Clusterin的產(chǎn)生機(jī)制、結(jié)構(gòu)及功能

董喬梅， 趙 麗， 滕永軍

(蘭州大學(xué)第一醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室， 蘭州 730000)

1983年Blaschuk等首次在山羊精液中分離得到一種熱穩(wěn)定、對(duì)胰島素敏感、促進(jìn)細(xì)胞間黏附的糖蛋白，將其命名為clusterin(CLU)[1]，并且發(fā)現(xiàn)該蛋白的分子質(zhì)量80 ku，等電點(diǎn)為3.6，還原條件下在凝膠中呈現(xiàn)40 ku的條帶。1984年，CLU具有不同等電點(diǎn)的蛋白形式被分離了出來[2]。通過Western blot檢測(cè)CLU在小鼠前列腺中的表達(dá)時(shí)發(fā)現(xiàn)，其可以呈現(xiàn)具有不同分子質(zhì)量的條帶。當(dāng)切除小鼠的前列腺抑制雄性激素分泌使得clusterin誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)，CLU的蛋白表達(dá)譜會(huì)變得更加復(fù)雜[3]。這一結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了CLU是一種具有多種蛋白形式復(fù)雜難以研究的蛋白。CLU的功能多樣，參與細(xì)胞內(nèi)外重要的生命活動(dòng)。CLU功能的多樣性與其復(fù)雜的結(jié)構(gòu)密切相關(guān)。本文就clusterin不同蛋白產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)、定位、產(chǎn)生機(jī)制、具有的功能以及參與的信號(hào)通路做一綜述。

1 clusterin的結(jié)構(gòu)及蛋白產(chǎn)生機(jī)制

圖 1 sCLU及nCLU的剪切加工機(jī)制[6]Fig 1 The processing mechanism of sCLU and nCLU

編碼CLU的基因位于8p21，全長為1.9 kb，其有9個(gè)外顯子和8個(gè)內(nèi)含子。這個(gè)單拷貝的基因可以編碼不同的蛋白產(chǎn)物，具有不同的細(xì)胞定位，發(fā)揮不同的生物學(xué)功能，主要是分泌型(sCLU)及核型(nCLU)。目前了解比較清楚的是sCLU，在這里sCLU被定義為經(jīng)過完全加工和剪切，成熟并可以分泌到細(xì)胞外發(fā)揮功能的糖蛋白。在其加工成熟的過程中，首先從第一個(gè)AUG密碼子(由第2個(gè)外顯子編碼)翻譯形成包含449個(gè)氨基酸的前體蛋白，位于胞漿，分子質(zhì)量為60 ku。其前21個(gè)氨基酸組成了分泌信號(hào)序列，指導(dǎo)蛋白進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，發(fā)生糖基化，然后進(jìn)入高爾基體，在Arg205和Ser206間發(fā)生斷裂，形成α鏈和β鏈，通過5個(gè)二硫鍵相連。這樣就形成了成熟的分泌型CLU(sCLU)。在不同種屬以及同一種屬不同的組織中，CLU的糖基化修飾會(huì)發(fā)生一定程度的變異，經(jīng)完全糖基化修飾成熟的蛋白其分子質(zhì)量在75～80 ku之間(未發(fā)生切割)。這種蛋白在物種間相對(duì)保守，在一定的刺激信號(hào)下可以分泌到細(xì)胞外間隙和體液中發(fā)揮一定的功能[4-5]。對(duì)nCLU的加工成熟機(jī)制，目前主要有兩種觀點(diǎn)，選擇性剪切加工機(jī)制及選擇性轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)加工機(jī)制。選擇性剪切加工機(jī)制認(rèn)為，nCLU是clusterin全長基因經(jīng)過選擇性剪切形成的。當(dāng)clusterin的第2個(gè)外顯子發(fā)生選擇性的剪切，第1個(gè)外顯子和第3個(gè)外顯子(編碼第2個(gè)AUG密碼子)發(fā)生拼接后，從第2個(gè)AUG密碼子翻譯形成分子質(zhì)量為49 ku的蛋白，其不具有內(nèi)質(zhì)網(wǎng)導(dǎo)肽，不能指導(dǎo)蛋白進(jìn)入內(nèi)置網(wǎng)發(fā)生糖基化以及α鏈和β鏈的斷裂，但是具有至少兩個(gè)核定位信號(hào)，可以由胞漿轉(zhuǎn)運(yùn)至核，轉(zhuǎn)變?yōu)楹诵?nCLU)，發(fā)揮一定的生理功能[6](見圖1)。選擇性轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)加工機(jī)制認(rèn)為，nCLU是由全長mRNA的第2個(gè)AUG密碼子(位于第3個(gè)外顯子上)起始翻譯形成的，但是在加工過程中并不發(fā)生第2個(gè)外顯子的選擇性剪切。然而，選擇性的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)理論和選擇性的剪切加工機(jī)制一樣，都不能解釋nCLU為何能在如此短的時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生。至此，科學(xué)家們又提出了一種選擇性的啟動(dòng)子理論，認(rèn)為CLU的不同蛋白產(chǎn)物可能是由于它們分別活化不同的啟動(dòng)子，導(dǎo)致具有不同N端結(jié)構(gòu)域的蛋白產(chǎn)物合成，而這一結(jié)構(gòu)域決定了蛋白在細(xì)胞中的定位，從而決定了蛋白在細(xì)胞中功能的發(fā)揮。因此，科學(xué)家們預(yù)測(cè)，在不同的實(shí)驗(yàn)條件，不同的細(xì)胞類型及組織環(huán)境中檢測(cè)CLU基因不同啟動(dòng)子區(qū)域的活化，可能具有一定的意義[7]。然而在目前還缺乏實(shí)驗(yàn)證據(jù)的情況下，許多研究者們認(rèn)為，與其說nCLU是一種異構(gòu)體，不如說nCLU是一種細(xì)胞核中的存在狀態(tài)。我們對(duì)sCLU的結(jié)構(gòu)已有了粗略的了解，但是依然不知道nCLU的真實(shí)面目，甚至有學(xué)者懷疑nCLU的存在可能是實(shí)驗(yàn)中產(chǎn)生的假象。通過免疫熒光或是激光共聚焦掃描顯微鏡檢測(cè)CLU在完整地經(jīng)過固定的細(xì)胞中的定位將對(duì)其定位了解非常重要[8]。

