豬肺炎支原體不同毒力菌株對豬氣管上皮3D細胞的損傷差異與機制分析

馮艷艷，王海燕，劉蓓蓓，韋艷娜，張珍珍，白 昀，倪 博，邵國青，雷治海，馮志新*

(1. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，南京 210095；2. 江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所·農(nóng)業(yè)部獸用生物制品工程技術(shù)重點實驗室，南京210014)

豬支原體肺炎(Mycoplasmal pneumonia of swine，MPS)是由豬肺炎支原體(Mycoplasmahyopneumoniae，Mhp)引起的一種慢性接觸性呼吸道病。MPS世界性流行，發(fā)病率高，并常誘發(fā)其他病原的感染引起死亡，給現(xiàn)代養(yǎng)豬業(yè)造成巨大損失[1]。研究發(fā)現(xiàn)，Mhp對豬氣管上皮細胞表面纖毛的黏附作用是侵襲宿主呼吸道的關(guān)鍵步驟，決定了支原體的致病性[2-3]，因此眾多的文獻通過豬氣管上皮細胞(swine tracheal epithelial cells，STEC)模型探究Mhp的致病機制，但傳統(tǒng)STEC都是通過浸沒培養(yǎng)，無論是傳代的細胞系還是原代分離的細胞均只能單層生長，無法分化形成原代細胞在體內(nèi)生長條件下的假復(fù)層纖毛柱狀上皮形狀和功能[4]；因此，建立一種盡可能接近體內(nèi)生長方式的細胞培養(yǎng)模型以研究Mhp的感染及與宿主互作關(guān)系尤為重要。

近年來有學(xué)者利用氣液交界面(air-liquid interface，ALI)培養(yǎng)模型研究人呼吸道上皮抗感染防御機制已取得重大突破[5-7]，本研究借鑒人呼吸道上皮細胞ALI培養(yǎng)技術(shù)經(jīng)驗，建立及優(yōu)化豬氣管上皮傳代細胞系的3D培養(yǎng)模型，分別將不同毒力的Mhp菌株感染豬氣管上皮細胞，從細胞生長特性、活性和功能等方面比較Mhp強弱毒株的損傷差異及可能機制，為深入探究Mhp的致病機制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

RPMI-1640購自維森特生物技術(shù)有限公司，血清購自Gbico公司；人胎盤膠原Ⅳ購自Sigma公司；LPS購自Sigma公司；Alamar Blue、Hoechst 33342染液購自上海翊圣生物有限公司；NAC抗氧化劑、NO檢測試劑盒、乳酸脫氫酶細胞毒性檢測試劑盒購自碧云天生物技術(shù)有限公司；活性氧檢測試劑盒購自南京凱基生物有限公司；CFDA-SE細胞增殖示蹤熒光探針購自碧云天生物技術(shù)有限公司；黏液蛋白MUC5B一抗購自Santa Cruze；Cy3標記的兔多抗IgG購自碧云天生物技術(shù)有限公司；3470(Cat#)Transwell?通透性嵌套購自Costar。

1.2 菌體、細胞

豬肺炎支原體強毒菌株NJ株、中等毒力菌株AH株、弱毒菌株168L株由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所分離保存，各菌株毒力經(jīng)豬體試驗測定；STEC傳代細胞系購自上海撫生實業(yè)有限公司。

1.3 傳代STEC細胞ALI培養(yǎng)模型

將生長于含10%胎牛血清RPMI-1640培養(yǎng)基中的STEC傳代細胞以105·mL-1的濃度接種于膠原包被的24孔Transwell中，每孔接種250 μL，Transwell下層加800 μL細胞培養(yǎng)液，在37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，以后每天吸棄從下層小室滲透到支持膜表面液體，直到觀察發(fā)現(xiàn)細胞長滿單層、支持膜表面保持可見的干燥，則說明已形成氣液交界面，繼續(xù)培養(yǎng)5 d后用2.5%戊二醛固定部分細胞，通過掃描電鏡觀察纖毛分化情況。待纖毛分化成功后，可用于感染試驗。

