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    濱州地區(qū)凡納濱對蝦苗種蝦肝腸胞蟲病的調(diào)查和分析

    2023-05-30 12:09:34崔瑋琪馮曉宋瑞強(qiáng)楊勛楊雙蘇兆軍
    河北漁業(yè) 2023年3期
    關(guān)鍵詞:凡納濱濱州對蝦

    崔瑋琪 馮曉 宋瑞強(qiáng) 楊勛 楊雙 蘇兆軍

    摘 要:為全面、系統(tǒng)地了解濱州市地區(qū)凡納濱對蝦(Litopenaeus vannamei)苗種攜帶蝦肝腸胞蟲(Enterocytozoon hepatopenaei, EHP)及爆發(fā)情況,對濱州地區(qū)37家凡納濱對蝦養(yǎng)殖池塘隨機(jī)采集對蝦苗種樣本,根據(jù)SC/T 7232-2020 《蝦肝腸胞蟲病診斷規(guī)程》采用套式PCR法進(jìn)行對蝦苗種蝦肝腸胞蟲的檢測,檢測結(jié)果表明濱州地區(qū)蝦肝腸胞蟲陽性檢測率為4.84%,同時監(jiān)測蝦肝腸胞蟲病發(fā)病池和未發(fā)病池的水質(zhì),發(fā)現(xiàn)發(fā)病池的水體中pH值、COD等指標(biāo)并沒有顯著差異,說明蝦肝腸胞蟲病爆發(fā)并不是由于養(yǎng)殖池水質(zhì)導(dǎo)致的。

    關(guān)鍵詞:凡納濱對蝦(Litopenaeus vannamei);蝦肝腸胞蟲(Enterocytozoon hepatopenaei, EHP);PCR;檢出率

    近年來由于對蝦疫病的頻繁爆發(fā),使得對蝦養(yǎng)殖業(yè)受到了較大的沖擊。其中有一種常見的疾病在泰國、印度、越南和中國等國家中流行,可造成對蝦苗種生長極其緩慢或停止[1],其病原微生物為蝦肝腸胞蟲(Enterocytozoon hepatopenaei,EHP)。

    EHP的流行率較高,已經(jīng)成為威脅我國養(yǎng)殖業(yè)的一個嚴(yán)重病原。我國于2013年在浙江臺州養(yǎng)殖的凡納濱對蝦的肝胰腺中首次檢出EHP,此后在我國沿海地區(qū)陸續(xù)發(fā)現(xiàn)大量EHP感染病例。2015年遼寧營口的對蝦EHP檢出率為34.6%[2];粵西地區(qū)養(yǎng)殖對蝦EHP檢出率為41.38%[3];浙江舟山養(yǎng)殖對蝦EHP檢出率為85.19%[4],檢出率逐年上升。本文就濱州地區(qū)EHP的發(fā)病率進(jìn)行調(diào)查分析,以期為建立有效防控技術(shù)方案提供參考。

    1 材料與方法

    1.1 樣品來源

    調(diào)查區(qū)域包括濱州市沾化區(qū)、無棣縣、博興縣凡納濱對蝦工廠化養(yǎng)殖池,隨機(jī)抽取37家苗種養(yǎng)殖場進(jìn)行抽檢(選取苗種日期相近的養(yǎng)殖場)。此次調(diào)查從3月開始到7月結(jié)束,每七天為一個周期進(jìn)行取樣檢測,共計得到樣品195份。

    1.2 樣品EHP檢測

    1.2.1 樣品前處理 取凡納濱對蝦蝦苗全蝦在已滅菌的研缽中研磨,將研磨后的組織放在無菌的離心管中,-20 ℃冰箱保存。

    1.2.2 總DNA的提取 取研磨好的樣品約20 mg左右,采用TaKaRa MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver.5.0 DNA提取試劑盒進(jìn)行對蝦樣品總DNA的提取,提取后采用-20 ℃冰箱保存。

