噬菌體制劑和杜仲提取物聯(lián)用減少凡納濱對(duì)蝦工廠化養(yǎng)殖前期換水量的可行性探究

魏玉婷 凌濤 徐濤 孫曉林 呂永 鄭潤玲

摘 要：為探究減少凡納濱對(duì)蝦（Litopenaeus vannamei）工廠化養(yǎng)殖日換水量的可行性，在凡納濱對(duì)蝦工廠化換水養(yǎng)殖的前期（0～34 d），聯(lián)用噬菌體制劑和杜仲葉提取物。結(jié)果表明：該養(yǎng)殖模式下，凡納濱對(duì)蝦養(yǎng)殖前期水體中的弧菌數(shù)量可得到有效抑制，換水量可減少33.33%，養(yǎng)殖全程結(jié)束時(shí)，對(duì)蝦的增重率可提高40.40%。

關(guān)鍵詞：凡納濱對(duì)蝦（Litopenaeus vannamei）；工廠化；節(jié)水；噬菌體；杜仲葉提取物

凡納濱對(duì)蝦（Litopenaeus vannamei）因肉質(zhì)鮮美，一直深受中國消費(fèi)者的喜愛?！笆濉逼陂g全國凡納濱對(duì)蝦養(yǎng)殖量從167.22萬噸增長至186.29萬噸［1-2］。山東省2021年的凡納濱對(duì)蝦產(chǎn)量為21.67萬噸［3］，占全國總產(chǎn)量的10.96%，是我國凡納濱對(duì)蝦的主要產(chǎn)地之一。對(duì)蝦工廠化養(yǎng)殖是一種集約化高密度的養(yǎng)殖模式，因具有土地利用率高，節(jié)約水資源，養(yǎng)殖環(huán)境相對(duì)可控，可顯著提升對(duì)蝦養(yǎng)殖產(chǎn)量等特點(diǎn)［4］，被公認(rèn)為一種可以大力推廣的養(yǎng)殖模式。山東省農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳正在開展?jié)O業(yè)工廠化養(yǎng)殖的大力推廣，目標(biāo)到2030年將工廠化養(yǎng)殖的規(guī)模發(fā)展壯大到3 000萬立方米水體［5］。濰坊市是山東省較早進(jìn)行凡納濱對(duì)蝦工廠化養(yǎng)殖的地市，目前主要以工廠化換水養(yǎng)殖為主，近些年隨著養(yǎng)殖規(guī)模不斷擴(kuò)大，養(yǎng)殖密度不斷提高，對(duì)對(duì)蝦養(yǎng)殖環(huán)境的調(diào)控壓力也不斷增大。當(dāng)養(yǎng)殖水體發(fā)生惡化時(shí)，極易爆發(fā)弧菌病，嚴(yán)重威脅對(duì)蝦的健康養(yǎng)殖。除了使用化學(xué)消毒產(chǎn)品以外，很多養(yǎng)殖廠不得不增大換水量或換水頻次，以保證養(yǎng)殖的順利進(jìn)行，這不僅造成水資源浪費(fèi)，也加大了尾水處理的難度，增加了環(huán)境污染的風(fēng)險(xiǎn)。

噬菌體是一種感染細(xì)菌和古細(xì)菌的病毒，可通過對(duì)細(xì)菌的裂解作用殺死致病菌，降低其感染概率，達(dá)到預(yù)防與治療細(xì)菌性疾病的效果，具有專一性強(qiáng)、不易產(chǎn)生抗性、代謝快、易開發(fā)及成本低等優(yōu)點(diǎn)［6］。目前，已經(jīng)開展了噬菌體在節(jié)肢動(dòng)物、軟體動(dòng)物、棘皮動(dòng)物以及一些海水魚類中的研究，結(jié)果證明噬菌體或噬菌體雞尾酒可以有效預(yù)防或治療常見的弧菌?。?］。

本文通過弧菌噬菌體制劑和杜仲葉提取物聯(lián)合使用控制凡納濱對(duì)蝦養(yǎng)殖水體中的弧菌數(shù)量，提高凡納濱對(duì)蝦的抗逆性，進(jìn)而減少對(duì)蝦養(yǎng)殖過程中的換水量，為凡納濱對(duì)蝦工廠化換水養(yǎng)殖向著更加節(jié)水環(huán)保型發(fā)展提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)時(shí)間、地點(diǎn)和材料