1.4 Mhp感染ALI細胞

分別將Mhp 168L株、NJ株和AH株接種于KM2培養(yǎng)基中，以1∶10復(fù)壯，待菌液培養(yǎng)至對數(shù)生長期備用。將各菌液以12 000 r·min-1，離心20 min，菌體沉淀用PBS洗滌一次，用無血清的RPMI-1640培養(yǎng)液重懸，調(diào)整滴度為107CCU·mL-1，分別以200 μL·孔-1接種于上層小室中已分化的細胞單層，分別標記為168L組、NJ組、AH組；設(shè)置陰性對照，接種等體積無血清的RPMI-1640培養(yǎng)液；設(shè)置陽性對照，接種用等體積無血清RPMI-1640培養(yǎng)液稀釋的10 μg·mL-1的LPS，放入37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中孵育培養(yǎng)。

為了鑒定Mhp菌株的感染情況，在感染前按文獻報道的方法[8]，每管菌株中各加10 μL 10 mmol·L-1的CFDA-SE染液， 放入37 ℃ 200 r·min-1搖床中孵育15 min，進行標記。感染48 h后，用PBS洗滌細胞面3遍，在上層小室中加入100 μL配制好的Hoechst 33342染液標記細胞。用一次性刀片將Transwell insert的支持膜切下，放到載玻片上，用10%甘油封片，于Zeiss Lsm 710激光掃描共聚焦下進行斷層掃描鑒定；另外用2.5%戊二醛固定各感染組細胞，通過掃描電鏡觀察其纖毛生長情況。

1.5 NAC抗氧化劑處理

分別取陰性對照和各感染組的其中三孔細胞，在其Transwell下層各加含終濃度為10 mmol·L-1NAC的新鮮培養(yǎng)液，之后放入37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中孵育培養(yǎng)。

1.6 細胞生長特性檢測

分別取Mhp各感染組的細胞，在上層小室中加PBS 洗三遍，用Millicell ERS-2 電壓計測量Transwell Inserts上下兩側(cè)上皮細胞間的測膜電阻TEER。

1.7 細胞活性檢測

1.7.1 Alamar Blue檢測法 分別取各感染組細胞，在各孔Transwell上下層各加入含10% Alamar Blue的RPMI-1640，在培養(yǎng)箱孵育2～4 h，吸取各孔上層所有液體至新的96孔板中，在激發(fā)光波長為560 nm，發(fā)射光波長為590 nm的熒光分光光度計上檢測。

1.7.2 乳酸脫氫酶(LDH)釋放檢測法 分別取各感染組Transwell上層液體，按照LDH釋放檢測試劑盒說明書進行檢測。

1.8 細胞黏液分泌檢測

在各感染組Transwell上層加入4%的多聚甲醛固定20 min，加入1∶200稀釋的anti-MUC5B抗體，4 ℃孵育過夜，第二天加入1∶300稀釋的Cy3標記的兔多抗IgG抗體，37 ℃培養(yǎng)箱孵育1 h后，DAPI避光染色，用一次性刀片將Transwell insert的支持膜切下，放到載玻片上，用10%甘油封片，于Zeiss Lsm 710激光掃描共聚焦下進行斷層掃描鑒定；之后將Transwell insert的支持膜放到96孔板中，使用550 nm激發(fā)波長，570 nm發(fā)射波長，檢測各組熒光強度。

1.9 細胞氧化應(yīng)激檢測

1.9.1 細胞NO釋放檢測 分別取各感染組Transwell上層液體，按照NO檢測試劑盒說明書進行檢測。

1.9.2 細胞內(nèi)源性ROS 檢測 按活性氧檢測試劑盒說明書，在各感染組Transwell上層加DCFH-DA熒光探針，培養(yǎng)箱中作用20 min，RPMI-1640洗去未結(jié)合的游離探針，設(shè)置陽性對照組，使用488 nm激發(fā)波長，525 nm發(fā)射波長，檢測各組熒光強度。

1.10 統(tǒng)計分析

各試驗組檢測數(shù)據(jù)使用SPSS軟件進行One-way ANOVA與Two-way ANOVA方差分析，并用GraphPad Prism 5軟件制圖。

2 結(jié) 果

2.1 傳代STEC細胞ALI培養(yǎng)模型的建立

在ALI培養(yǎng)第5 天時，STEC表面有豐富的類似微絨毛結(jié)構(gòu)分化，且分化數(shù)量多，生長旺盛，表示細胞分化狀態(tài)正常，可用于感染試驗(圖1)。

