雌、孕激素對牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞αvβ3體外誘導(dǎo)差異表達(dá)的影響

詹同彤，潘興乾，王彥平，楊健，陳超磊，麻柱，劉林，倪和民 王相國，齊曉龍，盛熙暉，劉云海，郭勇*

(1. 北京農(nóng)學(xué)院動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，北京 102206； 2. 北京奶牛中心，北京 100020)

Conflict of interest statement: We declare that we have no conflict of interest statement.

已知哺乳動物胚胎著床失敗，大約有1/3是由于胚胎質(zhì)量低劣所造成，另有2/3則由于子宮內(nèi)膜容受性不足所引起[1]。動物早期胚胎在植入前與子宮之間會有一個識別的過程。擁有著床能力、正常發(fā)育的胚胎必須同處于接受胚胎到來狀態(tài)的子宮在時空上保持完全一致，著床才能順利進(jìn)行并起始正常妊娠[2-3]。子宮內(nèi)膜容受態(tài)的建立過程涉及多種基因的表達(dá)，如白血病抑制因子(LIF)、表皮生長因子(EGF)、粘蛋白1(MUC-l)、整合素(integrin)、Hoxa10和Hoxa11基因等，這些調(diào)控基因能與早期胚胎在特定時、空上完成同步表達(dá)，使激活態(tài)的胚胎與處于容受態(tài)的子宮進(jìn)行“精確對話”。

整合素有調(diào)控著床和囊胚侵入的功能最早是在人類的子宮內(nèi)膜實驗中發(fā)現(xiàn)的[4-6]，之后逐漸在綿羊和豬的子宮內(nèi)膜細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了整合素的表達(dá)[7-8]。人們發(fā)現(xiàn)整合素的部分亞型在人子宮內(nèi)膜細(xì)胞中均存在不同程度的表達(dá)，其中，整合素αvβ3的表達(dá)量會隨著子宮容受態(tài)的建立而顯著上升[9-11]。2002年，MacIntyre等[12]的研究表明整合素表達(dá)于植入期牛子宮胚胎的界面及整個妊娠期的胎盤。Zeiler等[13]在研究中證實牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞可表達(dá)整合素αvβ3。雖然在反芻動物子宮內(nèi)膜細(xì)胞中檢測到了整合素，但對其表達(dá)規(guī)律和功能機(jī)制尚不明確，因此，其是否是子宮容受態(tài)的標(biāo)志還有待進(jìn)一步研究。

孕激素(P4)和雌激素(雌二醇，E2)在調(diào)控子宮內(nèi)膜容受態(tài)和胚胎發(fā)育同步化的過程中各自發(fā)揮作用且彼此相互協(xié)調(diào)。排卵前有足夠的雌激素起到刺激性作用以及排卵后孕激素調(diào)節(jié)容受性相關(guān)因子的表達(dá)，是建立子宮內(nèi)膜容受性的必要條件[14-15]。研究證實，孕激素通過自分泌途徑直接作用于子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞的孕激素受體PR，從而促進(jìn)整合素 αvβ3 的表達(dá)；通過旁分泌途徑間接地刺激下游基因轉(zhuǎn)錄，誘導(dǎo)產(chǎn)生EGF或HB-EGF；EGF或HB-EGF再作用于子宮內(nèi)膜上皮中各自相應(yīng)受體，產(chǎn)生整合素αvβ3及其配體OPN[16]。已有研究表明，孕激素對子宮內(nèi)膜表達(dá)整合素有誘導(dǎo)性作用，而雌激素則相反[17]。此外，孕激素在調(diào)控子宮內(nèi)膜整合素αvβ3及OPN的表達(dá)，比雌激素對二者的調(diào)控更具有重要的作用[18]。

