金思維對(duì)東莨菪堿致記憶障礙小鼠腦膽堿能系統(tǒng)的影響

董云芳，馮慧利，陳芳，盛寧，任映，楊金鐸，時(shí)晶，田金洲，王蓬文,，*

(1. 北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門(mén)醫(yī)院中醫(yī)內(nèi)科學(xué)教育部和北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100700； 2. 北京中醫(yī)藥大學(xué)神經(jīng)變性病研究所，北京 100700)

Conflict of interest statement: We declare that we have no conflict of interest statement.

阿爾茨海默病 (Alzheimer’s disease, AD)是一種很常見(jiàn)的神經(jīng)變性疾病，以癡呆為主要特點(diǎn)，病情進(jìn)行性加重。 目前，全世界有患者4 700萬(wàn)人，預(yù)計(jì)到2050年將超過(guò)1.31億人[1]。AD的病理特征是β-淀粉樣蛋白(beta-amyloid peptide, Aβ)的沉積和神經(jīng)原纖維物纏結(jié)(neurofibrillary tangles, NFTs)，神經(jīng)元缺失和神經(jīng)遞質(zhì)功能障礙等[2]。在臨床上，短期記憶的損傷和認(rèn)知功能逐漸減退是AD患者的首發(fā)癥狀之一。隨著患者病情逐漸惡化，開(kāi)始表現(xiàn)出其他癥狀，包括長(zhǎng)期記憶喪失、混亂、語(yǔ)言障礙、睡眠-覺(jué)醒周期紊亂、情緒波動(dòng)、身體功能喪失甚至死亡。AD的發(fā)病機(jī)制非常復(fù)雜。中樞神經(jīng)系統(tǒng)的膽堿能神經(jīng)是構(gòu)成學(xué)習(xí)記憶的重要生物學(xué)和解剖學(xué)基礎(chǔ)，在20世紀(jì)70年代就發(fā)現(xiàn)AD腦內(nèi)膽堿能神經(jīng)元相對(duì)選擇性退變，目前多數(shù)學(xué)者認(rèn)為腦內(nèi)膽堿能系統(tǒng)的損害是造成AD的重要原因[3]。

中藥復(fù)方金思維 (a combination of Chinese herbs ginseng,Acorustatarinowii,Polygala, tuber Curcuma, and others, GAPT) 是由人參、淫羊藿、石菖蒲、肉蓯蓉、遠(yuǎn)志、郁金等中藥組成的，全方共奏補(bǔ)氣益腎、化痰活血的功效，臨床研究發(fā)現(xiàn)其可提高輕度AD患者的總體認(rèn)知功能，而且還可以改善患者的注意力[4]，實(shí)驗(yàn)研究也發(fā)現(xiàn)金思維提取物對(duì)淀粉樣前體蛋白、糖原合成酶激酶3β和CaMKⅡ表達(dá)水平表達(dá)有影響[5-7]，但對(duì)直接關(guān)系到早期學(xué)習(xí)記憶能力的膽堿能系統(tǒng)的影響尚不清楚。因此，本實(shí)驗(yàn)以東莨菪堿誘導(dǎo)建立記憶障礙模型，利用中藥復(fù)方金思維進(jìn)行干預(yù)，研究金思維對(duì)小鼠行為學(xué)及中樞膽堿能系統(tǒng)的影響，探討金思維的神經(jīng)保護(hù)作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

7周齡SPF級(jí)ICR小鼠108只，雄性，白色，體重33～35 g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)【SCXK(京)2012-0001】，倫理審批號(hào)：16-20。小鼠的飼養(yǎng)、給藥與取材均在北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門(mén)醫(yī)院屏障環(huán)境動(dòng)物室進(jìn)行【SYXK(京)2015-0001】。

