金思維對東莨菪堿致記憶障礙小鼠腦膽堿能系統(tǒng)的影響

董云芳，馮慧利，陳芳，盛寧，任映，楊金鐸，時晶，田金洲，王蓬文,，*

(1. 北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院中醫(yī)內(nèi)科學(xué)教育部和北京市重點(diǎn)實驗室，北京 100700； 2. 北京中醫(yī)藥大學(xué)神經(jīng)變性病研究所，北京 100700)

Conflict of interest statement: We declare that we have no conflict of interest statement.

阿爾茨海默病 (Alzheimer’s disease, AD)是一種很常見的神經(jīng)變性疾病，以癡呆為主要特點(diǎn)，病情進(jìn)行性加重。 目前，全世界有患者4 700萬人，預(yù)計到2050年將超過1.31億人[1]。AD的病理特征是β-淀粉樣蛋白(beta-amyloid peptide, Aβ)的沉積和神經(jīng)原纖維物纏結(jié)(neurofibrillary tangles, NFTs)，神經(jīng)元缺失和神經(jīng)遞質(zhì)功能障礙等[2]。在臨床上，短期記憶的損傷和認(rèn)知功能逐漸減退是AD患者的首發(fā)癥狀之一。隨著患者病情逐漸惡化，開始表現(xiàn)出其他癥狀，包括長期記憶喪失、混亂、語言障礙、睡眠-覺醒周期紊亂、情緒波動、身體功能喪失甚至死亡。AD的發(fā)病機(jī)制非常復(fù)雜。中樞神經(jīng)系統(tǒng)的膽堿能神經(jīng)是構(gòu)成學(xué)習(xí)記憶的重要生物學(xué)和解剖學(xué)基礎(chǔ)，在20世紀(jì)70年代就發(fā)現(xiàn)AD腦內(nèi)膽堿能神經(jīng)元相對選擇性退變，目前多數(shù)學(xué)者認(rèn)為腦內(nèi)膽堿能系統(tǒng)的損害是造成AD的重要原因[3]。

中藥復(fù)方金思維 (a combination of Chinese herbs ginseng,Acorustatarinowii,Polygala, tuber Curcuma, and others, GAPT) 是由人參、淫羊藿、石菖蒲、肉蓯蓉、遠(yuǎn)志、郁金等中藥組成的，全方共奏補(bǔ)氣益腎、化痰活血的功效，臨床研究發(fā)現(xiàn)其可提高輕度AD患者的總體認(rèn)知功能，而且還可以改善患者的注意力[4]，實驗研究也發(fā)現(xiàn)金思維提取物對淀粉樣前體蛋白、糖原合成酶激酶3β和CaMKⅡ表達(dá)水平表達(dá)有影響[5-7]，但對直接關(guān)系到早期學(xué)習(xí)記憶能力的膽堿能系統(tǒng)的影響尚不清楚。因此，本實驗以東莨菪堿誘導(dǎo)建立記憶障礙模型，利用中藥復(fù)方金思維進(jìn)行干預(yù)，研究金思維對小鼠行為學(xué)及中樞膽堿能系統(tǒng)的影響，探討金思維的神經(jīng)保護(hù)作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

7周齡SPF級ICR小鼠108只，雄性，白色，體重33～35 g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，許可證號【SCXK(京)2012-0001】，倫理審批號：16-20。小鼠的飼養(yǎng)、給藥與取材均在北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院屏障環(huán)境動物室進(jìn)行【SYXK(京)2015-0001】。

1.1.2 試劑和儀器

中藥復(fù)方金思維(人參、淫羊藿、石菖蒲、肉蓯蓉、遠(yuǎn)志、郁金等)由北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院制備；鹽酸多奈哌齊(衛(wèi)材(中國)藥業(yè)有限公司，批號：140635)；氫溴酸東莨菪堿(產(chǎn)品批號：S1875)，購于美國Sigma公司；羧甲基纖維素鈉(Carboxymethyl cellulose sodium, CMC)(批號：3405005),購于北京精求化工有限責(zé)任公司；乙酰膽堿(Ach)測定試劑盒，乙酰膽堿酯酶(AchE)測試盒(貨號：A024)，膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶(ChAT)測試盒(貨號：A079-1)，均購于南京建成生物工程研究所；分光光度計(上海菁華科技有限公司)；Morris水迷宮實驗設(shè)備(上海移數(shù)信息科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 動物分組及給藥

