自然衰老過程中SD大鼠免疫系統(tǒng)結構功能的變化

朱華，于品，徐艷峰，李彥紅，黃瀾，韓云林，秦川

(衛(wèi)生部人類疾病比較醫(yī)學重點實驗室，國家中醫(yī)藥管理局人類疾病動物模型三級實驗室，中國醫(yī)學科學院醫(yī)學實驗動物研究所，北京協(xié)和醫(yī)學院比較醫(yī)學中心,北京 100021)

Conflict of interest statement: We declare that we have no conflict of interest statement.

衰老是自然規(guī)律，目前的醫(yī)療水平無法阻止衰老進程，但通過了解衰老機制進而改善老化癥狀，提高老年人生活質量卻是可行的。中國已經進入老齡化社會，衰老進程中機體免疫系統(tǒng)的生物學特點及其機制是老年病學研究的重要組成部分。60年代初，Walford教授提出了衰老免疫學理論，免疫系統(tǒng)功能隨年齡增長逐步發(fā)育、成熟。進入老年階段，機體的免疫反應減弱，呈現(xiàn)出衰老狀態(tài)。免疫系統(tǒng)除了具有對體內外環(huán)境的反應和適應能力，還在細胞與分子水平參與細胞的生長、分化、發(fā)育和癌變，從根本上參與機體老化的全過程[1-2]。了解個體衰老過程中的病理生理特征，可以更好地闡述衰老與健康、疾病及長壽的關系，為研究衰老機制提供更多背景資料。本文以自然衰老的SD大鼠為研究對象，觀察免疫器官結構和功能的變化，探討免疫系統(tǒng)在自然衰老過程中的作用，為衰老研究提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

SPF級SD大鼠60只，雌雄各半，購自軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心【SCXK-(軍)2012-0012】，4～6周齡，雌性體重130～150 g，雄性體重150～170 g。

動物飼養(yǎng)在中國醫(yī)學科學院實驗動物研究所SPF隔離設施內【SYXK(京)2010-0030】。在符合國家標準的條件下飼養(yǎng)，保證晝夜節(jié)律，自由進食、飲水。待動物充分適應環(huán)境后，在符合動物福利的條件下進行實驗。

1.1.2 儀器和試劑

流式細胞儀：美國BD公司FACScan型。麻醉用戊巴比妥鈉，美國默克公司，貨號MerckP11011。免疫組化試劑：8-OHdG單抗，Abcam公司，貨號ab62623。二抗及 DAB 顯色劑為北京中杉金橋產品，貨號 PV-9001，ZLI-0001

1.2 方法

動物在飼養(yǎng)到6、12、18、24個月時，每組分別安樂10只動物，進行以下指標檢測。

1.2.1 淋巴細胞轉化實驗

大鼠用3%戊巴比妥鈉麻醉后股動脈放血處死，取脾細胞制作懸液，調節(jié)細胞濃度到2×106/mL，以ConA為刺激原體外培養(yǎng)5 d，3H-TdR摻入法檢測轉化能力。結果用刺激指數(shù)SI表示。SI=12、18、24月齡組/6月齡組。

1.2.2 T細胞亞群

取0.1 mL濃度為1×107/mL的淋巴細胞懸液，分別加入各10 μL的CD3、CD4、CD8單抗，充分混勻，4℃孵育30 min，用0.2 mmol/L，pH 7.4含1% FCS的PBS洗3次，上細胞儀進行檢測。激發(fā)波長488 nm，F(xiàn)ITC檢測光譜480～630 nm，計數(shù)800個/s細胞，總數(shù)20 000個細胞。實驗結果用LY-SIS II專業(yè)軟件進行分析。

1.2.3 NK細胞殺傷實驗

使用乳酸脫氫酶釋放法，取傳代培養(yǎng)24～48 h處于對數(shù)生長期的YAC-1細胞為靶細胞，用0.5%臺盼藍染色檢測細胞存活大于95%，調整細胞濃度至1×105/mL。大鼠脾細胞單個核細胞懸液為效應細胞，加Streptavidin標記的辣根過氧化物酶和底物，490 nm測定吸光光度值。根據(jù)被殺傷細胞釋放的LDH量判定NK細胞殺傷力。將12、18、24月齡細胞殺傷力與6月齡比較，得出相對殺傷率。

