反相高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定茶堿和多索茶堿的血藥濃度

趙瑞柯+曹俊華

[摘要]目的 建立反相高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定血漿中茶堿和多索茶堿的濃度。方法 色譜柱為Phenomenex C18 柱（250 mm× 4.6 mm，5 μm），流動(dòng)相為甲醇∶水（30∶70）；流速為1 ml/min；檢測(cè)波長為273 nm，內(nèi)標(biāo)為咖啡因。結(jié)果 茶堿和多索茶堿在1.05～67.33 μg/ml的濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（r>0.999）；茶堿和多索茶堿的方法回收率分別為96.79%～105.40%、91.85%～95.51%， 日內(nèi)、日間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）均<10%。結(jié)論 本方法簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確，適用于同時(shí)測(cè)定茶堿和多索茶堿的血藥濃度。

[關(guān)鍵詞]茶堿；多索茶堿；血藥濃度監(jiān)測(cè)；反相高效液相色譜法

[中圖分類號(hào)] R917 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1674-4721（2018）1（c）-0007-03

Simultaneous determination of the concentration of Theophylline and Doxofylline in human plasma by revered-phase high performance liquid chromatography

ZHAO Rui-ke1 CAO Jun-hua2

1.Department of Pharmacy，Traditional Chinese Medcine Hospital of Changsha City in Hu′nan Province，Changsha 410100，China；2.Department of Pharmacy in Mawangdui Area，People′s Hospital in Hu′nan Province，Changsha 410000，China

[Abstract]Objective To establish a method for simultaneous determination of theophylline and doxofylline in human plasma by RP-HPLC.Methods Phenomenex C18 （250 mm ×4.6 mm，5 μm） column was used.The mobile phase was composed of methanol-water （30∶70） at flow rate of 1.0 ml/min.The detection wavelength was 273 nm and the internal standard was caffeine.Results The linear range was 1.05 to 67.33 μg/ml for theophylline and doxofylline （r>0.999）.The recovery rates was 96.79%-105.40% and 91.85%-95.51% respectively.The intra-day precisions and the inter-day precisions were both less than 10%.Conclusion The method is rapid and accurate.It can be used for the simultaneous determination of theophylline and doxofylline concentration in human plasma.

[Key words]Theophylline；Doxofylline；Plasma concentration monitoring；RP-HPLC

茶堿是臨床上治療支氣管哮喘的經(jīng)典藥物，其通過抑制磷酸二酯酶，使細(xì)胞內(nèi)環(huán)磷酸腺苷（cAMP）含量增高而發(fā)揮藥理作用。茶堿的有效血藥濃度與中毒濃度非常接近，因此臨床應(yīng)用需要監(jiān)測(cè)其血藥濃度[1]。多索茶堿是新型的甲基黃嘌呤衍生物，其支氣管平滑肌松弛作用是茶堿的10～15倍，并有鎮(zhèn)咳作用。多索茶堿的毒副作用較茶堿少，但是大劑量仍可引起血壓下降等不良反應(yīng)[2-3]。目前茶堿和多索茶堿的血藥濃度測(cè)定多有報(bào)道，但是同時(shí)測(cè)定的文獻(xiàn)較少。茶堿和多索茶堿互為補(bǔ)充，臨床上存在著兩者交替使用甚至合并使用的情況[4-6]。本研究建立了反相高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定血漿中茶堿和多索茶堿的藥物濃度，現(xiàn)報(bào)道如下。

1儀器與材料

1.1儀器

LC-10A高效液相色譜儀，SPD-10A紫外檢測(cè)器，Shimadzu CLASS-VP液相工作站（日本島津）；梅特勒-托利多AG285電子分析天平（瑞士，精度：0.01 mg）；TG16-W 微量高速離心機(jī)（長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司）；WH-2 微量旋渦混合儀（上海滬西分析儀器廠）。