除每天上午定時灌胃給藥以外，飼養(yǎng)期間動物自由攝食和飲水。通過SPSS 20.0統(tǒng)計軟件產(chǎn)生隨機(jī)數(shù)字，進(jìn)行隨機(jī)分組。將108只ICR小鼠隨機(jī)分為正常對照組(0.5% CMC)、模型組(0.5% CMC)、陽性對照組(多奈哌齊組)按照0.92 mg/(kg·d)的劑量，溶于0.5% CMC，金思維大、中、小劑量組按照20、10、5 mg/(kg·d)劑量，溶于0.5% CMC，每組18只，按0.1 mL/10 g小鼠體重連續(xù)灌胃給藥每天1次，共30 d。

1.2.2 造模方法

在末次小鼠灌胃1 h后造模，對照組腹腔注射生理鹽水，其余各組腹腔注射東莨菪堿 3 mg/(kg·d)，溶于0.9%生理鹽水，按0.1 mL/10 g小鼠體重腹腔注射。

1.2.3 Morris 水迷宮實驗

Morris 水迷宮檢測小鼠的游泳時間、游泳距離和目標(biāo)象限停留時間[8]。

1.2.4 小鼠皮層和海馬中Ach含量、AchE及ChAT活性的測定

小鼠灌胃1個月后，脫頸，于冰上快速剝離腦組織(除去小腦)，將其用預(yù)冷生理鹽水進(jìn)行沖洗以除去血跡，然后用濾紙拭干進(jìn)行稱重，用生理鹽水制成10%的腦組織勻漿，用低溫離心機(jī)以3000～4000 r/min離心10 min，取上清液。用比色法測定小鼠腦組織勻漿中乙酰膽堿(Ach)含量、乙酰膽堿酯酶(AchE)及膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶(ChAT)的活性。(具體實驗步驟按照測試盒說明書進(jìn)行)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 金思維對東莨菪堿致記憶障礙模型小鼠游泳距離的影響

從Morris水迷宮實驗的整體結(jié)果來看，從第1天到第5天，小鼠的游泳距離雖有波動，但均呈減少趨勢。模型組小鼠游泳距離與正常組相比，第1天至第5天差異均有顯著性(P<0.01)；第1天僅金思維大劑量組與模型組差異有顯著性(P<0.05)；第2天金思維大劑量組及中劑量組與模型組差異有顯著性(P<0.05或P<0.01)；從第3天開始各干預(yù)組游泳距離均明顯減少，各干預(yù)組與模型組比差異均有顯著性(P<0.05或P<0.01)(表1)。

2.2 Morris水迷宮實驗測試各組小鼠的游泳時間

從第1天到第5天的整體結(jié)果來看，各組小鼠的游泳時間呈減少的趨勢。模型組小鼠游泳時間與正常組相比，第1天至第5天差異均有顯著性(P<0.01)。第1天僅金思維中劑量組的游泳時間與模型組差異有顯著性(P<0.05)；第2天各干預(yù)組與模型組相比差異無顯著性(P>0.05)；第3、4、5天各干預(yù)組與模型組相比差異有顯著性(P<0.05或P<0.01)(表2)。

2.3 Morris水迷宮實驗測試各組小鼠目標(biāo)象限停留時間

在第6天Morris水迷宮空間探索實驗中，模型組目標(biāo)象限停留時間與正常組相比，差異有顯著性(P<0.01)。各干預(yù)組與模型組比差異有顯著性(P<0.01)，各干預(yù)組在目標(biāo)象限的停留時間明顯增長(表3)。

