豚鼠頻閃光誘導(dǎo)性近視和形覺剝奪性近視外側(cè)膝狀體多巴胺含量的比較

佘曼，李炳，李濤，吉順梅，鄭昌月，周曉東

(復(fù)旦大學(xué)附屬金山醫(yī)院，上海 201508)

Conflict of interest statement: We declare that we have no conflict of interest statement.

近視是眼軸長度與屈光力不匹配，導(dǎo)致物體成像于視網(wǎng)膜前的一種臨床常見的屈光不正，是眼科發(fā)病率最高的疾病[1]。生理狀態(tài)下，外界視覺信號到達視網(wǎng)膜光感受器后，經(jīng)過光電信號轉(zhuǎn)換，經(jīng)視神經(jīng)及視束傳遞到外側(cè)膝狀體(lateral geniculate nucleus, LGN)，再由外側(cè)膝狀體發(fā)出的纖維投射到初級視皮層(17區(qū))[2]。在這一完整視覺通路中，任何環(huán)節(jié)出現(xiàn)問題，都將影響最終的視覺感知[3]。其中，LGN越來越被視為處理視覺信息的“智能開關(guān)”，是中樞負責(zé)傳遞視覺信息的重要結(jié)構(gòu)[4]。然而，目前近視發(fā)病機制的研究主要集中于眼球內(nèi)的結(jié)構(gòu)，如視網(wǎng)膜、鞏膜等，很少涉及中樞外側(cè)膝狀體的研究。

形覺剝奪性近視(form deprivation myopia, FDM)和頻閃光誘導(dǎo)性近視(flickering light-induced myopia，F(xiàn)LM)是兩種不同的近視模型，研究表明神經(jīng)遞質(zhì)5-羥色胺在這兩種模型豚鼠視網(wǎng)膜的含量成相反趨勢，提示這兩種模型近視發(fā)病機制不同[5]。而多巴胺(dopamine, DA)是視網(wǎng)膜上另一重要的神經(jīng)遞質(zhì)，參與信號級聯(lián)控制著眼軸增長，對近視發(fā)生發(fā)展有重要作用[6]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)視網(wǎng)膜DA在FDM及FLM兩種模型含量不同。那么，不同的外界視覺信號通過視網(wǎng)膜傳遞到中樞LGN后，神經(jīng)遞質(zhì)DA含量有何變化，在這兩種不同的近視模型上又有何差別，這正是本實驗的研究目的?；诖吮尘?，本實驗通過比較FLM及FDM兩種近視模型LGN的DA含量變化，旨在對比中樞DA在這兩種近視模型中的作用，初步探索近視的中樞發(fā)病機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

普通級2周齡英國種短毛雄性三色豚鼠24只，屈光介質(zhì)透明，無眼部疾患或先天畸形，體重為90～110 g。來源于上海甲干生物科技有限公司【SCXK(滬)2015-0005】，飼養(yǎng)于上海市公共衛(wèi)生臨床中心【SYXK(滬)2015-0008】，飼養(yǎng)環(huán)境保持室溫24～26℃，相對濕度55%～65%。給予豚鼠充足飼料和飲水，并定期補充蔬果及維生素C。實驗遵循實驗動物3R原則。

1.2 實驗方法

1.2.1 頻閃光誘導(dǎo)性近視和形覺剝奪性近視模型的建立

24只豚鼠隨機分為3組(n=8)：①頻閃光誘導(dǎo)組(FLM組)，建模方法參照邸悅等[7]所用方法。②形覺剝奪組(FDM組)，豚鼠右眼遮蓋半透明眼罩，并確保不影響眼瞼正?；顒?，每天進行檢查[8]。③對照組，不予特殊處理，室內(nèi)采用周期12 h的正常光照。各組實驗周期均為8周。

1.2.2 眼球生物測量

在造模前及造模后第8周分別測量各組豚鼠右眼屈光度和眼軸長度，以造模后測量值減去造模前測量值之差作為各生物參數(shù)變化值。

(1)屈光度測量方法：測量前使用復(fù)方托吡卡胺滴眼液(參天制藥有限公司，中國)滴眼，每5 min一次，共滴4次，待瞳孔擴大后進行帶狀光檢影驗光(KJ6B，六六視覺，蘇州)，等效球鏡記為球鏡+1/2柱鏡，重復(fù)測量3次后取平均值作為該眼屈光度[9]。

