抗溶液，4 ℃孵育過夜；TBST沖洗，加HRP標(biāo)記的二抗以結(jié)合一抗及HRP標(biāo)記的抗生物素抗體，37 ℃孵育1 h；TBST沖洗，將膜置于反應(yīng)液中室溫孵育5 min。去除過量的溶液，將膜夾在兩塑料薄膜之間，以X光膠片曝光。Western blot圖像采用ImageJ圖像分析軟件計算各樣本目的與β-actin比值表示各組蛋白表達(dá)水平。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠AIM評分比較 干預(yù)后第8天、第15天、第22天各組大鼠AIM 評分差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，第29天，中藥小劑量組AIM 評分與西藥組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，中藥大劑量組、中藥中劑量組AIM 評分較小劑量組明顯降低(P<0.01)，中劑量組AIM 評分與大劑量組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。詳見表1。

2.2 免疫印跡 模型組大鼠磷酸化DARPP-32(THr34)的灰度值為(2.69±0.22)×106，較正常組灰度值(1.04±0.15)× 106增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；西藥組磷酸化DARPP-32(THr34)灰度值為(2.67±0.24)×106，與模型組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。中藥大、中、小劑量組大鼠紋狀體磷酸化DARPP-32(THr34)灰度值分別為(1.40±0.09)×106、1.69±0.09)×106、(2.25±0.12)×106，與西藥組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。中藥中劑量組磷酸化DARPP-32(THr34)的灰度值與中藥大劑量組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，而中藥中劑量組、中藥大劑量組磷酸化DARPP-32(THr34)的灰度值較中藥小劑量組降低(P<0.05)。詳見圖1。

3 討 論

帕金森病的患病率隨年齡增長而逐漸增高，其病理改變主要出現(xiàn)在黑質(zhì)紋狀體系統(tǒng)，為黑質(zhì)多巴胺神經(jīng)元變性引起的黑質(zhì)紋狀體系統(tǒng)多巴胺遞質(zhì)含量顯著減少[8]。而左旋多巴作為多巴胺的前體，通過代謝成為多巴胺進(jìn)行補(bǔ)充來減輕帕金森病的癥狀，因此迄今為止，左旋多巴一直是PD的基礎(chǔ)藥物，也是判斷治療PD療效的“金標(biāo)準(zhǔn)”。但隨著左旋多巴的長期使用，50%～80%的PD病人逐漸出現(xiàn)療效減退及運(yùn)動并發(fā)癥等不良反應(yīng)，其中最為突出的運(yùn)動并發(fā)癥是異動癥[9]，很多中晚期病人因此致殘，不僅影響左旋多巴的臨床價值，而且嚴(yán)重影響病人的生活質(zhì)量。

異動癥的發(fā)病機(jī)制是由于疾病的進(jìn)展，黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元進(jìn)行性丟失，導(dǎo)致多巴胺能神經(jīng)元突起減少，多巴胺能神經(jīng)元釋放、存儲多巴胺的調(diào)節(jié)能力下降，對外源性左旋多巴藥物的緩沖能力降低。服用半衰期較短的外源性左旋多巴藥物，更易造成對紋狀體棘狀神經(jīng)元上多巴胺受體形成異常的波動性刺激，使本已失衡的多巴胺能環(huán)路更加異常，從而引起直接和間接紋狀體輸出通路的失衡，這可能是異動癥產(chǎn)生的主要病理機(jī)制[10-11]。近年研究表明LID的發(fā)生與表達(dá)D1受體的直接通路及其下游cAMP依賴性蛋白激酶(PKA)等信號傳導(dǎo)通路的激活關(guān)系密切[12-13]。DARPP-32是直接通路上信號傳導(dǎo)的重要物質(zhì)，大量集中于紋狀體區(qū)，直接參與并調(diào)控直接通路的活化程度[14-15]。眾多實(shí)驗(yàn)也表明，LID大鼠紋狀體內(nèi)DARPP-32的Thr-34位點(diǎn)的磷酸化水平增高，可能造成了直接通路過度活化，引起直接、間接通路的平衡失調(diào)及清除異常運(yùn)動信息的功能被破壞，最終導(dǎo)致LID 的發(fā)生[16]。