2.4 海馬和皮層Ach含量

從皮層Ach含量的生化檢測結(jié)果來看，模型組與正常組相比含量降低，兩者有差異(P<0.05)；金思維中劑量和小劑量組與模型組比，Ach含量增加，兩者差異有顯著性(P<0.05或P<0.01)；多奈哌齊組和金思維大劑量組與模型組相比差異無顯著性(P>0.05)。

表1 金思維對東莨菪堿致記憶障礙模型小鼠游泳距離的影響Tab.1 Effects of GAPT on swimming distance of the mice with scopolamine-induced memory impairment(±s, n =18)

注：與正常組相比，**P<0.01,*P<0.05；與模型組相比，△△P<0.01，△P<0.05。

Note. Compared with the normal group,**P<0.01,*P<0.05; compared with the model group,△△P<0.01,△P<0.05.

表2 金思維對東莨菪堿致記憶障礙模型小鼠游泳時間的影響Tab.2 Effects of GAPT on swimming time of the mice with scopolamine-induced memory impairment(±s, n=18)

注：與正常組相比，**P<0.01,*P<0.05；與模型組相比，△△P<0.01，△P<0.05。

Note. Compared with the normal group,**P<0.01,*P<0.05; compared with the model group,△△P<0.01,△P<0.05.

表3 金思維對東莨菪堿致記憶障礙模型小鼠目標(biāo)象限停留時間的影響Tab.3 Effects of GAPT on retention time in ttarget quadrant of the mice with scopolamine-induced memory

注：與正常組相比，**P<0.01,*P<0.05；與模型組相比，△△P<0.01，△P<0.05。

Note. Compared with the normal group,**P<0.01,*P<0.05; compared with the model group,△△P<0.01,△P<0.05.

從海馬Ach含量的生化檢測結(jié)果來看，模型組與正常組相比含量降低，兩者差異有顯著性(P<0.05)；多奈哌齊組與模型組相比差異無顯著性(P>0.05)；金思維大劑量和小劑量組與模型組比，Ach含量明顯增加，兩者差異有顯著性(P<0.01)；金思維中劑量組與模型組比，Ach含量增加，兩者差異有顯著性(P<0.05)。

同組小鼠皮層和海馬中Ach含量比較結(jié)果發(fā)現(xiàn)，只有正常組皮層和海馬中的Ach含量差異有顯著性(P=0.049)，其他各組小鼠皮層和海馬中Ach含量比較均差異無顯著性(P>0.05)(表4)。

表4 皮層和海馬中Ach含量及比較Tab.4 Comparison of the contents of Ach in the cortex and hippocampus(±s, n=8)

注：與正常組相比，**P<0.01,*P<0.05；與模型組相比，△△P<0.01，△P<0.05。

Note. Compared with the normal group,**P<0.01,*P<0.05; compared with the model group,△△P<0.01,△P<0.05.

2.5 海馬和皮層AchE活性

從皮層AchE活性的生化檢測結(jié)果來看，模型組與正常組相比活性增加，兩者差異有顯著性(P<0.01)；多奈哌齊組、金思維大劑量和中劑量組與模型組比AchE活性降低，差異有顯著性(P<0.05)；金思維小劑量組與模型組比AchE活性降低明顯，兩者間差異有顯著性(P<0.01)。

從海馬AchE活性的生化檢測結(jié)果來看，模型組與正常組相比活性增加，兩者差異有顯著性(P<0.01)；多奈哌齊組、金思維大劑量和中劑量組與模型組比AchE活性降低明顯，差異有顯著性(P<0.01)。

同組小鼠皮層和海馬中AchE活性比較結(jié)果發(fā)現(xiàn)，正常組皮層和海馬間、金思維小劑量組皮層和海馬間AchE活性差異無顯著性(P>0.05)；模型組、多奈哌齊組、金思維大、中劑量組皮層和海馬中AchE活性差異有顯著性(P<0.01)，且皮層中AchE活性高于海馬中AchE活性。(見表5)