1.2.4 細胞因子檢測

動物安樂死后腹主動脈取血，離心取上清，用CBA法檢測血清中細胞因子IL-2、IL-6、IL-10、INF-γ和 GM-CSF(粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子)的變化。

1.2.5 超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)的檢測

樣品由北京中同藍博臨床檢測所檢測，均采用比色法。

1.2.6 組織病理學

動物安樂后取胸腺、脾，稱重后固定于4%多聚甲醛。組織經修塊，梯度酒精脫水，石蠟包埋，切片厚度5 μm，進行HE染色和DNA氧化損傷標志物8-OHdG單抗的免疫組化染色，光鏡下檢查。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 免疫功能變化

隨年齡增長大鼠淋巴細胞轉化能力降低，12、18、24月齡與6月齡比較差異有顯著性 (P<0.05，P<0.01)。CD4陽性T細胞數(shù)各月齡間差異無顯著性。CD8+T細胞數(shù)量隨年齡增長減少，12、18、24月齡與6月齡比較差異有顯著性(P<0.05，P<0.01)。脾細胞對NK靶細胞殺傷能力隨年齡增長而降低，12、18、24月齡與6月齡比較差異有顯著性 (P<0.05，P<0.01)(表1)。

2.2 細胞因子檢測

隨年齡增長，SD大鼠血清中IL-2含量降低，18、24月齡開始差異有顯著性(P<0.05)。IL-6、IL-10含量逐漸升高，24月齡時差異有顯著性(P<0.05)。IL-4，INF-γ，GM-CSF含量未見明顯改變(表2)。

表1 自然衰老SD大鼠免疫功能變化Tab.1 Functional changes of immune function in the natural aging SD rats

注：與6月齡比較，*P<0.05，**P<0.01。

Note. Compared with the young SD rats,*P<0.05，**P<0.01.

表2 自然衰老SD大鼠血清中細胞因子含量Tab.2 Serum levels of cytokines in the natural aging SD rats

注：與6月齡比較，*P<0.05，**P<0.01。

Note. Compared with the young SD rats,*P<0.05，**P<0.01.

2.3 SOD和MDA的變化

動物血清中SOD 含量隨年齡增長而降低，18個月開始差異有顯著性 (P<0.05)，24個月差異有極顯著性(P<0.01)。MDA含量隨年齡增長持續(xù)上升，18個月差異有顯著性(P<0.05)，24個月差異有極顯著性(P<0.01)(表3)。

2.4 組織病理學

2.4.1 臟器系數(shù)

脾的臟器系數(shù)各年齡組間差異無顯著性。隨年齡增長，動物胸腺逐漸萎縮。18、24月齡時臟器系數(shù)與6月齡比較差異有顯著性(P<0.05)。見表4。

表3 自然衰老SD大鼠血清中SOD和MDA的含量Tab.3 Serum levels of SOD and MDA in the natural aging SD rats

注：與6月齡比較，*P<0.05，**P<0.01。

Note. Compared with the young SD rats,*P<0.05，**P<0.01.

表4 自然衰老SD大鼠免疫器官臟器系數(shù)Tab.4 Immune organ coefficients of the natural aging SD rats

注：與6月齡比較，*P<0.05。

Note. Compared with the young SD rat,*P<0.05.