1.1.2 試劑和儀器

中藥復(fù)方金思維(人參、淫羊藿、石菖蒲、肉蓯蓉、遠(yuǎn)志、郁金等)由北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門(mén)醫(yī)院制備；鹽酸多奈哌齊(衛(wèi)材(中國(guó))藥業(yè)有限公司，批號(hào)：140635)；氫溴酸東莨菪堿(產(chǎn)品批號(hào)：S1875)，購(gòu)于美國(guó)Sigma公司；羧甲基纖維素鈉(Carboxymethyl cellulose sodium, CMC)(批號(hào)：3405005),購(gòu)于北京精求化工有限責(zé)任公司；乙酰膽堿(Ach)測(cè)定試劑盒，乙酰膽堿酯酶(AchE)測(cè)試盒(貨號(hào)：A024)，膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶(ChAT)測(cè)試盒(貨號(hào)：A079-1)，均購(gòu)于南京建成生物工程研究所；分光光度計(jì)(上海菁華科技有限公司)；Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)設(shè)備(上海移數(shù)信息科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組及給藥

除每天上午定時(shí)灌胃給藥以外，飼養(yǎng)期間動(dòng)物自由攝食和飲水。通過(guò)SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件產(chǎn)生隨機(jī)數(shù)字，進(jìn)行隨機(jī)分組。將108只ICR小鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組(0.5% CMC)、模型組(0.5% CMC)、陽(yáng)性對(duì)照組(多奈哌齊組)按照0.92 mg/(kg·d)的劑量，溶于0.5% CMC，金思維大、中、小劑量組按照20、10、5 mg/(kg·d)劑量，溶于0.5% CMC，每組18只，按0.1 mL/10 g小鼠體重連續(xù)灌胃給藥每天1次，共30 d。

1.2.2 造模方法

在末次小鼠灌胃1 h后造模，對(duì)照組腹腔注射生理鹽水，其余各組腹腔注射東莨菪堿 3 mg/(kg·d)，溶于0.9%生理鹽水，按0.1 mL/10 g小鼠體重腹腔注射。

1.2.3 Morris 水迷宮實(shí)驗(yàn)

Morris 水迷宮檢測(cè)小鼠的游泳時(shí)間、游泳距離和目標(biāo)象限停留時(shí)間[8]。

1.2.4 小鼠皮層和海馬中Ach含量、AchE及ChAT活性的測(cè)定

小鼠灌胃1個(gè)月后，脫頸，于冰上快速剝離腦組織(除去小腦)，將其用預(yù)冷生理鹽水進(jìn)行沖洗以除去血跡，然后用濾紙拭干進(jìn)行稱(chēng)重，用生理鹽水制成10%的腦組織勻漿，用低溫離心機(jī)以3000～4000 r/min離心10 min，取上清液。用比色法測(cè)定小鼠腦組織勻漿中乙酰膽堿(Ach)含量、乙酰膽堿酯酶(AchE)及膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶(ChAT)的活性。(具體實(shí)驗(yàn)步驟按照測(cè)試盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 金思維對(duì)東莨菪堿致記憶障礙模型小鼠游泳距離的影響

從Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)的整體結(jié)果來(lái)看，從第1天到第5天，小鼠的游泳距離雖有波動(dòng)，但均呈減少趨勢(shì)。模型組小鼠游泳距離與正常組相比，第1天至第5天差異均有顯著性(P<0.01)；第1天僅金思維大劑量組與模型組差異有顯著性(P<0.05)；第2天金思維大劑量組及中劑量組與模型組差異有顯著性(P<0.05或P<0.01)；從第3天開(kāi)始各干預(yù)組游泳距離均明顯減少，各干預(yù)組與模型組比差異均有顯著性(P<0.05或P<0.01)(表1)。

2.2 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)測(cè)試各組小鼠的游泳時(shí)間

從第1天到第5天的整體結(jié)果來(lái)看，各組小鼠的游泳時(shí)間呈減少的趨勢(shì)。模型組小鼠游泳時(shí)間與正常組相比，第1天至第5天差異均有顯著性(P<0.01)。第1天僅金思維中劑量組的游泳時(shí)間與模型組差異有顯著性(P<0.05)；第2天各干預(yù)組與模型組相比差異無(wú)顯著性(P>0.05)；第3、4、5天各干預(yù)組與模型組相比差異有顯著性(P<0.05或P<0.01)(表2)。

2.3 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)測(cè)試各組小鼠目標(biāo)象限停留時(shí)間

在第6天Morris水迷宮空間探索實(shí)驗(yàn)中，模型組目標(biāo)象限停留時(shí)間與正常組相比，差異有顯著性(P<0.01)。各干預(yù)組與模型組比差異有顯著性(P<0.01)，各干預(yù)組在目標(biāo)象限的停留時(shí)間明顯增長(zhǎng)(表3)。