2.6 海馬和皮層ChAT活性

從皮層ChAT活性的生化檢測結(jié)果來看，模型組小鼠ChAT活性低于正常組，兩者有差異(P<0.05)；各干預(yù)組皮層ChAT活性與模型組比差異無顯著性(P>0.05)。

從海馬ChAT活性的生化檢測結(jié)果來看，模型組小鼠ChAT活性明顯低于正常組，兩者差異有顯著性(P<0.01)；多奈哌齊組、金思維大、小劑量組與模型組比ChAT活性增加，差異有顯著性(P<0.05)；金思維中劑量組與模型組比ChAT活性差異有顯著性(P<0.01)。

同組小鼠皮層和海馬中ChAT活性比較結(jié)果發(fā)現(xiàn)，僅金思維大劑量組皮層和海馬中ChAT活性有差異(P<0.05)，且海馬中ChAT活性高于皮層中ChAT活性。(表6)

表5 皮層和海馬中AchE活性及比較Tab.5 Comparison of the AchE activity in the cortex and hippocampus(±s, n=8)

注：與正常組相比，**P<0.01,*P<0.05；與模型組相比，△△P<0.01，△P<0.05。

Note. Compared with the normal group,**P<0.01,*P<0.05; compared with the model group,△△P<0.01,△P<0.05.

表6 皮層和海馬中ChAT活性及比較Tab.6 Comparison of the activity of ChAT in the cortex and hippocampus(±s,n=8)

注：與正常組相比，**P<0.01,*P<0.05；與模型組相比，△△P<0.01，△P<0.05。

Note. Compared with the normal group,**P<0.01,*P<0.05; compared with the model group,△△P<0.01,△P<0.05.

3 討論

在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，膽堿能神經(jīng)元分布廣泛, 它們主要存在于脊髓、后腦、內(nèi)側(cè)韁核、中腦區(qū)、基底前腦、紋狀體和嗅結(jié)節(jié)等，幾乎所有的腦區(qū)都受膽堿能神經(jīng)元支配，所以膽堿能系統(tǒng)參與學(xué)習(xí)、記憶、應(yīng)激反應(yīng)、清醒和睡眠等重要的生理過程[9]。乙酰膽堿(acetylcholine, Ach)是所有膽堿能神經(jīng)元使用的神經(jīng)遞質(zhì)，其在外周和中樞神經(jīng)系統(tǒng)中具有非常重要的作用。主要功能是維持意識的清醒，促進(jìn)學(xué)習(xí)和記憶的改善[10]。Ach是在膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶(cholineacetyltransferase, ChAT)的催化作用下由膽堿乙酰輔酶A和膽堿合成的，Ach的分解靠乙酰膽堿酯酶(acetylcholinesterase, AchE)完成，ChAT和AchE共同維持Ach的穩(wěn)態(tài)[11]。因此Ach是已知的與學(xué)習(xí)記憶關(guān)系最密切的中樞神經(jīng)遞質(zhì)。ChAT在Ach的合成中具有重要的功能，其是分子量約為69 ×103的蛋白酶，主要位于膽堿能神經(jīng)末梢的細(xì)胞質(zhì)中[12]。AchE主要在腦和肌肉中表達(dá)。存在于腦中的AchE主要位于膽堿能系統(tǒng)中，是降解Ach的關(guān)鍵酶[13]。當(dāng)膽堿能神經(jīng)元被去極化時，Ach從突觸小泡胞吐并釋放到突觸間隙中，在突觸間隙中它可以活化mAchR和nAchR。存在于突觸間隙的Ach被AchE快速降解，釋放出膽堿和乙酸[14]，每個分子的AchE可以每秒水解5000分子的Ach，這使得AchE成為已知的最有效的酶之一[15]。