注：A. 12月齡大鼠胸腺輕度萎縮(HE)；B. 12月齡大鼠胸腺中度萎縮(HE)；C. 6月齡大鼠8-OHdG免疫組化染色(IHC)；D. 18月齡大鼠胸腺中度萎縮(HE)，被膜脂肪生成；E. 24月齡大鼠重度萎縮(HE)，被膜脂肪生成；F. 18月齡大鼠8-OHdG免疫組化染色(IHC staining)。圖1 自然衰老SD大鼠胸腺組織病理學(×100)Note. A. Mild thymic atrophy in a 12-month old rat. B. Moderate thymic atrophy in a 12-month old rat (HE staining). C. Immunohistochemical staining of 8-OHdG in a 18-month old rat (IHC staining). D. Moderate thymic atrophy in a 18-month old rat and subcapsular fat formation (HR staining). E. Severe thymic atrophy in a 24-month old rat and subcapsular fat formation (HE staining). F. Immunohistochemical staining of 8-OHdG+ in a 18-month old rat.Fig.1 Histopathological changes of the thymus of the aging SD rats(×100)

2.4.2 胸腺組織病理學變化

動物 6月齡時胸腺被膜完整，皮質較厚，皮質、髓質間界限清晰。

皮質內淋巴細胞密集排列，髓質呈斑點狀散在。動物隨年齡增長，胸腺皮質萎縮開始出現(xiàn)萎縮，12月齡2/10例輕度萎縮，18月齡3/10例輕度萎縮，2/10例中度度萎縮。24月齡3/10例輕度萎縮，4/10例中度萎縮，1/10例重度萎縮。皮質區(qū)被膜處脂肪細胞生成，皮、髓質比例減小。(見圖1)

2.4.3 脾的組織病理學變化

6月齡大鼠脾組織結構清晰，紅髓、白髓及邊緣區(qū)清晰，淋巴細胞密度大。隨年齡增長，邊緣區(qū)增寬，淋巴濾泡不規(guī)則，髓外造血增多。12月齡大鼠3/10例白邊緣區(qū)輕度增寬，2/10例紅髓髓竇中度擴張，1/10例紅髓髓竇輕度擴張。18月齡大鼠1/10例白髓邊緣區(qū)中度增寬，2/10例紅髓髓竇中度擴張，3/10例髓外中度造血增多。24月齡動物1/10例淋巴濾泡萎縮。1/10例白髓淋巴濾泡重度萎縮，1/10例重度髓外造血增多。(見圖2)

注：A. 6月齡大鼠脾，組織結構清晰(HE)；B. 12月齡SD大鼠髓外造血增多(HE)；C. 12月齡大鼠8-OHdG免疫組化染色(IHC)；D. 18月齡大鼠白髓輕度萎縮，淋巴細胞減少(HE)；E. 24月齡大鼠白髓萎縮，淋巴細胞減少(H.E)；F. 紅髓區(qū)的8-OHdG+細胞(IHC)。圖2 自然衰老SD大鼠脾組織病理學(×100)Note. A. The normal spleen of a 6-month old rat (HE staining). B. Extramedullary hemopoieisis increased in the spleen of a 12-month old rat (HE staining). C. Immunohistochemical staining of 8-OHdG in a 12-month old rat (IHC staining). D. Mild white pulp atrophy in a 18-month old rat, showing a decreased number of lymphocytes (HE staining). E. White pulp atrophy in a 24-month rat, with a decreased number of lymphocytes (HE staining). F. Immunohistochemical staining of 8-OHdG in a 12-month old rat.Fig.2 Histopathological changes of the spleen of the aging SD rats(×100)

2.4.4 免疫組化結果

8-OHdG陽性細胞呈散在或簇狀分布，著色程度由棕褐色到淺棕色，深淺不一。說明淋巴細胞的氧化程度不同，且與未氧化細胞共同存在。脾中8-OHdG陽性細胞主要成簇分布于紅髓區(qū)，白髓區(qū)較少，邊緣區(qū)幾乎無陽性細胞存在。胸腺中陽性細胞主要存在于髓質中，從皮質到髓質陽性細胞逐漸增多。(見圖1，2)