(2)眼軸長度測量方法：使用Super SW1000眼科A超測量儀，A超頻率為11 MHz。測量前先用鹽酸奧布卡因滴眼液(參天制藥公司 中國)表面麻醉，然后將探頭垂直對準(zhǔn)角膜中心表面，不壓迫角膜，取穩(wěn)定清晰圖像，晶狀體后囊膜和視網(wǎng)膜雙峰均高于基線，每只眼測10次后取平均值，精確到0.01 mm。

1.2.3 高效液相色譜電化學(xué)檢測法

將豚鼠腹腔注射過量戊巴比妥鈉(0.2 mg/mL)安樂死后，迅速斷頭取腦，于冰上取左腦外側(cè)膝狀體，然后置于凍存管內(nèi)放于液氮中，待取材完畢后精密稱重，按1∶10體積加入勻漿液，冰上超聲勻漿。14 000 r/min轉(zhuǎn)速進行離心10 min，取上清液裝入離心管并保存于-80℃冰箱待測。

用HPLC-ECD檢測標(biāo)本中DA濃度：每份樣本取20 μL上清液注入38℃ Acclaim C18色譜柱(2.2 μm, 2.1 mm × 100 mm；Thermo Fisher Scientific)中，然后用磷酸鹽緩沖液流動相以0.2 mL/min流速進行分離,檢測室電壓設(shè)置+0.7 V，安全室電壓設(shè)置+0.75 V。所有數(shù)據(jù)均由ChemStation(安捷倫科技有限公司)進行采集和分析。通過與提前設(shè)定的已知標(biāo)準(zhǔn)進行比較得出峰值及相對濃度。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 FLM及FDM模型的建立

2.1.1 造模前三組豚鼠右眼生物參數(shù)

實驗造模前，三組豚鼠右眼屈光度、眼軸長度差異無顯著性(P=0.876，P=0.857)。(見表1)

表1 造模前3組豚鼠右眼生物參數(shù)Tab.1 Biological parameter values of the right eyes in the three groups before modeling

2.1.2 造模第8周，三組豚鼠右眼生物參數(shù)變化值

造模第8周，F(xiàn)DM組與對照組相比，右眼屈光度變化值、眼軸長度變化值差異有顯著性(P<0.001，P=0.008)；FLM組與對照組相比，右眼屈光度變化值、眼軸長度變化值差異有顯著性(P<0.001，P=0.026)。(見表2)

2.2 HPLC-ECD測量外側(cè)膝狀體中DA含量

8周造模結(jié)束后，三組豚鼠左腦外側(cè)膝狀體DA含量分別為：對照組(n=7，因外側(cè)膝狀體取材時操作失誤導(dǎo)致該數(shù)據(jù)流失)為(37.04±1.18)pg/μL；FDM組(n=8)為(24.27±3.46)pg/μL，與對照組相比差異有顯著性(P=0.021)；FLM組(n=8)為(45.58±1.98)pg/μL，與對照組相比差異有顯著性(P=0.01)。DA含量由高至低排列為：FLM組>對照組>FDM組。(見圖1)

表2 造模第8周三組豚鼠右眼生物參數(shù)變化值Tab.2 Changes of biological parameter values of the right eyes in the three groups after 8-week modeling

注：與對照組比較，**P<0.001，*P<0.05。

Note. Compared with the control group.**P<0.001 and*P<0.05.

注：*表示與對照組相比，P<0.05。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。圖1 對各組左腦外側(cè)膝狀體多巴胺含量進行定量分析Note. *P<0.05. All the data are expressed in (±s).Fig.1 Contents of dopamine in the left lateral geniculate nucleus of the three groups

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，頻閃光照及形覺剝奪兩種方法均能成功誘導(dǎo)出近視模型。FLM組LGN的DA含量升高，而FDM組DA含量減少，我們推測可能與這兩種近視模型的發(fā)病機制不同有關(guān)。