而隨著PD發(fā)病率的增加，中醫(yī)藥治療PD日益受到重視。根據(jù)臨床表現(xiàn)和體征，PD屬于中醫(yī)“顫證”范疇[17]。《素問·至真要大論篇》曰：“諸風(fēng)掉眩，皆屬于肝”?！端貑枴の宄Ｕ笳摗贰捌洳u動”“掉眩巔疾”，這些論述均說明“掉”表現(xiàn)為搖動之象。此類疾病屬風(fēng)象，與肝有關(guān)。明代醫(yī)家孫一奎在《赤水玄珠》中指出：“此病壯年鮮有，中年以后乃有之，老年尤多，夫年老陰血不足，少水不能制腎火，極為難治”。其病機(jī)通常認(rèn)為是本虛標(biāo)實(shí)。本虛是指肝腎精血不足與氣血虧虛，標(biāo)實(shí)常指痰熱夾風(fēng)陽為患。其病位在腦，與肝、脾、腎三臟有關(guān)。蓋肝為風(fēng)木之臟，以血為體，以氣為用，肝血不足則筋失柔潤。腎主骨生髓，腎精不足，髓海不充；腎陰虧虛，水不涵木，虛風(fēng)內(nèi)動，四肢震顫，經(jīng)謂風(fēng)淫末疾也。氣血兩虛，筋脈失于濡養(yǎng)，為之振搖；且滋水涵木，濡血柔肝，佐金制木，培土養(yǎng)肝，皆有賴于益氣養(yǎng)血，滋其化源。止顫湯即以此立意，并結(jié)合現(xiàn)代研究，注重清熱瀉火，升清降濁。本課題選用的中藥止顫湯劑，是我科上海市名老中醫(yī)李如奎教授結(jié)合多年治療PD的經(jīng)驗(yàn)，經(jīng)過探索篩選研制所得，在我科近幾十年的臨床上運(yùn)用于帕金森病及異動癥病人頗有療效[18]，并在李如奎教授的指導(dǎo)下，科內(nèi)已有國家及地方各級課題和多篇論文[19]提示止顫湯對于帕金森病大鼠模型有治療作用，并成功制作PD大鼠模型及LID大鼠模型，該研究將止顫湯應(yīng)用于LID大鼠，旨在進(jìn)一步探索該藥的作用機(jī)制。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在早期止顫湯對于LID大鼠的AIM評分效果不明顯，在中后期，中藥小劑量組同樣效果不明顯，而中藥中、大劑量組可減輕LID大鼠AIM評分，總的來說，止顫湯可以緩解LID大鼠不自主運(yùn)動行為。

對紋狀體磷酸化DARPP-32(THr-34)表達(dá)的研究表明，LID大鼠DARPP-32(THr34)磷酸化的程度較正常組明顯升高，西藥組DARPP-32(THr34)磷酸化與模型組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。而中藥組治療后降低了THr-34磷酸化的表達(dá)，其中中藥中、大劑量作用明顯，起到改善LID的目的，從而表明，LID時DARPP-32(THr34)表達(dá)增加，且它的變化水平與LID發(fā)展趨勢相關(guān)。DARPP-32的Thr34位點(diǎn)磷酸化后成為蛋白磷酸酶1(PP-1)的高效抑制劑，后者可以調(diào)控神經(jīng)元許多磷酸蛋白的磷酸化狀態(tài)，從而激活直接通路，引發(fā)LID。而中藥的治療可改善磷酸化DARPP-32(THr34)的表達(dá)，抑制PKA通路的過度活化，緩解LID的進(jìn)一步加重。

綜上所述，PD病人經(jīng)長期反復(fù)左旋多巴治療波動性刺激多巴胺D1受體，從而選擇性異?；罨苯油?，使基底節(jié)環(huán)路失衡進(jìn)而引起LID的形成，其中DARPP-32(THr34)水平的變化是直接通路過度活化的關(guān)鍵因素。因此通過調(diào)控DARPP-32的磷酸化狀態(tài)或拮抗直接通路活性，逆轉(zhuǎn)通路活動失衡有可能阻抑LID的發(fā)生。

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