孔雀石綠和隱色孔雀石綠溶液穩(wěn)定性探討

馬瑞欣

摘 要：探討了孔雀石綠溶液和隱色孔雀石綠溶液的穩(wěn)定性與溫度、介質(zhì)的關(guān)系。實驗結(jié)果表明：乙酸銨對孔雀石綠溶液和隱色孔雀石綠溶液的穩(wěn)定性起關(guān)鍵作用；隱色孔雀石綠溶液較孔雀石綠溶液穩(wěn)定。隱色孔雀石綠在乙腈中不論室溫還是4 ℃均可穩(wěn)定存在；孔雀石綠在乙腈中不穩(wěn)定，4 ℃在其溶液中可檢測到隱色孔雀石綠，且濃度越低，轉(zhuǎn)化成隱色孔雀石綠的速度越快。

關(guān)鍵詞：孔雀石綠；隱色孔雀石綠；穩(wěn)定性

孔雀石綠是水產(chǎn)養(yǎng)殖中的禁用藥物，雖已禁用多年，但仍有檢出?？兹甘G在水生動物體內(nèi)迅速代謝為隱色孔雀石綠，二者都具有潛在的致癌性、致突變性和致畸性［1］。隱色孔雀石綠消除緩慢，適宜作為監(jiān)測孔雀石綠的標(biāo)志物［2］。孔雀石綠和隱色孔雀石綠的結(jié)構(gòu)如圖1所示，孔雀石綠易溶于水，隱色孔雀石綠不溶于水，但二者均易發(fā)生去甲基化等反應(yīng)導(dǎo)致降解［3-5］。筆者在多年使用液相色譜熒光檢測法［6］和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法［7］檢測孔雀石綠的過程中發(fā)現(xiàn)孔雀石綠和隱色孔雀石綠的穩(wěn)定性與保存介質(zhì)、溫度等有關(guān)。本文對此進(jìn)行了歸納和總結(jié)，以期對水產(chǎn)品檢測工作者在使用標(biāo)準(zhǔn)溶液和查找檢測中出現(xiàn)的問題時提供幫助。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與材料

LC-20AD液相色譜儀（日本島津）—QTRAP 4500 三重四極桿質(zhì)譜儀（美國AB SCIEX）；高效液相色譜儀（Agilent1100，配有熒光檢測器）、十萬分之一電子天平（SECURA225D-1CN，賽多利斯）。

孔雀石綠草酸鹽標(biāo)準(zhǔn)品、隱色孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)品、隱色孔雀石綠-D6標(biāo)準(zhǔn)品（均為Dr.Ehrenstorfer）、孔雀石綠-D5苦味酸鹽標(biāo)準(zhǔn)品（WiTEGA）；乙腈（色譜純，Merck）、乙酸銨（色譜純，Honeywell）、甲酸（色譜純，DIKMA）。

實驗所用水為超純水。

1.2 試樣制備

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

用十萬分之一電子天平分別稱取適量標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，其中的孔雀石綠草酸鹽和孔雀石綠-D5苦味酸鹽需進(jìn)行折算，用乙腈溶解并定容，配制成100 μg/mL的儲備液。臨用時稀釋成所用濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.2.2 樣品上機溶液制備

在草魚空白樣品中加入隱色孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)溶液，加標(biāo)量3.0 μg/kg。按照GB/T 20361-2006［6］進(jìn)行提取，制備上機溶液。

1.3 上機條件

1.3.1 液相色譜條件

色譜柱：ZORBAX? Eclipse XDB-C 18柱（4.6 mm×250 mm，粒度5 μm）； 流動相：乙腈+乙酸銨（pH=4.5，0.125 mol/L）=80+20；流速1.0 mL/min ；激發(fā)波長：265 nm，發(fā)射波長：360 nm； 柱溫：35 ℃；進(jìn)樣量：20 μL 。

1.3.2 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜條件

液相色譜條件：色譜柱 Accucore TM aQ（100 mm×2.1 mm，2.6 μm）； 進(jìn)樣量2 uL；柱溫：40℃；樣品溫度：10 ℃ ；流動相：A.5 mmol/L乙酸銨溶液（含0.3%甲酸），B.甲醇；梯度洗脫：0～1 min 2% B，1～2 min 98% B～80% B，2～4 min 98% B，4～4.1min 98 % B～20% B，4.1～6 min 2% B。

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源（ESI），多反應(yīng)掃描（MRM）正離子模式，噴霧電壓5 500 V，氣簾氣30 PSi， 碰撞氣Medium，溫度550 ℃，霧化氣55 Psi，輔助加熱氣55 PSi。質(zhì)譜條件及參數(shù)見表1。

2 結(jié)果與討論

2.1 隱色孔雀石綠的穩(wěn)定性與介質(zhì)和溫度的關(guān)系

由1.2.2得到上機溶液，溶劑為乙腈+乙酸銨（0.1 mol/L ，pH=10.0）=1+1； 20 ng/mL隱色孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)溶液，溶劑為乙腈。上機溶液和標(biāo)準(zhǔn)溶液分別分成兩份，一份室溫避光存放，一份4 ℃避光存放；用液相色譜熒光檢測器分別測定峰面積，結(jié)果如圖2所示。