DA是腦內(nèi)重要的神經(jīng)遞質(zhì)，主要由腹側(cè)被蓋區(qū)和中腦黑質(zhì)致密體產(chǎn)生，再由這些區(qū)域發(fā)送擴散至腦內(nèi)不同區(qū)域。DA纖維投射至中樞大多數(shù)結(jié)構(gòu)如基底神經(jīng)節(jié)、大腦皮層、海馬、中腦和丘腦等[10]。而LGN則位于背側(cè)丘腦，負責(zé)將視網(wǎng)膜接收的視覺信息傳輸至視皮層，其細胞發(fā)育對異常視覺環(huán)境非常敏感[11]。來自視網(wǎng)膜鼻側(cè)的纖維交叉至對側(cè)，與顳側(cè)纖維共同形成視束，再通過神經(jīng)節(jié)細胞(RGC)的突觸傳入將視覺信號傳輸至LGN，視覺信息經(jīng)整合后再由丘腦皮層細胞發(fā)出纖維投射到初級視皮層(V1)，即構(gòu)成了RGC-丘腦皮層細胞-V1的完整視覺通路[12]。對于視覺中樞的研究，多數(shù)實驗都以此視覺通路作為研究對象，即對一側(cè)眼進行干預(yù)而研究對側(cè)中樞的變化[11, 13]。本實驗通過形覺剝奪及頻閃光誘導(dǎo)兩種方法，觀察造模后右眼的視覺變化，同時檢測左側(cè)LGN的DA含量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，通過頻閃光誘導(dǎo)和形覺剝奪誘導(dǎo)的兩種近視，其外側(cè)膝狀體DA變化呈相反趨勢，頻閃光照組外側(cè)膝狀體DA含量增多，而形覺剝奪組則DA減少，我們認為可能有以下幾方面原因。

一方面，F(xiàn)DM模型是通過單眼遮蓋或眼瞼縫合等方法使視網(wǎng)膜成像不清而引起近視[14]。本次實驗通過遮蓋豚鼠右眼，成功建立了FDM近視模型。建模過程中，由于單眼形覺剝奪可促進視網(wǎng)膜神經(jīng)末梢在外側(cè)膝狀體釋放谷氨酸鹽，提高NO濃度致使DNA斷裂，從而誘發(fā)外側(cè)膝狀體神經(jīng)元凋亡[15]。相似現(xiàn)象在兔外側(cè)膝狀體亦有報道[16]。因此我們推測FDM模型可能導(dǎo)致外側(cè)膝狀體多巴胺能神經(jīng)元凋亡增加，從而出現(xiàn)DA分泌減少的現(xiàn)象。同時，喬淑紅等[17]研究表明，與非剝奪眼相比，貓剝奪眼驅(qū)動的外側(cè)膝狀體細胞明顯變小，視網(wǎng)膜傳入纖維與LGN神經(jīng)元突觸聯(lián)系顯著減少。那么，LGN中DA水平下降可能因為形覺剝奪使視覺信息傳入減少，神經(jīng)沖動到達外側(cè)膝狀體的神經(jīng)末梢后，LGN中與其進行突觸連接的神經(jīng)元減少，再通過一系列的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)控，最終導(dǎo)致多巴胺能神經(jīng)元分泌的DA減少，但仍需進一步實驗證明。

另一方面，頻閃光照組LGN的DA含量較正常組增多。本次實驗采用二周齡豚鼠，飼養(yǎng)于亮1 s，暗1 s(頻率為0.5 Hz)的特殊頻閃光環(huán)境中。在其視覺形成的敏感期內(nèi)，頻閃異常光環(huán)境可能對中樞視覺加工產(chǎn)生重要影響。研究表明，DA可以調(diào)節(jié)視網(wǎng)膜到背外側(cè)膝狀體(dLGN)突觸傳遞的興奮性，減輕從視網(wǎng)膜到dLGN的興奮性突觸后電位(EPSC)，因此可以調(diào)節(jié)視網(wǎng)膜信號介導(dǎo)的dLGN神經(jīng)元的激發(fā)方式[18]。而豚鼠LGN同其他哺乳動物類似，包含背側(cè)核和腹側(cè)核。其中背側(cè)核體積大于腹側(cè)核，且只有背側(cè)核發(fā)出的纖維投射至視皮層[19]。因此我們認為豚鼠外側(cè)膝狀體DA水平增多的主要部位可能是背外側(cè)膝狀體，頻閃光環(huán)境導(dǎo)致的DA增加可能正是為了抑制dLGN突觸傳遞的興奮性。研究發(fā)現(xiàn)，采用微離子電滲透向貓外側(cè)膝狀體施加DA，能改變丘腦中間神經(jīng)元的視覺誘發(fā)反應(yīng)，從而影響丘腦的視覺信息加工[20]。激活LGN的D1受體可以抑制大鼠dLGN的中間神經(jīng)元活化[21]。而DA作用于LGN的D2受體則能促進GABA能中間神經(jīng)元的活化，從而間接抑制dLGN神經(jīng)元[22-23]。向兔靜脈注射DA受體非選擇性激動劑阿樸嗎啡可減輕dLGN對正弦光柵閃光點的反應(yīng)[24]。由此可見，DA可以調(diào)節(jié)視網(wǎng)膜到LGN突觸傳遞的興奮性。我們推測頻閃光信號由視網(wǎng)膜傳向LGN后，機體通過一系列調(diào)控反應(yīng)，上調(diào)LGN的DA水平，從而抗衡中間神經(jīng)元的過度興奮。