整合素αvβ3基因在反芻動物子宮內(nèi)膜容受性調(diào)節(jié)中的研究較少，對其表達(dá)調(diào)控機(jī)理尚不明了。因此本實驗主要研究目的是在孕激素、雌激素單獨或相互協(xié)同下，分析子宮上皮中整合素αvβ3基因體外誘導(dǎo)差異表達(dá)的變化及作用機(jī)制，探討孕激素、雌激素、整合素αvβ3在牛子宮容受態(tài)中的聯(lián)系及表達(dá)意義，為牛子宮容受態(tài)提供體外研究模型，也為整合素αvβ3是否能作為牛子宮容受態(tài)標(biāo)記基因提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 子宮組織

本實驗選取荷斯坦奶牛子宮組織，取自河北省大廠縣屠宰場。子宮離體后清洗干凈，于37℃的生理鹽水中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 試劑與儀器

Gibco公司：基礎(chǔ)培養(yǎng)液 DMEM-F12、胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)、磷酸緩沖液DPBS；Sigma公司：胰蛋白酶(TE)、TritonX-100、水溶性孕酮、雌二醇；Abcam?公司：角蛋白一抗、熒光二抗；北京百泰克生物技術(shù)有限公司：2× power Taq PCR MasterMix；北京化工廠：氯仿、異丙醇、無水乙醇。

二氧化碳培養(yǎng)箱(Thermo Scientific Forma 371)、4孔板；Olympus公司：倒置顯微鏡；北京百晶生物：電泳槽、電泳儀電源；Bratt：手掌離心機(jī)；西德：電子天平。

1.2 方法

1.2.1 牛子宮內(nèi)膜組織的分離、原代培養(yǎng)

實驗動物屠宰后，采集子宮時要注意進(jìn)行無菌操作。在操作間里，反復(fù)清洗牛子宮至無血水。選取一段子宮角，展開后用鑷子等器械剝離出含有脂肪的子宮內(nèi)膜層，剔除脂肪并得到薄且透明的組織，剪成糜狀后反復(fù)清洗組織懸液數(shù)次。

取少量懸液將其均勻接種至6 cm的培養(yǎng)皿中，搖勻盤中的組織塊，加入適量的 DMEM-F12(20 %FBS)濕潤組織塊，最后在37℃、濃度為5%的CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。每天應(yīng)細(xì)心察看器皿中有組織塊的區(qū)域，保證每48 h等量換液。

1.2.2 牛子宮內(nèi)膜細(xì)胞傳代培養(yǎng)與純化

細(xì)胞長到90%左右時，用胰酶進(jìn)行消化傳代。先吸去培養(yǎng)液，用DPBS清洗，后加入1 mL胰酶，放入培養(yǎng)箱中消化10～15 min，當(dāng)在顯微鏡下發(fā)現(xiàn)細(xì)胞變圓時加入DMEM-F12(10% FBS)培養(yǎng)液終止消化。隨后移入1.5 mL EP 管中離心，離心后傳到新的培養(yǎng)皿中，放入培養(yǎng)箱，每48 h換一次培養(yǎng)液。

采用差時消化的方法進(jìn)行純化。先吸去培養(yǎng)液，用DPBS清洗，加入胰酶，當(dāng)細(xì)胞變圓、漂浮時，加入DMEM-F12(10% FBS)培養(yǎng)液終止消化。棄去液體，再加入新鮮培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，每48 h換一次培養(yǎng)液?？筛鶕?jù)細(xì)胞的生長情況進(jìn)行多次純化，直到子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞純度較高時即可。

1.2.3 牛子宮內(nèi)膜細(xì)胞的凍存與復(fù)蘇

子宮內(nèi)膜培養(yǎng)中可選擇凍存?zhèn)溆?。凍存過程的消化過程同上，離心后加入凍存液，并轉(zhuǎn)入凍存管中。在4℃冰箱中放10 min，-20℃中放20 min，-80℃過夜，第二天放入液氮罐中長期保存。

進(jìn)行細(xì)胞復(fù)蘇時應(yīng)先將水溫度調(diào)至37℃，將細(xì)胞從液氮罐中取出后在空中輕晃凍存管約10 s，隨后放入水浴鍋中。待液體融化后移入1.5 mL EP管中離心，離心后加入新鮮的DMEM-F12 (10% FBS)培養(yǎng)液，混勻接種到四孔板中。當(dāng)子宮內(nèi)膜細(xì)胞鋪滿約80%時即可進(jìn)行后續(xù)實驗。若細(xì)胞培養(yǎng)過程中成纖維細(xì)胞長得較多時，則要進(jìn)行純化處理。