2.2 Mhp感染STEC細胞的檢測

在感染48 h后，激光共聚焦檢測各組Mhp感染情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Mhp 168L株、NJ株和AH株均能成功黏附STEC表面(圖2)。

2.3 掃描電鏡觀察細胞形態(tài)

在感染48 h后，掃描電鏡觀察各感染組STEC表面纖毛生長情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，168L株、AH株和NJ株感染組細胞表面的纖毛上均有球狀黏附物，且各組纖毛生長狀態(tài)存在明顯差異，與對照組相比，弱毒株168L株組纖毛上有散在的球狀黏附物，纖毛狀態(tài)與對照組差異不大；中等毒力AH株組纖毛上球狀黏附物數(shù)量增多，纖毛有明顯的變粗、破損和脫落現(xiàn)象；強毒株NJ株組纖毛上出現(xiàn)聚堆的球狀黏附物，纖毛發(fā)生嚴重的破損和脫落現(xiàn)象(圖3)。

圖1 ALI培養(yǎng)第5天的STEC掃描電鏡結(jié)果Fig.1 The STEC scans by ALI in the fifth day

A. Control組；B. Mhp 168L株感染組；C. Mhp AH株感染組；D. Mhp NJ株感染組A. Control group; B. Mhp 168L strains infected group; C. Mhp AH strain infected group; D. Mhp NJ strain infected group圖2 不同毒力組Mhp與STEC的黏附作用(48 h)Fig.2 The adherence of Mhp with different virulence to STEC cells (48 h)

A. Control組；B. Mhp 168L株感染組；C. Mhp AH株感染組；D. Mhp NJ株感染組A. Control group; B. Mhp 168L strains infected group; C. Mhp AH strain infected group; D. Mhp NJ strain infected group圖3 不同毒力Mhp感染48 h后STEC纖毛生長情況Fig.3 Cilia of STEC infected by Mhp with different virulence at 48 h

2.4 感染細胞生長特性檢測

TEER值能準確地反映細胞間緊密連接狀態(tài)，從而指示細胞的生長特性。在感染后48 h，檢測各組跨細胞膜電阻，發(fā)現(xiàn)與陰性對照組相比，各感染組細胞的電阻值均出現(xiàn)了不同程度的下降，其中弱毒株168L株感染組下降程度最小，平均電阻值為113.8 Ω，對細胞生長的抑制較??；而中等毒力AH株和強毒株NJ株感染組下降程度依次變大，平均電阻值僅為84.5和72.9 Ω，對細胞生長的抑制率也依次升高；與陽性對照組相比，168L株與AH株感染組差異均顯著(P<0.05)，而NJ株感染組與陽性對照組差異不顯著(P>0.05)；各感染組之間，168L株與AH株、NJ株組相比差異性均顯著(P<0.05)(圖4)。

2.5 感染細胞活性檢測

各組間相同字母代表差異不顯著，不同字母代表差異顯著(P<0.05). 下表同Columns with the same letters represent no significant difference, without the same superscripts are significantly different (P<0.05). The same as below圖4 不同毒力Mhp感染48 h STEC的電阻值Fig.4 TEER of STEC infected by Mhp with different virulence at 48 h

2.5.1 Alamar Blue檢測 通過Alamar Blue法檢測了不同毒力Mhp菌株對STEC活細胞代謝的抑制率，在感染后24、36、48 h，檢測各組細胞Alamar Blue還原率，發(fā)現(xiàn)隨著感染時間的延長，弱毒株168L株感染組細胞Alamar Blue還原率幾乎沒有下降，一直穩(wěn)定在60%左右，各時間點差異不顯著(P>0.05)，對STEC活細胞代謝的抑制率較低，對細胞活性影響較??；而中等毒力AH株和強毒株NJ株感染組細胞Alamar Blue還原率下降明顯，在48 h時下降幅度最大，分別下降至48%和46%，對STEC活細胞代謝的抑制率依次上升，顯著降低細胞活性；而且在感染后48 h，與陽性對照組相比，NJ株、AH株組差異不顯著(P>0.05)，而168L株組與陽性對照組、AH株、NJ株組之間差異均顯著(P<0.05)(圖5)。