FDM是經(jīng)典且應(yīng)用廣泛的實驗性近視模型，而FLM作為較新建立的動物模型，其發(fā)病機制仍需進一步研究。本次實驗提示這兩種模型的近視形成機制可能不同，從而導(dǎo)致LGN的DA水平呈相反趨勢。在某種程度上，F(xiàn)DM是視覺信息傳入減少，而FLM是閃光刺激頻率增加，兩者通過不同的作用方式，最終均形成近視。由于DA對LGN神經(jīng)元的作用呈劑量依賴關(guān)系，高濃度DA抑制LGN神經(jīng)元對視覺信息的反應(yīng)，而低濃度則促進視覺反應(yīng)[22]。因此我們推測LGN的DA濃度需維持在一個平衡狀態(tài)，一旦外界視覺環(huán)境打破此平衡，都將可能導(dǎo)致近視，而這也正是我們課題組的研究重點。此外，LGN的多巴胺能神經(jīng)元形態(tài)及功能是否因此改變，初級視皮層與其又有何聯(lián)系，這是我們今后研究的另一重點，我們將繼續(xù)探索近視模型中DA對完整視覺通路的影響，從而為近視防治提供更多實驗證據(jù)。

References)

[1] 龍琴, 褚仁遠. 鞏膜細胞外基質(zhì)及基質(zhì)金屬蛋白酶在近視發(fā)展中作用的研究進展 [J]. 中華眼科雜志, 2005, 41(11): 1047-1049.

Long Q, Chu RY. Recent findings on scleral extracellular matrix and matrix metalloproteinases in the development of myopia [J]. Chin J Ophthalmol, 2005, 41(11): 1047-1049.

[2] 郝瑞, 趙堪興. 多巴胺在視覺發(fā)育中的作用 [J]. 國際眼科縱覽, 2009, 33(5): 295-298.

Hao R, Zhao KX. The role of dopamine in the development of vision[J]. Int Rev Ophthalmol, 2009, 33(5): 295-298.

[3] 周曉東, 李炳. 視覺認知與 [J]. 中國眼耳鼻喉科雜志, 2013, 13(5): 275-279.

Zhou XD, Li B. The relationshihp between visual cognition and myopia [J]. Chin J Ophthalmol Otorhinolaryngol, 2013, 13(5): 275-279.

[4] Tang J, Ardila Jimenez SC, Chakraborty S, et al. Visual receptive field properties of neurons in the mouse lateral geniculate nucleus [J]. Plos One, 2016, 11(1): e146017.

[5] Li B, Luo XM, Li T, et al. Effects of constant flickering light on refractive status, 5-HT and 5-HT2A receptor in guinea pigs [J]. Plos One, 2016, 11(12): e167902.

[6] 孫文峰, 楊景雷, 周翔天. 多巴胺在近視形成中作用的研究進展 [J]. 中華眼視光學(xué)與視覺科學(xué)雜志, 2015,17(6): 377-380.

Sun WF, Yang JL, Zhou XT. Advances in research on the role of dopamine in myopia [J]. Chin J Optom Opthalmol Vis Sci, 2015, 17(6): 377-380.

[7] 邸悅, 劉睿, 褚仁遠, 等. 頻閃光誘導(dǎo)光覺異常性豚鼠近視模型 [J]. 中國實驗動物學(xué)報, 2012, 20(04): 48-52.

Di Y, Liu R, Chun RY, et al. Establishment of a guinea pig model of light perception myopia induced by flickering light [J]. Acta Lab Anim Sci Sin, 2012, 20(04): 48-52.

[8] 李濤, 周曉東, 崔心瀚, 等. 豚鼠眼形覺剝奪后恢復(fù)期的生物學(xué)參數(shù)變化規(guī)律探討 [J]. 中國實驗動物學(xué)報, 2012, 20(06): 51-56.