3 討論

衰老的免疫學說認為隨年齡增長機體的免疫系統(tǒng)功能逐漸下降，而細胞免疫功能的衰退是重要原因。主要表現(xiàn)為對病原體識別能力下降，對外來抗原反應性降低。T淋巴細胞是免疫系統(tǒng)調控疾病及機體狀態(tài)的主要效應細胞，研究證明T淋巴細胞免疫功能失調是免疫衰老的重要特征之一[3]。有文獻報道老年和青年免疫力間的差別主要在能激活的T細胞數(shù)量減少、功能減低。老年人體內具有免疫功能的T細胞數(shù)量只有青年人的50%～80%，而且T細胞亞群的調節(jié)功能也發(fā)生變化[4-5]。衰老所導致的免疫力衰退使體內細胞因子如IL-2等的含量也發(fā)生明顯變化[6]。IL-2主要由活化的CD4+Th1細胞產生，可促進Th0和CTL的增殖，也參與抗體反應、造血和腫瘤監(jiān)視，是調控免疫應答的重要因子[7]。而另一些細胞因子如IL-6等產生增多[8]。我們的結果顯示，18月齡SD大鼠已出現(xiàn)CD4/CD8細胞比例的平衡失調(P<0.01)，具有殺傷功能的CD8陽性T細胞數(shù)量減少(P<0.01)，NK細胞對靶細胞的殺傷能力減弱(P<0.05)。脾T細胞對ConA刺激的反應性逐漸減弱，增殖能力明顯下降(P<0.01)，誘導IL-2生成的能力也相應顯著降低，血清中IL-2含量減少(P<0.05)，與報道相符。其可能的機制是老齡動物在信號傳導方面存在缺陷，T細胞表面絲裂原受體的表達隨年齡增長而減少，使絲裂原刺激淋巴細胞后Ca2+動員能力下降，cGMP水平降低，導致早期活化信號的傳導受到抑制，IL-2生成減少[6,9]。

現(xiàn)代免疫學理論體系中，認為來自骨髓的前體胸腺細胞在從皮質向髓質遷移的過程里，通過與胸腺中撫育細胞的接觸，并受到局部細胞分泌的細胞因子和胸腺肽等激素的刺激，分化成熟成為具有不同功能的T淋巴細胞亞群[10-11]。機體在衰老過程中，骨髓中始祖T細胞的遷移、分化能力均下降，最終導致胸腺細胞數(shù)量減少，胸腺萎縮，臟器系數(shù)減小(P<0.05)。HE染色結果顯示，自然衰老SD大鼠胸腺的皮質厚度逐漸變薄，說明不成熟前體T細胞隨年齡增長逐漸減少，與報道結果相符。

脾的組織學變化也反映了機體免疫功能的改變：作為機體接受抗刺激后產生免疫應答的場所之一，青中齡SD大鼠脾小梁、被膜等結締組織較少，柔軟性較好，脾小結內分化活躍的B細胞數(shù)量多，因而免疫應答能力強。邊緣區(qū)作為脾臟-血液淋巴細胞再循環(huán)的通道，主要作用是隨時動員有免疫活性的淋巴細胞，因此青年大鼠白髓結構清晰，邊緣區(qū)明顯，淋巴細胞密度高。老齡大鼠，由于細胞免疫功能降低，體液免疫功能代償性增強，導致脾小結中生發(fā)中心發(fā)達，白髓結構不規(guī)則，發(fā)生偏移，淋巴細胞松散分布。髓外造血是肝、脾、淋巴結等器官在疾病或骨髓代償功能不足時恢復胚胎時期造血功能的一種病理生理現(xiàn)象。實驗結果顯示，隨年齡增長可見SD大鼠脾髓外造血現(xiàn)象明顯增多，提示衰老大鼠的造血功能已出現(xiàn)障礙。免疫組化結果顯示自然衰老過程中細胞內DNA的氧化損傷與其生存時間相關，從側面印證了DNA氧化損傷具有累積性。

綜上所述，本文通過對自然衰老SD大鼠免疫器官結構和功能的系統(tǒng)觀察，提示免疫系統(tǒng)的增齡性退化與其氧化損傷的累積有一定關系，為衰老免疫損傷學說提供了實驗依據(jù)。

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