2 CLU的功能

CLU具有多種功能，甚至在相互對(duì)立的方面均發(fā)揮重要的作用，例如細(xì)胞的增殖、凋亡。雖然CLU的發(fā)現(xiàn)已有20多年的歷史，但是對(duì)它在細(xì)胞增殖凋亡中發(fā)揮的作用目前還不是非常清楚。最初的研究發(fā)現(xiàn)CLU與凋亡相關(guān)。Leger等[9]通過原位雜交發(fā)現(xiàn)，在小鼠退行性前列腺凋亡的上皮細(xì)胞中CLU高表達(dá)；隨后許多科學(xué)家發(fā)現(xiàn)，在發(fā)生凋亡的多種器官組織中(包括心、腦、肺、肝、腎和視網(wǎng)膜等)，均存在CLU的高表達(dá)。CLU的上調(diào)表達(dá)似乎可以成為細(xì)胞發(fā)生凋亡的標(biāo)志。然而，后續(xù)的研究發(fā)現(xiàn)，CLU具有抗凋亡作用，在包括前列腺癌、胰腺癌、乳腺癌、膀胱癌、結(jié)腸直腸癌在內(nèi)的多種腫瘤中高表達(dá)，并且其高表達(dá)與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移以及不良預(yù)后密切相關(guān)[10-11]。CLU到底在腫瘤中高表達(dá)還是低表達(dá)，到底是誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡還是促進(jìn)細(xì)胞增殖存在爭(zhēng)議，甚至在同一種腫瘤的研究中都會(huì)出現(xiàn)相反的結(jié)果。出現(xiàn)這些矛盾的結(jié)果可以有多種可能的解釋：由于CLU存在多種細(xì)胞組分中，具有多種存在形式，不同類型又具有不同的定位，發(fā)揮不同的功能。運(yùn)用針對(duì)CLU不同表位的抗體，靶向CLU不同異構(gòu)體的引物合成出的PCR產(chǎn)物，這些不同都會(huì)導(dǎo)致最終結(jié)果的差異，甚至出現(xiàn)截然相反的結(jié)果。此外對(duì)同一結(jié)果的不同解讀也可能是導(dǎo)致偏差，出現(xiàn)矛盾結(jié)果的其中一個(gè)原因。目前一般的看法是，分泌型clusterin(sCLU)在不同遺傳背景的腫瘤細(xì)胞中起著抗凋亡的作用，而核型clusterin(nCLU)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。并且兩者的動(dòng)態(tài)平衡在細(xì)胞的生命活動(dòng)中扮演重要的角色。