1.2藥品與試劑

氨茶堿對(duì)照品（中國藥品生物制品檢定所，批號(hào)：100336-200703，含量為99.9%），多索茶堿對(duì)照品（中國藥品生物制品檢定所，批號(hào)：100109-200305，含量為99.9%），咖啡因?qū)φ掌罚▋?nèi)標(biāo)，中國藥品生物制品檢定所，批號(hào)：100757-200556，含量99.1% ）， 甲醇（色譜純，Merck，Germany），水為雙重蒸餾水，其他試劑為分析純。

2方法與結(jié)果

2.1色譜條件

色譜柱：Phenomenex C18 柱（250 mm× 4.6 mm，5 μm），預(yù)柱：Phenomenex C18柱（10 mm×4.6 mm，5 μm）；柱溫：40℃；流動(dòng)相：甲醇∶水（30∶70）；流速：1 ml/min；檢測(cè)波長：273 nm；進(jìn)樣量：10 μl。endprint

2.2標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

精密稱取氨茶堿對(duì)照品10.1 mg 、多索茶堿對(duì)照品10.1 mg，置于10 ml 容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，制成10.10 μg/ml的對(duì)照品儲(chǔ)備液；另精密稱取咖啡因?qū)φ掌?0 mg，置于100 ml 容量瓶中，加甲醇溶解至刻度，得濃度為100 μg/ml的內(nèi)標(biāo)溶液。以上樣品均置于4℃的冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3血漿樣品的處理

取血漿0.35 ml，置于1.5 ml的EP管中，加入內(nèi)標(biāo)溶液25 μl，再加入甲醇溶液1.1 ml，渦旋振蕩1 min，以10 000 r/min離心10 min，取上清液10 μl進(jìn)樣。

2.4色譜行為

空白血樣、空白血樣中加入對(duì)照品和內(nèi)標(biāo)血樣經(jīng)HPLC分析得到色譜圖（圖1）。茶堿、多索茶堿和內(nèi)標(biāo)的保留時(shí)間分別為7.1、13.8、9.6 min，基線平穩(wěn)，峰形良好，無雜質(zhì)峰干擾。提示本方法具有較高特異性，能夠準(zhǔn)確測(cè)定血漿中茶堿和多索茶堿的濃度。

2.5線性范圍與最低檢測(cè)限

用空白血漿將茶堿對(duì)照品和多索茶堿對(duì)照品溶液稀釋成不同濃度（1.05，2.11，4.21，8.42，16.83， 33.66，67.33 μg/ml）的含藥血漿，按“2.3”項(xiàng)下處理方法處理并測(cè)定，以茶堿、多索茶堿的峰面積和內(nèi)標(biāo)的峰面積比值與茶堿和多索茶堿的濃度進(jìn)行線性回歸，分別得到回歸方程為Y=18.591X-0.457（r2=0.9987）、 Y=17.362X-0.256（r2=0.9963），結(jié)果提示茶堿和多索茶堿在1.05～67.33 μg/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，最低定量限為1.05 μg/ml。

2.6回收率與精密度試驗(yàn)

分別配制濃度為2.11、16.83、33.66 μg/ml的茶堿和多索茶堿的血漿樣品標(biāo)準(zhǔn)管，按 “2.3”項(xiàng)下操作，測(cè)定峰面積，按回歸方程計(jì)算實(shí)測(cè)濃度，分別在同一天內(nèi)測(cè)定5次和每天5次連續(xù)測(cè)定3 d，分別考察方法的日內(nèi)、日間精密度和回收率。

配置濃度為2.11、16.83、33.66 μg/ml的茶堿和多索茶堿標(biāo)準(zhǔn)液各5份，直接進(jìn)樣得峰面積。用空白血漿配置不同濃度的茶堿、多索茶堿標(biāo)準(zhǔn)血漿各5份，平行操作，進(jìn)樣得峰面積。將萃取前后的峰面積進(jìn)行比較，計(jì)算方法的提取回收率（表1）。

2.7樣品穩(wěn)定性考察

血漿樣品室溫放置穩(wěn)定性：用空白血漿配制相當(dāng)于濃度2.11、16.83、33.66 μg/ml的茶堿和多索茶堿的血漿樣品，考察其在-20℃冷凍保存、反復(fù)凍融、室溫條件下的穩(wěn)定性。結(jié)果提示，茶堿和多索茶堿的血漿樣品在-20℃保存20 d，反復(fù)凍融3次，室溫條件下放置10 h，測(cè)得的濃度與理論濃度相比，RSD均<10%，提示茶堿和多索茶堿在上述條件下保持穩(wěn)定（表2）。