    1.2.3 檢測 根據(jù)SC/T 7232-2020《蝦肝腸胞蟲病診斷規(guī)程》采用套式PCR方法進(jìn)行擴(kuò)增,套式PCR擴(kuò)增體系所需引物序列見表1,PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件:95 ℃ 5 min,95 ℃ 30 s,55 ℃ 30 s,68 ℃ 45 s,30個循環(huán),最后4 ℃保溫。產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂凝膠電泳檢測后, 送至生工生物工程(濟(jì)南) 股份有限公司測序,測序結(jié)果與NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行進(jìn)一步的基因序列對比,進(jìn)一步驗證結(jié)果的準(zhǔn)確性。

    2 結(jié)果與分析

    將兩輪陽性PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序,并將測序結(jié)果與NCBI數(shù)據(jù)庫中EHP的致病基因序列進(jìn)行比對,結(jié)果顯示PCR擴(kuò)增出的陽性片段與NCBI數(shù)據(jù)庫中的EHP致病基因的序列相似度為98%。部分對蝦樣品的電泳圖見圖1和圖2。

    3 討論

    3.1 濱州地區(qū)EHP感染情況

    本研究對2022年3—7月期間濱州地區(qū)的凡納濱對蝦苗種養(yǎng)蝦池EHP的感染情況進(jìn)行了調(diào)查與分析,結(jié)果表明,EHP的發(fā)病率在4.84%,主要集中在4—5月。通過對發(fā)病池和未發(fā)病池的水質(zhì)進(jìn)行監(jiān)測發(fā)現(xiàn),其pH值、COD等指標(biāo)并沒有顯著差異。

    3.2 病因分析

    蝦肝腸胞蟲?。‥nterocytozoon hepatopenaei disease)也稱作肝胰腺微孢子蟲?。℉epatopancreatic microsporidiosis, HPM),最早是在馬來西亞養(yǎng)殖斑節(jié)對蝦的肝胰腺中發(fā)現(xiàn)的[5-6],2004年研究人員發(fā)現(xiàn)泰國養(yǎng)殖斑節(jié)對蝦體中也存在微孢子感染,Tourtip等 (2009)將這類感染對蝦肝胰腺的微孢子蟲正式命名蝦肝腸胞蟲,此后在越南、印度、中國、委內(nèi)瑞拉等國家?guī)缀跬瑫r檢測出EHP,目前EHP已經(jīng)成為危害我國水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的主要病原之一。

    蝦肝腸胞蟲在分類上屬微孢子綱(Microsporea),腸胞蟲科 (Enterocytozoonidae) ,腸胞蟲屬(Enterocytozoon)[7],是一種可感染多種真核生物的專型細(xì)胞內(nèi)寄生真菌。成熟的蝦肝腸胞蟲的孢子呈橢圓形,具有極絲、1個細(xì)胞核和1 個后位空泡,由幾丁質(zhì)構(gòu)成的孢包裹,大小為(1.1±0.2)μm×(0.7±0.1)μm[8]?;疾ξr肝胰腺和腸道顏色較深,嚴(yán)重者肝胰腺萎縮,生長緩慢,個體明顯偏小,感染群體生長差異明顯增大。正常養(yǎng)殖條件下,攝食正常,腸胃充滿食物,不出現(xiàn)大量、急性死亡。體長相同時,發(fā)病群里的平均體重約為EHP陰性的70%。

    濱州地區(qū)EHP發(fā)病率為4.84%,相對較低,造成原因有兩個方面,一是EHP的傳播有兩種形式:一種是垂直傳播,即通過親蝦傳播給子代;另一種是水平傳播,即攝食寄生EHP的鮮活餌料、病蝦、死蝦或環(huán)境中的孢子體而感染[9-10]。通過對發(fā)病池和未發(fā)病池水質(zhì)進(jìn)行監(jiān)測發(fā)現(xiàn)兩者差異不顯著,可能是由于采集的樣品為蝦苗,尚未攝食鮮活餌料,因此未發(fā)生水平傳播,沒有造成大范圍的傳染。二是由于2020年起,為從源頭嚴(yán)格控制重大水生疫病的傳播,山東省開始實行水產(chǎn)苗種產(chǎn)地檢疫工作,加大對出廠苗種的管控力度,提高了水產(chǎn)苗種質(zhì)量,降低了疫病發(fā)生率。