2.1 分泌型CLU與細(xì)胞增殖、凋亡

由clusterin全長mRNA翻譯，經(jīng)糖基化修飾，具有α鏈和β鏈的sCLU，其表達(dá)發(fā)生變化與多種惡性腫瘤的發(fā)展密切相關(guān)。Saffer等[12]用特異性識(shí)別sCLU的抗體，通過免疫組化檢測(cè)到82%的淋巴瘤中sCLU表達(dá)升高，可能作為生物標(biāo)志物用于淋巴瘤的診斷。此外，研究發(fā)現(xiàn)sCLU的高表達(dá)還會(huì)導(dǎo)致機(jī)體對(duì)放療以及紫杉醇、阿霉素、順鉑等化療藥物產(chǎn)生抗性。在腫瘤細(xì)胞中，sCLU促進(jìn)細(xì)胞增殖、抑制凋亡、對(duì)化療藥物產(chǎn)生抗性作用的發(fā)揮是通過與受體結(jié)合，活化多種信號(hào)通路來實(shí)現(xiàn)的。例如sCLU通過與其受體maglin的結(jié)合，促進(jìn)AKT的磷酸化，進(jìn)而誘導(dǎo)Bad蛋白發(fā)生磷酸化，阻止細(xì)胞色素c從線粒體中向胞漿中的釋放，抑制細(xì)胞發(fā)生凋亡[13]。sCLU與受體的結(jié)合同樣可以促進(jìn)MEK/ERK信號(hào)通路活化，而該通路的活化可以促進(jìn)細(xì)胞增殖[14]。Zoubeidi等[15]的研究發(fā)現(xiàn)在前列腺癌中sCLU的高表達(dá)可以促進(jìn)IKB的降解，釋放NF-κB入核發(fā)揮轉(zhuǎn)錄因子的作用，從而促進(jìn)細(xì)胞增殖。研究發(fā)現(xiàn)，sCLU通過與活化的Bax的相互作用來抑制凋亡[16](見圖2)。

盡管如此，分泌型CLU的表達(dá)上調(diào)是否是腫瘤發(fā)生的共同特征，可以保護(hù)腫瘤細(xì)胞免于凋亡，仍然存在爭(zhēng)議。因?yàn)橐灿形墨I(xiàn)報(bào)道指出，分泌型CLU在包括胰腺癌、前列腺癌、食管癌、成神經(jīng)細(xì)胞瘤、結(jié)腸直腸癌在內(nèi)的多種腫瘤中低表達(dá)[17-18]，對(duì)其原因還不是非常清楚。一種可能的解釋就是在癌變過程中發(fā)生染色體、基因、蛋白的異常改變。在結(jié)腸直腸癌中經(jīng)常出現(xiàn)clusterin所在八號(hào)染色體短臂的缺失，這似乎可以解釋其低表達(dá)的原因。