2.8臨床應(yīng)用

患者，男，73歲，診斷：慢性阻塞性肺疾病急性加重，高血壓3級(jí)（極高危）。入院后醫(yī)囑給予患者氨茶堿注射液0.25 g和0.9%氯化鈉注射液250 ml靜脈滴注，12 h給藥1次。第4天測(cè)定茶堿谷濃度為17.3 μg/ml，患者已有較明顯的惡心嘔吐等中毒癥狀。醫(yī)生調(diào)整遺囑，改為多索茶堿0.2 g和0.9%氯化鈉注射液250 ml靜脈滴注，12 h給藥1次，第8天給藥前測(cè)定多索茶堿谷的濃度為8.46 μg/ml ，患者哮喘控制佳，且無不良反應(yīng)發(fā)生。

3討論

目前國內(nèi)外報(bào)道的茶堿和多索茶堿HPLC同時(shí)測(cè)定的方法主要有固相提取法[7]、液液萃取法[8]、直接蛋白沉淀法[9-15]等。固相提取法操作過程繁瑣，液液萃取法通常采用的氯仿、異丙醇等易揮發(fā)試劑，對(duì)身體有較大毒性，且過程需要萃取、轉(zhuǎn)移、揮干等，操作一致性和穩(wěn)定性較差。而已有的蛋白沉淀法，多采用10%三氯醋酸、10%高氯酸等，上清液需用微孔濾膜過濾，流動(dòng)相中加入三乙胺等改善拖尾。本法沉淀劑選用甲醇，流動(dòng)相采用甲醇-水，對(duì)色譜柱損傷較小。

多索茶堿與茶堿在化學(xué)結(jié)構(gòu)上的區(qū)別是多索茶堿在茶堿的7位上加了1個(gè)二氧戊環(huán)，這是兩者在色譜柱上能夠分離的基礎(chǔ)，多索茶堿的保留時(shí)間比茶堿延長了許多。流動(dòng)相中有機(jī)相與水相的比例對(duì)茶堿和多索茶堿的保留時(shí)間有很大的影響，本研究考察了甲醇與水的不同配比，當(dāng)甲醇比例>35%時(shí)，茶堿色譜峰和血漿內(nèi)源性雜質(zhì)峰無法分離。當(dāng)甲醇∶水的比例為3∶7時(shí)，茶堿、多索茶堿、內(nèi)標(biāo)與雜質(zhì)峰分離效果較好，出峰時(shí)間適宜，滿足了測(cè)定需求。

以往認(rèn)為茶堿的有效治療濃度范圍是10～20 μg/ml，近些年研究發(fā)現(xiàn)茶堿在低濃度（5～10 μg/ml）時(shí)有顯著的抗炎作用及免疫調(diào)節(jié)作用，故把茶堿的有效血藥濃度定為6～15 μg/ml更合理，該濃度兼顧了茶堿的擴(kuò)張支氣管和抗炎作用，又減少了毒性作用的發(fā)生[16-18]。多索茶堿的有效藥物濃度仍無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，但考慮到多索茶堿的藥理作用是茶堿的10～15倍，在<5 μg/ml時(shí)是否有臨床意義還需進(jìn)一步研究。本方法的測(cè)定范圍（1.05～67.33 μg/ml）完全覆蓋了最低有效濃度和中毒濃度，可以滿足臨床測(cè)定的需要。

目前在臨床治療上，為了控制哮喘的急性癥狀，口服多索茶堿的患者仍可能靜脈注射茶堿注射液，使用本方法可同時(shí)快速準(zhǔn)確地測(cè)定茶堿和多索茶堿的血藥濃度，為臨床及時(shí)調(diào)整劑量、減少不良反應(yīng)的發(fā)生提供依據(jù)。

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（收稿日期：2017-09-04 本文編輯：閆 佩）endprint