2.4 海馬和皮層Ach含量

從皮層Ach含量的生化檢測(cè)結(jié)果來(lái)看，模型組與正常組相比含量降低，兩者有差異(P<0.05)；金思維中劑量和小劑量組與模型組比，Ach含量增加，兩者差異有顯著性(P<0.05或P<0.01)；多奈哌齊組和金思維大劑量組與模型組相比差異無(wú)顯著性(P>0.05)。

表1 金思維對(duì)東莨菪堿致記憶障礙模型小鼠游泳距離的影響Tab.1 Effects of GAPT on swimming distance of the mice with scopolamine-induced memory impairment(±s, n =18)

注：與正常組相比，**P<0.01,*P<0.05；與模型組相比，△△P<0.01，△P<0.05。

Note. Compared with the normal group,**P<0.01,*P<0.05; compared with the model group,△△P<0.01,△P<0.05.

表2 金思維對(duì)東莨菪堿致記憶障礙模型小鼠游泳時(shí)間的影響Tab.2 Effects of GAPT on swimming time of the mice with scopolamine-induced memory impairment(±s, n=18)

注：與正常組相比，**P<0.01,*P<0.05；與模型組相比，△△P<0.01，△P<0.05。

Note. Compared with the normal group,**P<0.01,*P<0.05; compared with the model group,△△P<0.01,△P<0.05.

表3 金思維對(duì)東莨菪堿致記憶障礙模型小鼠目標(biāo)象限停留時(shí)間的影響Tab.3 Effects of GAPT on retention time in ttarget quadrant of the mice with scopolamine-induced memory

注：與正常組相比，**P<0.01,*P<0.05；與模型組相比，△△P<0.01，△P<0.05。

Note. Compared with the normal group,**P<0.01,*P<0.05; compared with the model group,△△P<0.01,△P<0.05.

從海馬Ach含量的生化檢測(cè)結(jié)果來(lái)看，模型組與正常組相比含量降低，兩者差異有顯著性(P<0.05)；多奈哌齊組與模型組相比差異無(wú)顯著性(P>0.05)；金思維大劑量和小劑量組與模型組比，Ach含量明顯增加，兩者差異有顯著性(P<0.01)；金思維中劑量組與模型組比，Ach含量增加，兩者差異有顯著性(P<0.05)。

同組小鼠皮層和海馬中Ach含量比較結(jié)果發(fā)現(xiàn)，只有正常組皮層和海馬中的Ach含量差異有顯著性(P=0.049)，其他各組小鼠皮層和海馬中Ach含量比較均差異無(wú)顯著性(P>0.05)(表4)。

表4 皮層和海馬中Ach含量及比較Tab.4 Comparison of the contents of Ach in the cortex and hippocampus(±s, n=8)

注：與正常組相比，**P<0.01,*P<0.05；與模型組相比，△△P<0.01，△P<0.05。

Note. Compared with the normal group,**P<0.01,*P<0.05; compared with the model group,△△P<0.01,△P<0.05.

2.5 海馬和皮層AchE活性

從皮層AchE活性的生化檢測(cè)結(jié)果來(lái)看，模型組與正常組相比活性增加，兩者差異有顯著性(P<0.01)；多奈哌齊組、金思維大劑量和中劑量組與模型組比AchE活性降低，差異有顯著性(P<0.05)；金思維小劑量組與模型組比AchE活性降低明顯，兩者間差異有顯著性(P<0.01)。

從海馬AchE活性的生化檢測(cè)結(jié)果來(lái)看，模型組與正常組相比活性增加，兩者差異有顯著性(P<0.01)；多奈哌齊組、金思維大劑量和中劑量組與模型組比AchE活性降低明顯，差異有顯著性(P<0.01)。

同組小鼠皮層和海馬中AchE活性比較結(jié)果發(fā)現(xiàn)，正常組皮層和海馬間、金思維小劑量組皮層和海馬間AchE活性差異無(wú)顯著性(P>0.05)；模型組、多奈哌齊組、金思維大、中劑量組皮層和海馬中AchE活性差異有顯著性(P<0.01)，且皮層中AchE活性高于海馬中AchE活性。(見(jiàn)表5)