2.2 核型CLU與細(xì)胞增殖、凋亡

nCLU被定義為細(xì)胞核中的一種存在形式，是通過一定的方法在完整的細(xì)胞核中檢測(cè)到的clusterin蛋白，即使是微量的存在也將其定義為nCLU[11]。最早是1996年由Reddy等[19]提出的，他們的研究發(fā)現(xiàn)，TGFβ可以誘導(dǎo)細(xì)胞中的CLU進(jìn)入細(xì)胞核。此后的研究發(fā)現(xiàn)，多種刺激因子，如電離輻射、化療藥物、激素、細(xì)胞因子、熱休克或是細(xì)胞缺鈣的作用下均可以誘導(dǎo)細(xì)胞核中CLU蛋白的表達(dá)。2003年之后，許多文獻(xiàn)開始報(bào)道nCLU可能具有的功能，發(fā)現(xiàn)該蛋白可能抑制細(xì)胞的增殖，促進(jìn)細(xì)胞的凋亡。Moretti等[20]的研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)CLU在細(xì)胞核內(nèi)的表達(dá)量升高時(shí)可以抑制細(xì)胞發(fā)生增殖和遷移。Leskov等[21]對(duì)乳腺癌細(xì)胞系MCF-7的研究中發(fā)現(xiàn)，在電離輻射的作用下，CLU由胞漿轉(zhuǎn)運(yùn)至核，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。Scaltriti等[22]的研究發(fā)現(xiàn)，在前列腺癌細(xì)胞中細(xì)胞核內(nèi)CLU的高表達(dá)可以引起G2-M期的停滯，從而誘導(dǎo)細(xì)胞經(jīng)caspase倚賴的途徑發(fā)生凋亡。目前認(rèn)為nCLU促凋亡功能的發(fā)揮是通過在細(xì)胞核中與ku70蛋白作用實(shí)現(xiàn)的，nCLU與ku70的結(jié)合，抑制ku70蛋白發(fā)揮DNA損傷修復(fù)的功能，最終抑制細(xì)胞的增殖，促進(jìn)細(xì)胞的凋亡[16](見圖2)。

當(dāng)然，由于不同的腫瘤存在異質(zhì)性，nCLU抑制細(xì)胞的增殖，促進(jìn)細(xì)胞的凋亡的結(jié)論也不是絕對(duì)的。我們實(shí)驗(yàn)室在對(duì)食管癌的研究中發(fā)現(xiàn)nCLU在腫瘤組織及細(xì)胞系中高表達(dá)，對(duì)其可能的機(jī)制正在進(jìn)一步的研究中。

圖2 sCLU及nCLU參與的信號(hào)網(wǎng)絡(luò)[16]

3 小結(jié)

雖然CLU發(fā)現(xiàn)至今已有20多年時(shí)間，關(guān)于該蛋白的文獻(xiàn)報(bào)道已有上千篇，但是對(duì)CLU的認(rèn)識(shí)依然令人迷惑不解。CLU蛋白還沒有得到分離、純化和結(jié)晶，目前得到的CLU蛋白的結(jié)構(gòu)只是通過計(jì)算機(jī)模擬出來的；clusterin單一拷貝的基因可以編碼多種蛋白產(chǎn)物，但是這些蛋白產(chǎn)物的產(chǎn)生機(jī)制還沒有得到充分的揭示；CLU蛋白參與許多重要的生命活動(dòng)，這些功能的發(fā)揮與該蛋白在細(xì)胞中的不同定位密切相關(guān)，而在這方面目前也缺乏全面的認(rèn)識(shí)。因此，對(duì)不同類型的CLU蛋白結(jié)構(gòu)的認(rèn)識(shí)，產(chǎn)生機(jī)制的闡明，表達(dá)調(diào)控機(jī)制的了解非常重要。CLU不同蛋白類型之間的動(dòng)態(tài)平衡到底在不同類型的腫瘤中發(fā)揮怎樣的作用，是否可以用于腫瘤的診斷，預(yù)后以及作為治療的靶標(biāo)都有待進(jìn)一步的研究。

致謝：感謝中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院腫瘤醫(yī)院趙曉航研究員在本文寫作中給予的幫助。

[1]BLASCHUK O, BURDZY K, FRITZ I B. Purification and characterization of a cell-aggregating factor (clusterin), the major glycoprotein in ram rete testis fluid [J]. J Biol Chem, 1983, 258(12): 7714-7720.

[2]BLASCHUK O W, FRITZ I B. Isoelectric forms of clusterin isolated from ram rete testis fluid and from secretions of primary cultures of ram and rat Sertoli-cell-enriched preparations [J]. Can J Biochem Cell Biol, 1984, 62(6): 456-461.

[3]BETTUZZI S. Chapter 1: Introduction [J]. Adv Cancer Res, 2009,104:1041-1048.

[4]RIZZI F, CACCAMO A E, BELLONI L, et al. Clusterin is a short half-life, poly-ubiquitinated protein, which controls the fate of prostate cancer cells [J]. J Cell Physiol, 2009, 219(2): 314-323.