由圖2可知，隱色孔雀石綠即使?jié)舛容^低，2個月內(nèi)其穩(wěn)定性不受溫度和保存介質(zhì)的影響；2個月后，室溫下保存的樣品溶液濃度開始緩慢下降，但室溫下的標(biāo)準(zhǔn)溶液和4 ℃下保存的樣品溶液和標(biāo)準(zhǔn)溶液可以穩(wěn)定至少6個月。

2.2 孔雀石綠、隱色孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)溶液4 ℃的穩(wěn)定性與介質(zhì)的關(guān)系

分別用乙腈、乙腈+5 mmol/L乙酸銨（1+1）、水分別稀釋孔雀石綠、隱色孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)溶液至100 ng/mL單標(biāo)，4 ℃保存。上機測試前用乙腈+5 mmol/L乙酸銨（1+1）分別稀釋成10 ng/mL的溶液，按照1.3.2條件測定其濃度。另外配置10 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液單點法進(jìn)行定量，結(jié)果見圖3。

由圖3a可知，4 ℃時100 ng/mL孔雀石綠只有在乙腈+5 mmol/L乙酸銨（1+1）溶液中才可穩(wěn)定存在2個月；由圖3b可知，4 ℃時100 ng/mL隱色孔雀石綠在乙腈+5 mmol/L乙酸銨（1+1）溶液和乙腈中均可穩(wěn)定存在2個月；孔雀石綠在水溶液中的濃度均呈現(xiàn)測不準(zhǔn)狀態(tài)，可能與其存在形式發(fā)生變化有關(guān)［1，8，9］；隱色孔雀石綠的測不準(zhǔn)可能與其不溶于水有關(guān)。在100 ng/mL孔雀石綠乙腈溶液中檢測到了隱色孔雀石綠的定性定量離子，見圖3C，說明孔雀石綠可能部分轉(zhuǎn)化成了隱色孔雀石綠。為了進(jìn)一步探究其轉(zhuǎn)化速率與濃度的關(guān)系，用乙腈稀釋孔雀石綠儲備液為1 μg/mL和 100 ng/mL孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)溶液，4 ℃避光保存，上機測試前用乙腈+5 mmol/L乙酸銨（1+1）分別稀釋成10 ng/mL的溶液，按照1.3.2條件測定轉(zhuǎn)化成隱色孔雀石綠的情況，測定結(jié)果如圖4 所示。由圖4可知，4 ℃乙腈作為溶劑保存時，孔雀石綠濃度越小，轉(zhuǎn)化速率越快。

3 結(jié)論

通過上述實驗測定孔雀石綠溶液和隱色孔雀石綠溶液的穩(wěn)定性可知：（1）乙酸銨對孔雀石綠溶液和隱色孔雀石綠溶液的穩(wěn)定性起關(guān)鍵性作用。（2）隱色孔雀石綠溶液較孔雀石綠溶液穩(wěn)定。隱色孔雀石綠在乙腈中不論室溫還是4 ℃均可穩(wěn)定存在；孔雀石綠在乙腈中不穩(wěn)定，4 ℃在其溶液中可檢測到隱色孔雀石綠，且濃度越低，轉(zhuǎn)化成隱色孔雀石綠的速度越快。（3）用乙腈配制的孔雀石綠和隱色孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)儲備液應(yīng)嚴(yán)格按照檢測標(biāo)準(zhǔn)［6-7］的要求-18 ℃避光保存。

參考文獻(xiàn)：

[1]PLAKAS S M，El SAID K R， STEHLY G R，et al.Uptake，tissue distribution，and metabolism of malachite green in the channel catfish （Ictalurus punctatus）[J].Can.J.Fish.Aquat.Sci.，1996，53（6）：1427-1433.

[2] MITTELSTAEDT R A，MEI N ，WEBB P J，et al.Genotoxicity of malachite green and leucomalachite green in female Big Blue B6C3F1 mice[J].Mutation Research，2004，561（1-20）：127-138.

[3] CHA C J， DOERGE D R，CERNIGLIA C E.Biotransformation of Malachite Green by the fungus Cunninghamella elegans[J].Appl Environ Microbiol，2001，67（9）：4358-4360.

[4] BERGWERFF A，SCHERPENISSE P.Determination of residues of malachite green in aquatic animals[J].Journal of Chromatography B，2003，788：351-359.

[5] MITROWSKA K，POSYNIAK A，MUDAKI J.Determination of malachite green and leucomalachite green in carp muscle by liquid chromatography with visible and fluorescence detection[J].Journal of Chromatography A，2005 ，1089（1-2）：187-192.

[6] 中華人民共和國國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局，中國國家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會.水產(chǎn)品中孔雀石綠和結(jié)晶紫殘留量的測定 高效液相色譜熒光檢測法：GB/T 20361-2006[S].北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社：2006：1-4.

[7] 中華人民共和國國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局，中國國家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會.水產(chǎn)品中孔雀石綠和結(jié)晶紫殘留量的測定：GB/T 19857-2005[S].北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社：2005：1-7.

[8] SRIVASTAVA S，SINHA R，Roy D.Toxicological effects of malachite green[J].Aquatic Toxicology，2004，66（5）：319-329.

[9] ALDERMAN D J，CLIFTON-HADLEY R S.Malachite green： a pharmacokinetic study in rainbow trout，Oncorhynchus mykiss（Walbaum）[J].Journal of Fish Diseases，1993，16（4）：296-311.

（收稿日期：2022-09-22）