圖5 不同毒力的Mhp感染STEC不同時間Alamar Blue還原率Fig.5 Alamar Blue reduction rate of STEC infected by Mhp with different virulence at different time

2.5.2 LDH釋放檢測 在感染后48 h，通過LDH釋放檢測各組細胞死亡率，發(fā)現(xiàn)與陰性對照組相比，各感染組細胞的細胞死亡率均出現(xiàn)了不同程度的升高，其中弱毒株168L株感染組細胞的死亡率最低，平均死亡率僅比陰性對照組升高4.2%，而中等毒力AH株和強毒株NJ株感染組細胞死亡率依次升高，比陰性對照組升高21.8%和51.0%；與陽性對照組相比，168L株、AH株組差異顯著(P<0.05)，而NJ株差異不顯著(P>0.05)(圖6)。

圖6 不同毒力Mhp感染48 h STEC的細胞死亡率Fig.6 Cell mortality rate of STEC infected by Mhp with different virulence at 48 h

2.6 感染細胞黏液分析檢測

在感染48 h后，通過激光共聚焦檢測各組MUC5B黏液蛋白分泌情況，發(fā)現(xiàn)與陰性對照組相比，弱毒株168L株感染組差異不顯著(P>0.05)，而中等毒力AH株和強毒株NJ株感染組黏液蛋白分泌量顯著上調(diào)，平均熒光強度值較陰性對照組分別升高了126.3和133.3，差異顯著(P<0.05)；與陽性對照組相比，168L株、AH株和NJ株組差異性均顯著(P<0.05)；各感染組之間，AH株和NJ株差異性不顯著(P>0.05)(圖7)。

A1～A3. 陰性對照；B1-B3. Mhp 168L株；C1～C3. Mhp AH株；D1～D3. Mhp NJ株；E1～E3. 陽性對照(LPS)；1. 細胞核DAPI染色；2. MUC5B蛋白Cy3熒光檢測；3. 1、2合并圖;F.黏液蛋白MUC5B熒光強度A1-A3. Negative group; B1-B3. Mhp 168L strains; C1-C3. Mhp AH strains D1-D3. Mhp NJ strains; E1-E3. Control group (LPS treated); 1. DAPI dyeing for cell nucleus；2. Cy3 fluorescence for MUC5B；3. Merged 1 & 2;F.Fluorescence intensity of MUC5B圖7 不同毒力Mhp感染STEC黏液蛋白MUC5B分泌情況及熒光強度(48 h)Fig.7 The production situation and fluorescence intensity of MUC5B of STEC infected by Mhp with different virulence (48 h)

2.7 感染細胞氧化應(yīng)激檢測

2.7.1 NO釋放檢測 在感染后24、36、48 h，分別檢測各感染組細胞NO釋放，發(fā)現(xiàn)隨著感染時間的延長，弱毒株168L株和中等毒力AH株感染組與陰性對照組中細胞NO釋放變化較少，刺激細胞產(chǎn)生含氮自由基的能力較弱，而NJ株感染組細胞NO釋放變化較大，且逐步上升，在感染后48 h，強毒株NJ株感染組細胞NO釋放上升至最高，均值達到16 μmol·L-1，能刺激細胞產(chǎn)生較高水平的含氮自由基。感染各時間點，168L株感染組與陰性對照組相比差異均不顯著(P>0.05)，而AH株組與NJ株組在各時間點與陰性對照組相比均差異顯著(P<0.05)。在感染后48 h，NJ株感染組釋放的NO量與陽性對照組相比差異已不顯著(P>0.05)(圖8)。

圖8 不同毒力的Mhp感染STEC不同時間NO濃度Fig.8 NO concentration of STEC infected by Mhp with different virulence at different time

2.7.2 細胞內(nèi)源性ROS檢測 在感染后48 h，檢測各感染組反映ROS釋放水平的細胞DCF熒光強度，發(fā)現(xiàn)與陰性對照組相比，弱毒株168L株感染組ROS釋放水平差異不顯著(P>0.05)，刺激細胞產(chǎn)生活性氧的能力較弱，而中等毒力AH株和強毒株NJ株感染組與陰性對照組相比差異顯著(P<0.05)，平均細胞DCF熒光強度分別升高了90.6和775.3，刺激細胞產(chǎn)生活性氧的水平依次升高；NJ株感染組刺激細胞釋放ROS的量最高，與陽性對照組差異已不顯著(P>0.05)(圖9)。