1.2.4 不同濃度孕酮、雌激素、以及孕酮與雌激素協(xié)同作用下子宮內(nèi)膜細(xì)胞的收集與保存

外源性添加孕酮濃度選取10-5、10-6、10-7、10-8、10-9、10-10mg/mL；外源性添加雌激素濃度選取10-8、10-9、10-10、10-11、10-12mg/mL；外源性添加雌、孕激素時選取10-7mg/mL孕激素和10-10mg/mL雌激素。

在實驗前，子宮內(nèi)膜細(xì)胞需要無血清饑餓48 h，再用不含血清且有不同濃度孕酮、不同濃度雌二醇、以及含有10-7mg/mL孕酮和10-10mg/mL雌二醇的DMEM-F12培養(yǎng)24 h。棄去廢液，用DPBS清洗，細(xì)胞消化后移入新的EP管中，-80℃保存待提RNA。

1.2.5 子宮內(nèi)膜細(xì)胞總RNA的提取及相關(guān)基因表達(dá)的檢測

實驗引物由英濰捷基公司合成，引物相關(guān)參數(shù)見表1。子宮內(nèi)膜細(xì)胞總RNA的提取后以20 μL M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系，按照總RNA 1 μg反轉(zhuǎn)錄體系添加所需物質(zhì)合成cDNA，PCR擴(kuò)增后電泳，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察，拍照。

1.3 數(shù)據(jù)分析和統(tǒng)計學(xué)分析

用Image J軟件對膠圖進(jìn)行灰度值分析，并用SPSS 22.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，P<0.05代表數(shù)據(jù)間差異有顯著性。

表1 引物相關(guān)參數(shù)Tab.1 Parameters of the primers

2 結(jié)果

2.1 正常傳代牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞

應(yīng)用組織塊培養(yǎng)法對牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞進(jìn)行原代培養(yǎng)(圖1A)。由于原代培養(yǎng)的子宮細(xì)胞中含有成纖維細(xì)胞，所以需要對其進(jìn)行純化處理。圖1B中箭頭所指為多次純化后的牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞，如圖可見，細(xì)胞形態(tài)較好，可肉眼看見大理石紋的上皮細(xì)胞，而且數(shù)量在不斷增多，可進(jìn)行后續(xù)實驗。

2.2 不同濃度孕酮誘導(dǎo)牛子宮內(nèi)膜細(xì)胞中整合素αvβ3的差異表達(dá)

在有外源性孕激素添加時，整合素αvβ3的mRNA表達(dá)量均有不同程度的提高，且均在10-7mg/mL時達(dá)到最高(圖2，P<0.05)。

2.3 不同濃度雌激素誘導(dǎo)牛子宮內(nèi)膜細(xì)胞中整合素αvβ3的差異表達(dá)

隨著外源性雌激素濃度的添加，αv的mRNA表達(dá)量不斷增加，在10-10mg/mL時表達(dá)量最高(圖3 A和B，P<0.05)；β3的表達(dá)量逐漸降低，其中在10-10mg/mL時表達(dá)量最低(圖3 A和C，P<0.05)。

2.4 孕酮與雌激素共同誘導(dǎo)牛子宮內(nèi)膜細(xì)胞中整合素αvβ3的差異表達(dá)

在有外源性10-7mg/mL孕激素和10-10mg/mL雌激素添加時，整合素αv的mRNA表達(dá)量顯著高于對照組(圖4 A和B,P<0.05)；整合素β3的mRNA表達(dá)量亦高于對照組，但差異無顯著性(圖4 A和C,P>0.05)。

注：A：原代牛子宮內(nèi)膜培養(yǎng)第5天；B：純化后的傳代牛子宮內(nèi)膜細(xì)胞。圖1 組織塊培養(yǎng)法獲得的牛子宮內(nèi)膜細(xì)胞(4×10)Note. A. A piece of primary bovine endometrial tissue was cultured for 5 days. B. Purified bovine endometrial cells after passage.Fig.1 Bovine endometrial cells obtained by explant culture (4×10)