本試驗(yàn)在濰坊市濱海區(qū)恒海生物有限公司的2號(hào)和3號(hào)兩個(gè)養(yǎng)殖車間內(nèi)進(jìn)行，兩個(gè)養(yǎng)殖車間的結(jié)構(gòu)和空間布局完全一致，車間內(nèi)均設(shè)有長方型水泥養(yǎng)殖池32個(gè)，底面積為31 m2。試驗(yàn)過程中24 h充分曝氣，70天以內(nèi)鹽度為10‰左右，70天后鹽度逐漸調(diào)到18‰左右。

6月18日購入南通海大凡納濱對(duì)蝦“快大”品系P5苗，進(jìn)行25 d標(biāo)粗，于7月13—16日進(jìn)行分苗，蝦苗規(guī)格2 200尾/kg，按700尾/㎡的放養(yǎng)密度轉(zhuǎn)移到養(yǎng)殖車間養(yǎng)殖，7月17日養(yǎng)殖試驗(yàn)正式開始。試驗(yàn)所用弧菌噬菌體制劑和杜仲葉提取物由山東信得生物科技有限公司提供，試驗(yàn)飼料為市售對(duì)蝦商品料。

1.2 試驗(yàn)管理和分組

3號(hào)車間為對(duì)照組，從養(yǎng)殖試驗(yàn)開始到第80天池水深60 cm，每日換水50%，從第81天到試驗(yàn)結(jié)束池水深80 cm，換水量為62.5%。每周使用過硫酸氫鉀消毒一次，并重新潑灑有益菌。

2號(hào)車間為試驗(yàn)組，7月17日—8月20日進(jìn)行為期34 d的節(jié)水試驗(yàn)，節(jié)水試驗(yàn)期間減少每日換水量，池水深50 cm，日換水率為40%。自7月23日起每周一次潑灑噬菌體制劑，用量為4 mL/m3，連用2 d；同時(shí)每周一次使用噬菌體制劑進(jìn)行拌料投喂，用量為每千克飼料添加噬菌體制劑20 mL，每日2餐，連喂3 d。8月6—20日，每日用杜仲葉提取物替代噬菌體制劑進(jìn)行拌料，用量為每千克飼料添加4 g，每日添加兩次。8月21日節(jié)水試驗(yàn)結(jié)束，停止向水體和飼料中添加噬菌體制劑和杜葉提取物。8月26日打標(biāo)和樣品采集后使用過硫酸氫鉀消毒，向池中加水至水深80 cm、日換水量為62.5%，并潑灑有益菌占位。

2個(gè)養(yǎng)殖車間的其他養(yǎng)殖管理完全相同。使用相同的葡萄糖氧化酶、乳酸菌、多維等拌料，相同的光合細(xì)菌、芽孢桿菌、乳酸菌進(jìn)行調(diào)水。每日投喂5次，投喂量為體重的4%～6%，每日上午9點(diǎn)左右排水，通過池底的虹吸排污口清除池底的殘餌和糞便等污染物。

1.3 樣品采集

在開始養(yǎng)殖前（7月16日）對(duì)整個(gè)車間進(jìn)行環(huán)境消毒，檢測(cè)養(yǎng)殖用水、養(yǎng)殖蝦體弧菌含量。分別在7月27日、8月5日，隨機(jī)選取2號(hào)養(yǎng)殖車間的6個(gè)養(yǎng)殖池進(jìn)行水樣采集，同時(shí)撈取每個(gè)池中的凡納濱對(duì)蝦進(jìn)行蝦體采樣，檢測(cè)水樣和蝦體的弧菌含量。節(jié)水試驗(yàn)結(jié)束后，于8月26日再次對(duì)養(yǎng)殖用水取樣進(jìn)行弧菌含量檢測(cè)，作為水質(zhì)檢測(cè)的負(fù)對(duì)照。各養(yǎng)殖池水樣從現(xiàn)場(chǎng)采集后，分別用無菌海水稀釋至適宜濃度梯度，再從各梯度分別取100 μL進(jìn)行平板涂布計(jì)數(shù)；蝦體取樣時(shí)，7月16日時(shí)取全蝦，7月27日和8月5日均解剖取肝胰腺和腸道的混合物，加等體積的無菌生理鹽水勻漿，取100 μL勻漿液加900 μL生理鹽水進(jìn)行稀釋，再取100 μL進(jìn)行平板涂布計(jì)數(shù)。

養(yǎng)殖試驗(yàn)過程中分別于8月12日、26日進(jìn)行打標(biāo)，觀察對(duì)蝦生長速度和生長狀況。10月5日養(yǎng)殖試驗(yàn)全部結(jié)束時(shí)，從每個(gè)養(yǎng)殖車間隨機(jī)選6個(gè)養(yǎng)殖池，每個(gè)池?fù)迫?0尾蝦，分別測(cè)量體重、體長、肝胰腺重，計(jì)算增重率、肝體比和肥滿度。