2.8 NAC抗氧化劑對各感染組細胞損傷的影響

圖9 不同毒力Mhp感染48 h STEC的 DCF熒光強度Fig.9 DCF model fluorescence intensity of STEC infected by Mhp with different virulence at 48 h

NAC抗氧化劑處理各組后，在感染后48 h，發(fā)現(xiàn)對照組的NAC處理孔與未處理孔相比，其細胞活性(Alamar Blue法)、電阻值和黏液分泌均沒有顯著變化，說明NAC抗氧化劑對STEC細胞的生長特性、活性與功能無影響；而各感染組的NAC處理孔與未處理孔相比，內(nèi)源性ROS產(chǎn)生水平與對照組的百分比均有所下降(7.8%～58.3%)，且隨著感染菌株毒力增加，下降幅度增大，其中弱毒株168L株組的下降水平最低，且與對照組相比，差異不顯著；各感染組的NAC處理孔與未處理孔相比，細胞跨膜電阻值與對照組的百分比均有顯著上升(3.6%～22.4%)，且隨著感染菌株毒力增加，上升幅度增大；各感染組的NAC處理孔與未處理孔相比，MUC5B黏液蛋白分泌量與對照組的百分比均有顯著下降(7.6%～74.7%)，且隨著感染菌株毒力增加，下降幅度增大；各感染組的NAC處理孔與未處理孔相比，其細胞活性(Alamar Blue法)與對照組的百分比均有顯著提高(3.7%～12.3%)，且隨著感染菌株毒力增加，提高幅度增大。

NAC處理后，不同毒力Mhp菌株感染組對STEC在跨膜電阻、細胞代謝、黏液分泌功能方面的影響均有不同程度的恢復(fù)，且菌株毒力越強，NAC添加后的恢復(fù)作用越明顯(圖10)。

圖10 NAC抗氧化劑對不同毒力Mhp感染48 h STEC損傷的影響Fig.10 Effects of NAC antioxidants on the damage of STEC infected by Mhp with different virulence at 48 h

3 討 論

豬肺炎支原體黏附并定植到豬呼吸道纖毛上皮是感染和發(fā)生致病作用的關(guān)鍵階段[9]，但前期研究中選用的體外感染模型均為浸沒培養(yǎng)的原代細胞或細胞系，非呼吸道靶細胞或非分化出纖毛的呼吸道上皮細胞的選用，無法模擬Mhp在體內(nèi)感染的真實狀態(tài)，影響Mhp感染與致病機制的準確評價[10-11]。氣液界面(ALI)培養(yǎng)技術(shù)將細胞生長于兩相介質(zhì)上，真實模擬體內(nèi)呼吸道或消化道的管腔結(jié)構(gòu)。對于呼吸道上皮細胞，有助于細胞立體結(jié)構(gòu)的形成和纖毛及微絨毛的分化，同時具有黏液分泌等細胞功能[12]。因此，本研究通過建立傳代STEC 3D細胞模型以及基于此細胞的Mhp侵染模型，更真實地模擬了Mhp與豬呼吸道纖毛的結(jié)合過程，為支原體的增殖培養(yǎng)和研究菌體與細胞互作開辟新途徑。