注：A: αv、β3 和β-actin RT-PCR 檢驗結(jié)果; B: αv 相對于β-actin 灰度分析; C: β3 相對于β-actin 灰度分析。不同字母表示差異有顯著性(P<0.05)。圖2 不同濃度孕激素誘導(dǎo)牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞中 αv、β3、β-actin 的 mRNA 差異表達(dá)Note. A. The mRNA expressions of αv, β3 and β-actin detected by RT-PCR. B. Gray intensity of αv band versus that of β-actin band intensity. C. Gray intensity of β3 band versus that of β-actin band. Different letters indicate significant difference (P<0.05).Fig.2 The mRNA expression of integrin αv, β3 and β-actin in bovine endometrial epithelial cells induced by different concentrations of progesterone

3 討論

注：A：αv、β3 和 β-actin RT-PCR 檢驗結(jié)果；B：αv相對于 β-actin 灰度分析；C：β3 相對于 β-actin 灰度分析。不同字母表示差異顯著(P<0.05)。圖3 不同濃度雌激素誘導(dǎo)牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞中 αv、β3、β-actin 的 mRNA 差異表達(dá)Note.A: The mRNA expressions of αv、β3 and β-actin were tested by RT-PCR. B: Quantification of αv band intensities versus β-actin band intensities. C: Quantification of β3 band intensities versus β-actin band intensities. Different letters mean significant difference (P<0.05).Fig.3 The mRNA expression of integrin αv, β3 and β-actin in bovine endometrial epithelial cells at different concentrations of estrogen

注：A：αv、β3 和β-actin RT-PCR 檢驗結(jié)果，從左至右的各組順序為0、Ⅰ。其中 Ⅰ是孕激素為 10-7 mg/mL 和雌激素為 10-10 mg/mL 實驗組。B：αv 相對于β-actin 灰度分析；C：β3 相對于β-actin 灰度分析。不同字母表示差異有顯著性(P<0.05)。圖4 雌激素及孕激素協(xié)同作用誘導(dǎo)牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞中αv、β3、β-actin的mRNA 的差異表達(dá)Note. A. The mRNA expressions of αv、β3 and β-actin were tested by RT-PCR.The order from left to right is 0, I. I is the experimental group that is progesterone 10-7 mg/mL and estrogen 10-10 mg/mL. B: Gray intensities of αv band versus β-actin band intensities. C: Gray intensities of β3 band versus β-actin band intensities. Different letters indicate significant differences (P<0.05).Fig.4 The mRNA expression of αv, β3 and β-actin in bovine endometrial epithelial cells induced by estrogen plus progesterone

哺乳動物的胚胎植入不僅需要早期胚胎獲得著床的能力，也需要子宮具有接受胚胎的能力，即胚胎必須與處于“容受”狀態(tài)的子宮在時空上完全同步時，胚胎才能使著床順利、正常妊娠以及分娩。所以子宮內(nèi)膜容受態(tài)的建立是胚胎順利著床的關(guān)鍵因素之一。迄今為止，國際上針對動物早期妊娠機(jī)理方面的研究已有許多報道，發(fā)現(xiàn)不同動物中參與早期妊娠精確調(diào)節(jié)的因素并不完全相同。目前針對小鼠、大鼠等典型實驗動物模型研究較多[19,21]，并陸續(xù)證明雌激素、孕激素、多種因子和酶類都參與各自體內(nèi)早期胚胎的精確調(diào)節(jié)[3,20-22]。但是，參與牛、羊等反芻家畜體內(nèi)胚胎精確調(diào)節(jié)的因素與這些實驗動物存在很大差別。因此，為了更好的探究激素對子宮內(nèi)膜容受態(tài)的影響，建立可靠的“體外誘導(dǎo)模型”顯得尤為重要，以期從體外角度進(jìn)一步提高反芻動物體外胚胎的移植妊娠率。