1.4 分析方法

1.4.1 弧菌含量檢測(cè) 采用TCBS培養(yǎng)法。涂布后，28 ℃恒溫培養(yǎng)48 h，選取有效菌落（平均菌落數(shù)在30～300以內(nèi)），計(jì)數(shù)菌落形成單位數(shù)目（CFU）。

1.4.2 統(tǒng)計(jì)分析

增重率（%）= 100 × （平均末體重 - 平均初體重）/平均初體重；

肥滿度（CF）= 100 × 蝦體重 / 體長3；

肝體比（%）= 100 × （肝胰腺重 / 蝦體重）。

試驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析采用計(jì)算軟件SPSS 15.0。所有數(shù)據(jù)在進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析之前，先進(jìn)行正態(tài)性和方差齊性檢驗(yàn)。評(píng)估的變量進(jìn)行配對(duì)樣本均數(shù)的T檢驗(yàn)，以確定兩種養(yǎng)殖模式是否對(duì)各評(píng)價(jià)指標(biāo)產(chǎn)生顯著影響（P＜0.05）。

2 試驗(yàn)結(jié)果

2.1 噬菌體制劑和杜仲葉提取物聯(lián)用對(duì)凡納濱對(duì)蝦養(yǎng)殖日換水量的影響

在整個(gè)節(jié)水試驗(yàn)期間，對(duì)照組（3號(hào)車間）的日換水量為297.6 m3，試驗(yàn)組（2號(hào)車間）日換水量為198.4 m3，試驗(yàn)組比對(duì)照組減少了33.33%的日換水量。

2.2 噬菌體制劑和杜仲葉提取物聯(lián)用對(duì)養(yǎng)殖用水體中弧菌含量的影響

在節(jié)水試驗(yàn)期間，試驗(yàn)組的凡納濱對(duì)蝦蝦體的弧菌含量得到了有效改善，分苗前蝦體的弧菌含量為3.40×104 cfu/mL，到養(yǎng)殖的第11天（7月27日）時(shí)下降到3.50×102 cfu/mL，隨著后期對(duì)蝦體重的增長，養(yǎng)殖密度增大，到8月5日時(shí)凡納濱對(duì)蝦蝦體的弧菌含量有所升高，含量為5.30×103 cfu/mL，仍然遠(yuǎn)低于分苗時(shí)蝦體的弧菌含量。見表1。

養(yǎng)殖池水的弧菌含量在養(yǎng)殖初期下降到3.52×102 cfu/mL，到8月5日增長至2.15×103 cfu/mL，與分苗前時(shí)養(yǎng)殖水體中弧菌含量基本相當(dāng)。然而，在停用噬菌體制劑和杜仲葉提取物后一個(gè)星期（8月26日），養(yǎng)殖池水中的平均弧菌含量升高到1.28×104 cfu/mL，是8月5日時(shí)的5.95倍，是7月27日時(shí)的36.36倍。見表1。

2.3 噬菌體制劑和杜仲葉提取物聯(lián)用對(duì)凡納濱對(duì)蝦生長情況的影響

在節(jié)水試驗(yàn)期間對(duì)兩組對(duì)蝦進(jìn)行打標(biāo)稱重，8月12日時(shí)試驗(yàn)組凡納濱對(duì)蝦的體重平均為5 g，對(duì)照組為2.5 g；到8月26日節(jié)水試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，試驗(yàn)組對(duì)蝦的平均體重為10 g，對(duì)照組的對(duì)蝦體重為5.15 g。試驗(yàn)組的增重速度明顯高于對(duì)照組（見圖1），且對(duì)蝦活力都很強(qiáng)，體色正常，蝦體無明顯破損，蛻殼時(shí)間較一致，基本未發(fā)現(xiàn)蛻殼不遂的蝦或軟皮蝦。

養(yǎng)殖試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，采用配對(duì)樣本t檢驗(yàn)以判斷噬菌體制劑和杜促葉提取物聯(lián)用對(duì)凡納濱對(duì)蝦生長情況的影響。結(jié)果顯示噬菌體制劑和杜仲葉提取物聯(lián)用對(duì)凡納濱對(duì)蝦的末體重、體長和增重率在0.01顯著性水平下呈現(xiàn)差異（P＜0.01），肝體比在0.05顯著性水平下呈現(xiàn)差異（P＜ 0.05），肥滿度和出肉率未產(chǎn)生顯著性差異（P＞0.05）。進(jìn)一步比較其均值發(fā)現(xiàn)，試驗(yàn)組凡納濱對(duì)蝦的末體重、體長和增重率均高于對(duì)照組（P＜0.01），肝體比低于對(duì)照組（P＜0.05），與對(duì)照組相比試驗(yàn)組的增重率提高了40.40%（見表2）。