Li Tao, Zhou XD, Cui XH, et al. Changes of ocular biometric parameters during the recovery from form-deprivation myopia in guinea pigs[J]. Acta Lab Anim Sci Sin, 2012(06):51-56.

[9] Durr NJ, Dave SR, Lage E, et al. From unseen to seen: tackling the global burden of uncorrected refractive errors [J]. Annu Rev Biomed Eng, 2014, 16: 131-153.

[10] Paletta L, Rome E, ed. Attention in Cognitive Systems. Theories and Systems from an Interdisciplinary Viewpoint [M]. Berlin: Springer-Verlag Berlin Heidelberg, 2007.4840, 352-366.

[11] 李靳, 劉向玲, 毛永, 等. 關(guān)鍵期內(nèi)反縫合治療前后單眼形覺剝奪性弱視大鼠模型外側(cè)膝狀體PSD-95的表達 [J]. 中國斜視與小兒眼科雜志, 2013, 21(3): 5-10.

Li J, Liu XL, Mao Y, et al. The expression of PSD-95 in the lateral geniculate nucleus of monocular form deprivation amblyopia rats before and after reverse suture treatment in the critical period [J].Chin J Strabismus Pediatr Ophthalmol, 2013, 21(3):5-10.

[12] Ghodrati M, Khaligh-Razavi SM, Lehky SR. Towards building a more complex view of the lateral geniculate nucleus: recent advances in understanding its role [J]. Prog Neurobiol, 2017, 156: 214-255.

[13] Zhao W, Bi A, Xu C, et al. GABA and GABA receptors alterations in the primary visual cortex of concave lens-induced myopic model [J]. Brain Res Bull, 2017,130: 173-179.

[14] Schaeffel F, Feldkaemper M. Animal models in myopia research [J]. Clin Exp Optometry, 2015, 98(6): 507-517.

[15] Nucci C, Piccirilli S, Nistico R, et al. Apoptosis in the mechanisms of neuronal plasticity in the developing visual system [J]. Eur J Ophthalmol, 2003, 13(Suppl 3): S36-S43.

[16] Nucci C, Piccirilli S, Bagetta G, et al. N-methyl-D-aspartate (NMDA) and non-NMDA glutamate receptor antagonists protect from apoptosis induced in the lateral geniculate nucleus of rabbits exposed to the dark [J]. Neurosci Lett, 1997, 229(3): 185-188.

[17] 喬淑紅, 劉彥, 遲煥芳. 剝奪性弱視貓外側(cè)膝狀體c-fos基因及Fos蛋白表達 [J]. 神經(jīng)解剖學(xué)雜志, 2006, 22(2): 192-198.

Qiao SH, Liu Y, Chi HF. The expression of fos protein and c-fos gene in lateral geniculate nucleus of cat after monocular deprivation [J]. Chin J Neuroanat, 2006, 22(2): 192-198.

[18] Govindaiah G, Cox CL. Depression of retinogeniculate synaptic transmission by presynaptic D2-like dopamine receptors in rat lateral geniculate nucleus [J]. Eur J Neurosci, 2006, 23(2): 423-434.

[19] Vaidya PG. A stydy of the lateral geniculate body in the diurnal ground souirrer, citellus tridecemlineatus tridecemlineatus and in the nocturnal guinea pig [J]. Anat Rec, 1963, 147: 499-505.

[20] Albrecht D, Quaschling U, Zippel U, et al. Effects of dopamine on neurons of the lateral geniculate nucleus: an iontophoretic study [J]. Synapse, 1996, 23(2): 70-78.

[21] Govindaiah G, Cox CL. Excitatory actions of dopamine via D1-like receptors in the rat lateral geniculate nucleus [J]. J Neurophysiol, 2005, 94(6): 3708-3718.

[22] Zhao Y, Kerscher N, Eysel U, et al. D1 and D2 receptor-mediated dopaminergic modulation of visual responses in cat dorsal lateral geniculate nucleus [J]. J Physiol, 2002, 539(Pt 1): 223-238.

[23] Munsch T, Yanagawa Y, Obata K, et al. Dopaminergic control of local interneuron activity in the thalamus [J]. Eur J Neurosci, 2005, 21(1): 290-294.

[24] Boumghar L, Marois A, Jolicoeur F J, et al. Apomorphine modifies the visual responses of cells in the rabbit’s lateral geniculate nucleus [J]. Can J Physiol Pharmacol, 1997, 75(7): 853-858.