子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞的獲取采用先組織塊培養(yǎng)法后再進(jìn)行消化純化的方案。有研究學(xué)者認(rèn)為用組織塊培養(yǎng)法獲得的細(xì)胞中子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞的數(shù)量較多，需要多次純化才能得到純度較高的子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞，這樣一來流程就變得比較繁瑣[23]。但也有研究學(xué)者通過組織塊培養(yǎng)法所獲得的子宮內(nèi)膜原代細(xì)胞，質(zhì)量好效率高，而且操作簡單不易污染[24]。筆者將子宮內(nèi)膜細(xì)胞經(jīng)過純化后傳代得到形態(tài)良好且純度較高的子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞，并用于后續(xù)實驗。

整合素αvβ3因為參與上皮的蛻膜作用從而對胚胎的黏附有利，促進(jìn)著床的順利進(jìn)行，被認(rèn)為是“種植窗”開放的標(biāo)志物[25]。“種植窗”期的子宮內(nèi)膜中，整合素αvβ3受甾體激素的調(diào)控。程琰等[26]研究表明雌激素、孕激素能調(diào)節(jié)整合素αvβ3在人子宮內(nèi)膜中的表達(dá)。對于反芻動物，特別是牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞中整合素αvβ3與甾體類激素研究的相關(guān)報道很少。在本實驗中，外源性加入不同濃度孕激素能使牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞中整合素αvβ3的表達(dá)量升高，而外源性加入不同濃度雌激素均會抑制β3的表達(dá)。就目前研究而言，胚胎著床前孕激素對子宮內(nèi)膜中整合素αvβ3的表達(dá)有誘導(dǎo)促進(jìn)作用，而雌激素則有相反作用。宋鳳麗等[27]用雌激素單獨作用人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞時，整合素β3 mRNA 及蛋白的表達(dá)顯著下降；而孕激素單獨應(yīng)用對整合素β3表達(dá)無明顯影響。由此可見，整合素αvβ3的分泌是受雌激素和孕激素影響的。

以往的研究證實了在“種植窗”期，孕激素能誘導(dǎo)整合素在子宮內(nèi)膜上的表達(dá)，雌激素則抑制其表達(dá)，雌、孕激素同時能對整合素αvβ3產(chǎn)生周期性表達(dá)。楊海燕等[28]研究表明隨子宮內(nèi)膜分泌期的推進(jìn)，整合素αvβ3及其配體OPN的表達(dá)量也逐漸表達(dá)完全。在雌、孕激素協(xié)同組中，外源性加入10-7mg/mL孕激素以及10-10mg/mL雌激素能促進(jìn)整合素αvβ3的表達(dá)量上調(diào)。Raheem KA等[29]用10 ng/mL孕酮和100 pg/mL雌激素同時作用于綿羊子宮內(nèi)膜上皮，發(fā)現(xiàn)能使MUC-1表達(dá)含量上調(diào)，且差異顯著。Apparao KB等[30]研究表明雌激素單獨作用可抑制整合素αvβ3的配體OPN的表達(dá)，但孕、雌激素聯(lián)合使用卻可增強其表達(dá)。這些結(jié)果都為體外誘導(dǎo)體系提高反芻動物體外胚胎的移植妊娠率提供了新的參考依據(jù)。

總而言之，子宮容受性的建立非常繁瑣復(fù)雜，建立過程中涉及無數(shù)基因的表達(dá)與調(diào)控。因此，只有明確子宮內(nèi)膜容受性的標(biāo)志物及其表達(dá)規(guī)律，了解其調(diào)控機(jī)制才能更好的解決體外胚胎移植妊娠率普遍偏低的問題。本實驗主要集中于在胚胎著床前，研究雌、孕激素對子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞中整合素αvβ3基因的表達(dá)差異及在子宮內(nèi)膜容受態(tài)中的聯(lián)系。本實驗的研究結(jié)果為牛子宮容受態(tài)的研究提供了一定的依據(jù)及體外研究模型，同時也證實整合素αvβ3可以作為評判牛子宮容受態(tài)的一個標(biāo)記基因。

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