3 討論

弧菌病是對(duì)蝦養(yǎng)殖業(yè)中一種常見的細(xì)菌性疾病，給對(duì)蝦養(yǎng)殖業(yè)造成了很大損失，被認(rèn)為是對(duì)蝦養(yǎng)殖業(yè)的一個(gè)持續(xù)性威脅。凡納濱對(duì)蝦養(yǎng)殖過程中常見的弧菌主要為哈維氏弧菌、副溶血弧菌、溶藻弧菌和霍亂弧菌［8］。在水產(chǎn)養(yǎng)殖過程中利用噬菌體進(jìn)行弧菌疾病的治療，已經(jīng)在對(duì)蝦［9］、牡蠣［10］等水生動(dòng)物中得到了驗(yàn)證。Chen等［11］發(fā)現(xiàn)利用患病蝦的腸道和養(yǎng)殖廢水中的5種致病弧菌分離得到的5種新噬菌體，制成噬菌體組合物可以有效抑制致病菌的生長。有報(bào)道指出，養(yǎng)殖水體中引起對(duì)蝦感染發(fā)病的弧菌密度閾值為104 cfu/mL［12］，本研究中采用噬菌體制劑和杜仲葉提取物聯(lián)用的方式控制養(yǎng)殖水體的質(zhì)量，在日換水量減少了33.33%的情況下，并沒有導(dǎo)致養(yǎng)殖水體中弧菌含量的升高，且完全控制在引起對(duì)蝦感染發(fā)病的弧菌密度閾值范圍之內(nèi)。然而，當(dāng)停用了噬菌體制劑和杜仲葉提取物7 d后，各水池的平均弧菌含量上升到1.28×104 cfu/mL，對(duì)蝦感染弧菌的風(fēng)險(xiǎn)大大增加。在節(jié)水試驗(yàn)期間，凡納濱對(duì)蝦蝦體的弧菌含量得到明顯的控制，各養(yǎng)殖池也無明顯發(fā)病現(xiàn)象，說明噬菌體和杜仲葉提取物聯(lián)用可以在減少養(yǎng)殖換水量的情況下，保證凡納濱對(duì)蝦的健康生長。

杜仲葉提取物中的主要成分為綠原酸、丁香脂素雙糖苷、地普黃酮，具有殺菌抑菌和抗氧化作用，能消除動(dòng)物體內(nèi)過多的自由基，從而提高機(jī)體的非特異性免疫［13］。在凡納濱對(duì)蝦飼料中添加杜仲可以顯著提高凡納濱對(duì)蝦肌肉和內(nèi)臟團(tuán)的超氧化物歧化酶、過氧化氫酶的活性，并且相應(yīng)降低丙二醛值［14］。此外，在凡納濱對(duì)蝦的養(yǎng)殖過程中使用杜仲葉提取物還可以提高對(duì)蝦肝胰腺組織中的B細(xì)胞數(shù)量，提高對(duì)蝦肝胰腺的消化吸收能力［13］。本研究中，在凡納濱對(duì)蝦養(yǎng)殖前期減少日換水量的同時(shí)，8月6—20日連續(xù)向?qū)ξr日糧中加入杜仲葉提取物，8月12日和26日兩次打標(biāo)結(jié)果顯示，試驗(yàn)組的蝦體重為對(duì)照組的2倍，幼蝦階段的生長效果明顯提高。到養(yǎng)殖試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，試驗(yàn)組對(duì)蝦的增重率比對(duì)照組提高43.04%，推測(cè)可能是杜仲葉提取物對(duì)幼蝦肝胰腺和腸道的健康發(fā)育起到了重要的作用。

4 結(jié)論

在凡納濱對(duì)蝦工廠化換水養(yǎng)殖的前期（0～34 d），通過噬菌體制劑和杜仲提取物聯(lián)用可以有效控制水體中弧菌含量，保證凡納濱對(duì)蝦的健康生長，日換水量可減少33.33%，全程養(yǎng)殖結(jié)束時(shí)，凡納濱對(duì)蝦的增重率提高了40.40%。

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（收稿日期：2022-11-25；修回日期：2023-03-14）