    3.3 防控措施

    苗種作為最重要的投入品,處于養(yǎng)殖生產(chǎn)中的首要環(huán)節(jié),實施苗種檢疫可以從源頭切斷疫病的傳播途徑,因此養(yǎng)殖企業(yè)購買苗種時應(yīng)購買具有資質(zhì)的檢測機(jī)構(gòu)檢測合格的苗種。

    水質(zhì)是對蝦養(yǎng)殖過程中第二個重要環(huán)節(jié)。水質(zhì)管理的好壞,直接決定著對蝦養(yǎng)殖的成敗,因此養(yǎng)殖池中的水要進(jìn)行徹底消毒后方可使用,且要時時監(jiān)測養(yǎng)殖水的指標(biāo)。

    出現(xiàn)對蝦生長緩慢現(xiàn)象的養(yǎng)殖池要進(jìn)行徹底的清塘和消毒,防止病毒繼續(xù)傳播。

    參考文獻(xiàn):

    [1]

    BIJU N,SATHIYARAJ G,RAJ M,et al.High prevalence of Enterocytozoon hepatopenaei in shrimps Penaeus monodon and Litopenaeus vannamei sampled from slow growth ponds in India[J].Diseases of aquatic organisms,2016,120(3):22-30.

    [2] 王博雅,王力,劉美如,等.凡納濱對蝦3種主要病毒和蝦肝腸胞蟲在遼寧地區(qū)的流行情況分析[J].大連海洋大學(xué)學(xué)報,2017,32(2):150-154.

    [3] 陳祿芝.粵西地區(qū)凡納濱對蝦蝦肝腸胞蟲、傳染性皮下和造血組織壞死病毒感染情況的初步調(diào)查[J].漁業(yè)研究.2016.38(4):273-280.

    [4] 施慧,許文軍,謝建軍,等.舟山地區(qū)大棚凡納濱對蝦生長緩慢病因的調(diào)查分析[J].中國水產(chǎn)科學(xué),2017,24(2):387-394.

    [5] ANDERSON I G,SHARIFF M,NASH G.A hepatopancreatic microsporidian in pond-reared tiger shrimp,Penaeus monodon from Malaysia[J].Journal of Invertebrate Pathology,1989, 53(2):278-280.

    [6] ARANGUREN L F, HAN J E, TANG K F J.Enterocytozoon hepatopenaei (EHP) is a risk factor for acute hepatopancreatic necrosis disease (AHPND) and septic hepatopancreatic necrosis (SHPN) in the Pacific white shrimp Penaeus vannamei[J].Aquaculture,2017,471:37-42.

    [7] 胡吉卉,李正民,段健誠,等.蝦類肝腸胞蟲流行病學(xué)研究進(jìn)展[J].水產(chǎn)養(yǎng)殖,2020,41(11):1-4,10.

    [8] 王維娜,王安利,陳麗,等.斑節(jié)對蝦體內(nèi)微孢子蟲的超微結(jié)構(gòu)[J].動物學(xué)報,2001(47):78-81.

    [9] 許杰,鄧威,李軍,薛淑霞,等.蝦肝腸胞蟲(EHP)流行病學(xué)與檢測技術(shù)研究進(jìn)展[J].中國動物檢疫,2018,35(2):64-68.

    [10] 駱云慧,石堅,方磊,等.蝦肝腸胞蟲TaqMan實時熒光定量PCR檢測方法的建立及應(yīng)用[J].中國獸醫(yī)科學(xué),2016,46(7):847-852.

    (收稿日期:2023-02-15;修回日期:2023-02-24)

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