本研究分別從細胞形態(tài)、細胞生長特性、細胞活性和細胞黏液分泌功能方面比較和分析Mhp強弱毒株對STEC的致病性差異。掃描電鏡觀察感染不同毒力Mhp菌株的STEC細胞表面纖毛狀態(tài)，直觀體現(xiàn)了各菌株毒力的差異，證實了各菌株的毒力與纖毛細胞損傷的相關(guān)性。緊密連接是宿主黏膜屏障的重要組成部分，是黏膜上皮細胞選擇性通透作用的物質(zhì)基礎(chǔ)。研究表明，3D細胞的跨膜電阻值TEER能反映細胞間緊密連接形成情況和生長特性，其電阻值越低，緊密連接的完整性和生長特性越差[12-14]。本試驗結(jié)果顯示，感染后48 h，對照組和Mhp 168L組緊密連接和生長特性良好，而AH和NJ組緊密連接被破壞，生長被抑制。這表明Mhp對STEC的生長存在抑制作用，且其抑制作用的程度與菌株的毒力呈正相關(guān)。在此基礎(chǔ)上，我們又選用Alamar Blue和LDH釋放檢測兩種方法測定STEC活性。Alamar Blue是一種反映活細胞代謝能力[15]，且在3D細胞上常用的細胞活性測定方法[16-17]，LDH釋放檢測則是從細胞膜完整性方面測定細胞活性[17-18]，我們前期的研究結(jié)果表明，Mhp感染有可能會導(dǎo)致細胞膜完整性的破壞[19]。因此，本研究采用以上兩種細胞活性檢測方法來評價Mhp感染影響細胞活性的情況，并分析導(dǎo)致細胞活性損傷的可能方式。結(jié)果表明，Mhp強毒的感染不僅破壞了細胞膜的完整性，同時也降低了細胞的代謝與增殖能力，這種破壞能力同樣與菌株的毒力呈正相關(guān)。ALI培養(yǎng)與浸沒培養(yǎng)的STEC相比，ALI培養(yǎng)的STEC能分泌多種黏液蛋白，如MUC5B、MUC5AC和MUC4等，更接近于體內(nèi)氣管的生理功能[12,20]，有研究表明，人肺炎支原體感染，會導(dǎo)致黏液過量分泌，支原體損傷程度越大，黏液分泌量越高，因此黏液分泌過量也是疾病惡化的反映[21]。本試驗通過不同毒力的Mhp感染傳代STEC 3D細胞，比較各感染組黏液分泌量差異，結(jié)果表明，Mhp感染顯著上調(diào)黏液分泌量，其中NJ株黏液分泌量極顯著高于AH株，AH株極顯著高于168L株，也同樣驗證了Mhp菌株毒力越強，刺激感染細胞分泌黏液的量越高，越可能容易引起肺炎病變的惡化。

本研究結(jié)果驗證了Mhp感染會導(dǎo)致分化的STEC細胞活性降低，生長受到抑制以及黏液分泌量上調(diào)，且與菌株的毒力強弱呈正相關(guān)。在Mhp可能的致病機制方面，我們前期研究在浸沒培養(yǎng)細胞模型上，從細胞氧化系統(tǒng)角度進行探索，初步發(fā)現(xiàn)了Mhp強弱毒株體外感染氣管上皮細胞后可產(chǎn)生氧化損傷及相關(guān)蛋白的表達差異[22-23]。本研究在3D細胞模型上驗證細胞氧化損傷與Mhp感染致病的相關(guān)性，首先通過測定細胞NO和ROS分泌量，研究結(jié)果表明Mhp感染后可刺激宿主細胞產(chǎn)生過量的活性氧自由基與活性氮自由基，且產(chǎn)生量與Mhp毒力呈正相關(guān)[24]；另外應(yīng)用NAC抗氧化劑處理Mhp感染組，發(fā)現(xiàn)NAC處理后，不同毒力Mhp菌株感染組的ROS和黏液分泌量均顯著降低，細胞活性和電阻值均顯著升高，其變化水平與菌株的毒力呈正相關(guān)。這表明NAC可通過降低細胞內(nèi)源性ROS分泌量，從而降低Mhp菌株對各感染組細胞形態(tài)、細胞活性以及細胞黏液分泌方面的損傷，而且菌株毒力越強，NAC的抑制作用越明顯，進一步論證了該氧化應(yīng)激與后續(xù)形成的細胞活性與功能損傷密切相關(guān)[ 25]。但同時也發(fā)現(xiàn)，在細胞活性的檢測中，NAC氧化抑制劑的加入并不能完全恢復(fù)感染組細胞的代謝能力，說明Mhp感染引起細胞代謝能力的下調(diào)還受其他主要因素的影響。

4 結(jié) 論

通過更接近體內(nèi)環(huán)境的豬氣管上皮3D分化細胞感染模型證明，Mhp感染可影響宿主細胞的生長特性、活性與功能，損傷分化的纖毛，其損傷的能力與菌株毒力呈正相關(guān)；而這種損傷機制與Mhp菌株引起感染細胞氧化應(yīng)激的能力密切相關(guān)。

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