[5]PREZISOSO D, STRAZZULLO P, LOTTI T, et al. Dietary treatment of urinary risk factors for renal stone formation. A review of CLU Working Group [J]. Arch Ital Urol Androl, 2015, 87(2): 105-120.

[6]LONDOU A, MIKROU A, ZARKADIS I K. Cloning and characterization of two clusterin isoforms in rainbow trout [J]. Mol Immunol, 2008, 45(2): 470-478.

[7]RIZZI F, COLETTA M, BETTUZZI S. Chapter 2: Clusterin (CLU): From one gene and two transcripts to many proteins [J]. Adv Cancer Res, 2009, 104: 9-23.

[8]BETTUZZI S, RIZZI F. Chapter 5: Nuclear CLU (nCLU) and the fate of the cell [J]. Adv Cancer Res, 2009, 104: 59-88.

[9]LéGER J G, MONTPETIT M L, TENNISWOOD M P. Characterization and cloning of androgen-repressed mRNAs from rat ventral prostate [J]. Biochem Biophys Res Commun, 1987, 147(1): 196-203.

[10]TAKEUCHI A, SHIOTA M, BERALDI E, et al. Insulin-like growth factor-I induces CLU expression through Twist1 to promote prostate cancer growth[J]. Mol Cell Endocrinol, 2016, 384(1-2): 117-125.

[11]DEB M, SENGUPTA D, RATH S K, et al. Clusterin gene is predominantly regulated by histone modifications in human colon cancer and ectopic expression of the nuclear isoform induces cell death [J]. Biochim Biophys Acta, 2015, 1852(8): 1630-1645.

[12]SAFFER H, WAHED A, RASSIDAKIS G Z, et al. Clusterin expression in malignant lymphomas: a survey of 266 cases[J]. Mod Pathol, 2002, 15(11): 1221-1226.

[13]AMMAR H, CLOSSET J L. Clusterin activates survival through PI-3 kinase/AKT pathway[J] . J Biol Chem, 2008, 2:401-408

[14]SHIM Y J, SHIN Y J, JEONG S Y, et al. Epidermal growth factor receptor is involved in clusterin-induced astrocyte proliferation[J]. Neuroreport, 2009, 20(4): 435-439.

[15]ZOUBEIDI A, ETTINGER S, BERALDI E, et al. Clusterin facilitates COMMD1 and I-kappaB degradation to enhance NF-kappaB activity in prostate cancer cells [J]. Mol Cancer Res, 2010, 8(1): 119-130.

[16]SUBRAMANIAN C, JARZEMBOWSKI J A, HALSEY S M. CLU blocks HDACI-mediated killing of neuroblastoma [J]. Tumour Biol, 2016, 32(2): 285-294.

[17]JHALA N, JHALA D, VICKERS S M, et al. Biomarkers in diagnosis of pancreatic carcinoma in fine-needle aspirates[J]. Am J Clin Pathol, 2006, 126(4): 572-579.

[18]TAKASE O, MINTO A W, PURI T S, et al. Inhibition of NF-kappaB-dependent Bcl-xL expression by clusterin promotes albumin-induced tubular cell apoptosis[J]. Kidney Int, 2008, 73(5): 567-577.

[19]REDDY K B, JIN G, KARODE M C, et al. Transforming growth factor beta (TGF beta)-induced nuclear localization of apolipoprotein J/clusterin in epithelial cells[J]. Biochemistry, 1996, 35(19): 6157-6163.

[20]MORETTI R M, MARELLI M M, MAI S, et al. Clusterin isoforms differentially affect growth and motility of prostate cells: possible implications in prostate tumorigenesis[J]. Cancer Res, 2007, 67(21): 10325-10333.

[21]LESKOV K S, KLOKOV D Y, Li J, et al. Synthesis and functional analyses of nuclear clusterin, a cell death protein [J]. J Biol Chem, 2003, 278(13): 11590-11600.

[22]SCALTRITI M, SANATAMARIA A, PACIUCCI R, et al. Intracellular clusterin induces G2-M phase arrest and cell death in PC-3 prostate cancer cells1[J]. Cancer Res, 2016, 64(17): 6174-6182.