AD在膽堿能系統(tǒng)中的特征為在基底腦、海馬神經(jīng)元和大腦皮層中Ach含量不足、ChAT活性的降低和AchE活性的增加。早期研究發(fā)現(xiàn)嚴(yán)重癡呆患者皮質(zhì)中ChAT活性明顯降低，減少膽堿的吸收、Ach的釋放和基底前腦膽堿能神經(jīng)元的損失，證明AD患者皮層和海馬突觸前膽堿能缺陷。這些觀察結(jié)果表明ChAT可能對學(xué)習(xí)和記憶發(fā)揮重要的促進(jìn)作用。因此, ChAT活性下降可能在AD中扮演一個重要角色[16-17]。此外，AchE負(fù)責(zé)破壞腦中的Ach而導(dǎo)致記憶喪失和認(rèn)知缺陷，因此AchE活性的增加也在AD的進(jìn)展中扮演重要角色。直到現(xiàn)在AchEI也是治療輕、中度AD的主要藥物[18]。本實驗中分別針對皮層和海馬中Ach含量AchE和ChAT的活性進(jìn)行了生化檢測，這三者在膽堿能系統(tǒng)中對學(xué)習(xí)記憶發(fā)揮著重要的作用。因為Ach是維持意識清醒和促進(jìn)學(xué)習(xí)記憶的重要神經(jīng)遞質(zhì)，AchE和ChAT是Ach的水解酶和合成酶，共同調(diào)節(jié)Ach的代謝平衡，二者的活性代表了膽堿能神經(jīng)功能的狀態(tài)。金思維的重要組成藥物之一人參具有補(bǔ)脾益肺、安神益智的功效，人參皂苷是人參的有效活性成分，研究發(fā)現(xiàn)人參皂苷能使Ach的攝取和釋放增加，也有實驗證明人參皂苷可降低東莨菪堿所致的記憶障礙模型小鼠AchE的活性[19]。淫羊藿是補(bǔ)益類中藥, 黃酮類化合物、多糖、木脂素等為其主要化學(xué)成分。目前已證明淫羊藿苷可通過增加ChAT的活性，使Ach的合成增加改善學(xué)習(xí)記憶[20]。遠(yuǎn)志有安神益智、祛痰作用，研究證實遠(yuǎn)志對AD模型大鼠膽堿能系統(tǒng)損害有一定的保護(hù)作用[21]。

從本次實驗結(jié)果來看，金思維可以使東莨菪堿導(dǎo)致的記憶障礙模型小鼠皮層和海馬中Ach含量的增多、ChAT活性的增加和AchE活性的降低。所以金思維是通過減少AchE的活性使Ach的水解減少，通過增加ChAT的活性使Ach的合成增多達(dá)到改善膽堿能神經(jīng)功能的目的。正是因為金思維中含有多種中藥，很多研究也已表明多種中藥中的有效成分都對膽堿能系統(tǒng)有影響，這也說明了金思維對膽堿能系統(tǒng)是通過多靶點(diǎn)、多位點(diǎn)、多途徑來發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用，進(jìn)一步改善小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。Morris水迷宮實驗包括定位航行實驗和空間探索實驗，是檢測小鼠學(xué)習(xí)記憶能力最經(jīng)典的行為學(xué)實驗之一[22]，本實驗中金思維可以使東莨菪堿致記憶障礙模型小鼠的游泳距離和游泳時間變短，目標(biāo)象限停留時間增長，也說明了模型小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力有所改善。該模型從Ach結(jié)果來看對海馬和皮層都有影響，沒有差異，而AchE對海馬影響更大。因此，金思維對模型減低的Ach、ChAT和升高AchE的海馬和皮層的作用也不盡相同。AD疾病中海馬Ach、AchE、ChAT這三種物質(zhì)的作用更為重要，本次試驗中結(jié)果金思維大劑量組皮層Ach含量沒有顯著增多，金思維小劑量組海馬AchE活性沒有顯著降低，金思維大、中、小劑量組皮層ChAT活性沒有顯著增加，藥物沒有顯著的劑量依賴性，仍需以后的實驗中進(jìn)一步探索。

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