2.6 海馬和皮層ChAT活性

從皮層ChAT活性的生化檢測(cè)結(jié)果來(lái)看，模型組小鼠ChAT活性低于正常組，兩者有差異(P<0.05)；各干預(yù)組皮層ChAT活性與模型組比差異無(wú)顯著性(P>0.05)。

從海馬ChAT活性的生化檢測(cè)結(jié)果來(lái)看，模型組小鼠ChAT活性明顯低于正常組，兩者差異有顯著性(P<0.01)；多奈哌齊組、金思維大、小劑量組與模型組比ChAT活性增加，差異有顯著性(P<0.05)；金思維中劑量組與模型組比ChAT活性差異有顯著性(P<0.01)。

同組小鼠皮層和海馬中ChAT活性比較結(jié)果發(fā)現(xiàn)，僅金思維大劑量組皮層和海馬中ChAT活性有差異(P<0.05)，且海馬中ChAT活性高于皮層中ChAT活性。(表6)

表5 皮層和海馬中AchE活性及比較Tab.5 Comparison of the AchE activity in the cortex and hippocampus(±s, n=8)

注：與正常組相比，**P<0.01,*P<0.05；與模型組相比，△△P<0.01，△P<0.05。

Note. Compared with the normal group,**P<0.01,*P<0.05; compared with the model group,△△P<0.01,△P<0.05.

表6 皮層和海馬中ChAT活性及比較Tab.6 Comparison of the activity of ChAT in the cortex and hippocampus(±s,n=8)

注：與正常組相比，**P<0.01,*P<0.05；與模型組相比，△△P<0.01，△P<0.05。

Note. Compared with the normal group,**P<0.01,*P<0.05; compared with the model group,△△P<0.01,△P<0.05.

3 討論

在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，膽堿能神經(jīng)元分布廣泛, 它們主要存在于脊髓、后腦、內(nèi)側(cè)韁核、中腦區(qū)、基底前腦、紋狀體和嗅結(jié)節(jié)等，幾乎所有的腦區(qū)都受膽堿能神經(jīng)元支配，所以膽堿能系統(tǒng)參與學(xué)習(xí)、記憶、應(yīng)激反應(yīng)、清醒和睡眠等重要的生理過(guò)程[9]。乙酰膽堿(acetylcholine, Ach)是所有膽堿能神經(jīng)元使用的神經(jīng)遞質(zhì)，其在外周和中樞神經(jīng)系統(tǒng)中具有非常重要的作用。主要功能是維持意識(shí)的清醒，促進(jìn)學(xué)習(xí)和記憶的改善[10]。Ach是在膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶(cholineacetyltransferase, ChAT)的催化作用下由膽堿乙酰輔酶A和膽堿合成的，Ach的分解靠乙酰膽堿酯酶(acetylcholinesterase, AchE)完成，ChAT和AchE共同維持Ach的穩(wěn)態(tài)[11]。因此Ach是已知的與學(xué)習(xí)記憶關(guān)系最密切的中樞神經(jīng)遞質(zhì)。ChAT在Ach的合成中具有重要的功能，其是分子量約為69 ×103的蛋白酶，主要位于膽堿能神經(jīng)末梢的細(xì)胞質(zhì)中[12]。AchE主要在腦和肌肉中表達(dá)。存在于腦中的AchE主要位于膽堿能系統(tǒng)中，是降解Ach的關(guān)鍵酶[13]。當(dāng)膽堿能神經(jīng)元被去極化時(shí)，Ach從突觸小泡胞吐并釋放到突觸間隙中，在突觸間隙中它可以活化mAchR和nAchR。存在于突觸間隙的Ach被AchE快速降解，釋放出膽堿和乙酸[14]，每個(gè)分子的AchE可以每秒水解5000分子的Ach，這使得AchE成為已知的最有效的酶之一[15]。

AD在膽堿能系統(tǒng)中的特征為在基底腦、海馬神經(jīng)元和大腦皮層中Ach含量不足、ChAT活性的降低和AchE活性的增加。早期研究發(fā)現(xiàn)嚴(yán)重癡呆患者皮質(zhì)中ChAT活性明顯降低，減少膽堿的吸收、Ach的釋放和基底前腦膽堿能神經(jīng)元的損失，證明AD患者皮層和海馬突觸前膽堿能缺陷。這些觀察結(jié)果表明ChAT可能對(duì)學(xué)習(xí)和記憶發(fā)揮重要的促進(jìn)作用。因此, ChAT活性下降可能在AD中扮演一個(gè)重要角色[16-17]。此外，AchE負(fù)責(zé)破壞腦中的Ach而導(dǎo)致記憶喪失和認(rèn)知缺陷，因此AchE活性的增加也在AD的進(jìn)展中扮演重要角色。直到現(xiàn)在AchEI也是治療輕、中度AD的主要藥物[18]。本實(shí)驗(yàn)中分別針對(duì)皮層和海馬中Ach含量AchE和ChAT的活性進(jìn)行了生化檢測(cè)，這三者在膽堿能系統(tǒng)中對(duì)學(xué)習(xí)記憶發(fā)揮著重要的作用。因?yàn)锳ch是維持意識(shí)清醒和促進(jìn)學(xué)習(xí)記憶的重要神經(jīng)遞質(zhì)，AchE和ChAT是Ach的水解酶和合成酶，共同調(diào)節(jié)Ach的代謝平衡，二者的活性代表了膽堿能神經(jīng)功能的狀態(tài)。金思維的重要組成藥物之一人參具有補(bǔ)脾益肺、安神益智的功效，人參皂苷是人參的有效活性成分，研究發(fā)現(xiàn)人參皂苷能使Ach的攝取和釋放增加，也有實(shí)驗(yàn)證明人參皂苷可降低東莨菪堿所致的記憶障礙模型小鼠AchE的活性[19]。淫羊藿是補(bǔ)益類(lèi)中藥, 黃酮類(lèi)化合物、多糖、木脂素等為其主要化學(xué)成分。目前已證明淫羊藿苷可通過(guò)增加ChAT的活性，使Ach的合成增加改善學(xué)習(xí)記憶[20]。遠(yuǎn)志有安神益智、祛痰作用，研究證實(shí)遠(yuǎn)志對(duì)AD模型大鼠膽堿能系統(tǒng)損害有一定的保護(hù)作用[21]。

從本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，金思維可以使東莨菪堿導(dǎo)致的記憶障礙模型小鼠皮層和海馬中Ach含量的增多、ChAT活性的增加和AchE活性的降低。所以金思維是通過(guò)減少AchE的活性使Ach的水解減少，通過(guò)增加ChAT的活性使Ach的合成增多達(dá)到改善膽堿能神經(jīng)功能的目的。正是因?yàn)榻鹚季S中含有多種中藥，很多研究也已表明多種中藥中的有效成分都對(duì)膽堿能系統(tǒng)有影響，這也說(shuō)明了金思維對(duì)膽堿能系統(tǒng)是通過(guò)多靶點(diǎn)、多位點(diǎn)、多途徑來(lái)發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用，進(jìn)一步改善小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)包括定位航行實(shí)驗(yàn)和空間探索實(shí)驗(yàn)，是檢測(cè)小鼠學(xué)習(xí)記憶能力最經(jīng)典的行為學(xué)實(shí)驗(yàn)之一[22]，本實(shí)驗(yàn)中金思維可以使東莨菪堿致記憶障礙模型小鼠的游泳距離和游泳時(shí)間變短，目標(biāo)象限停留時(shí)間增長(zhǎng)，也說(shuō)明了模型小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力有所改善。該模型從Ach結(jié)果來(lái)看對(duì)海馬和皮層都有影響，沒(méi)有差異，而AchE對(duì)海馬影響更大。因此，金思維對(duì)模型減低的Ach、ChAT和升高AchE的海馬和皮層的作用也不盡相同。AD疾病中海馬Ach、AchE、ChAT這三種物質(zhì)的作用更為重要，本次試驗(yàn)中結(jié)果金思維大劑量組皮層Ach含量沒(méi)有顯著增多，金思維小劑量組海馬AchE活性沒(méi)有顯著降低，金思維大、中、小劑量組皮層ChAT活性沒(méi)有顯著增加，藥物沒(méi)有顯著的劑量依賴(lài)性，仍需以后的實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步探索。

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