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    雌、孕激素對(duì)牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞αvβ3體外誘導(dǎo)差異表達(dá)的影響

    2018-03-06 08:11:46詹同彤潘興乾王彥平楊健陳超磊麻柱劉林倪和民王相國(guó)齊曉龍盛熙暉劉云海郭勇

    詹同彤,潘興乾,王彥平,楊健,陳超磊,麻柱,劉林,倪和民 王相國(guó),齊曉龍,盛熙暉,劉云海,郭勇*

    (1. 北京農(nóng)學(xué)院動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,北京 102206; 2. 北京奶牛中心,北京 100020)

    Conflict of interest statement: We declare that we have no conflict of interest statement.

    已知哺乳動(dòng)物胚胎著床失敗,大約有1/3是由于胚胎質(zhì)量低劣所造成,另有2/3則由于子宮內(nèi)膜容受性不足所引起[1]。動(dòng)物早期胚胎在植入前與子宮之間會(huì)有一個(gè)識(shí)別的過(guò)程。擁有著床能力、正常發(fā)育的胚胎必須同處于接受胚胎到來(lái)狀態(tài)的子宮在時(shí)空上保持完全一致,著床才能順利進(jìn)行并起始正常妊娠[2-3]。子宮內(nèi)膜容受態(tài)的建立過(guò)程涉及多種基因的表達(dá),如白血病抑制因子(LIF)、表皮生長(zhǎng)因子(EGF)、粘蛋白1(MUC-l)、整合素(integrin)、Hoxa10和Hoxa11基因等,這些調(diào)控基因能與早期胚胎在特定時(shí)、空上完成同步表達(dá),使激活態(tài)的胚胎與處于容受態(tài)的子宮進(jìn)行“精確對(duì)話”。

    整合素有調(diào)控著床和囊胚侵入的功能最早是在人類(lèi)的子宮內(nèi)膜實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)的[4-6],之后逐漸在綿羊和豬的子宮內(nèi)膜細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了整合素的表達(dá)[7-8]。人們發(fā)現(xiàn)整合素的部分亞型在人子宮內(nèi)膜細(xì)胞中均存在不同程度的表達(dá),其中,整合素αvβ3的表達(dá)量會(huì)隨著子宮容受態(tài)的建立而顯著上升[9-11]。2002年,MacIntyre等[12]的研究表明整合素表達(dá)于植入期牛子宮胚胎的界面及整個(gè)妊娠期的胎盤(pán)。Zeiler等[13]在研究中證實(shí)牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞可表達(dá)整合素αvβ3。雖然在反芻動(dòng)物子宮內(nèi)膜細(xì)胞中檢測(cè)到了整合素,但對(duì)其表達(dá)規(guī)律和功能機(jī)制尚不明確,因此,其是否是子宮容受態(tài)的標(biāo)志還有待進(jìn)一步研究。

    孕激素(P4)和雌激素(雌二醇,E2)在調(diào)控子宮內(nèi)膜容受態(tài)和胚胎發(fā)育同步化的過(guò)程中各自發(fā)揮作用且彼此相互協(xié)調(diào)。排卵前有足夠的雌激素起到刺激性作用以及排卵后孕激素調(diào)節(jié)容受性相關(guān)因子的表達(dá),是建立子宮內(nèi)膜容受性的必要條件[14-15]。研究證實(shí),孕激素通過(guò)自分泌途徑直接作用于子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞的孕激素受體PR,從而促進(jìn)整合素 αvβ3 的表達(dá);通過(guò)旁分泌途徑間接地刺激下游基因轉(zhuǎn)錄,誘導(dǎo)產(chǎn)生EGF或HB-EGF;EGF或HB-EGF再作用于子宮內(nèi)膜上皮中各自相應(yīng)受體,產(chǎn)生整合素αvβ3及其配體OPN[16]。已有研究表明,孕激素對(duì)子宮內(nèi)膜表達(dá)整合素有誘導(dǎo)性作用,而雌激素則相反[17]。此外,孕激素在調(diào)控子宮內(nèi)膜整合素αvβ3及OPN的表達(dá),比雌激素對(duì)二者的調(diào)控更具有重要的作用[18]。

    整合素αvβ3基因在反芻動(dòng)物子宮內(nèi)膜容受性調(diào)節(jié)中的研究較少,對(duì)其表達(dá)調(diào)控機(jī)理尚不明了。因此本實(shí)驗(yàn)主要研究目的是在孕激素、雌激素單獨(dú)或相互協(xié)同下,分析子宮上皮中整合素αvβ3基因體外誘導(dǎo)差異表達(dá)的變化及作用機(jī)制,探討孕激素、雌激素、整合素αvβ3在牛子宮容受態(tài)中的聯(lián)系及表達(dá)意義,為牛子宮容受態(tài)提供體外研究模型,也為整合素αvβ3是否能作為牛子宮容受態(tài)標(biāo)記基因提供參考。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 子宮組織

    本實(shí)驗(yàn)選取荷斯坦奶牛子宮組織,取自河北省大廠縣屠宰場(chǎng)。子宮離體后清洗干凈,于37℃的生理鹽水中保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.1.2 試劑與儀器

    Gibco公司:基礎(chǔ)培養(yǎng)液 DMEM-F12、胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)、磷酸緩沖液DPBS;Sigma公司:胰蛋白酶(TE)、TritonX-100、水溶性孕酮、雌二醇;Abcam?公司:角蛋白一抗、熒光二抗;北京百泰克生物技術(shù)有限公司:2× power Taq PCR MasterMix;北京化工廠:氯仿、異丙醇、無(wú)水乙醇。

    二氧化碳培養(yǎng)箱(Thermo Scientific Forma 371)、4孔板;Olympus公司:倒置顯微鏡;北京百晶生物:電泳槽、電泳儀電源;Bratt:手掌離心機(jī);西德:電子天平。

    1.2 方法

    1.2.1 牛子宮內(nèi)膜組織的分離、原代培養(yǎng)

    實(shí)驗(yàn)動(dòng)物屠宰后,采集子宮時(shí)要注意進(jìn)行無(wú)菌操作。在操作間里,反復(fù)清洗牛子宮至無(wú)血水。選取一段子宮角,展開(kāi)后用鑷子等器械剝離出含有脂肪的子宮內(nèi)膜層,剔除脂肪并得到薄且透明的組織,剪成糜狀后反復(fù)清洗組織懸液數(shù)次。

    取少量懸液將其均勻接種至6 cm的培養(yǎng)皿中,搖勻盤(pán)中的組織塊,加入適量的 DMEM-F12(20 %FBS)濕潤(rùn)組織塊,最后在37℃、濃度為5%的CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。每天應(yīng)細(xì)心察看器皿中有組織塊的區(qū)域,保證每48 h等量換液。

    1.2.2 牛子宮內(nèi)膜細(xì)胞傳代培養(yǎng)與純化

    細(xì)胞長(zhǎng)到90%左右時(shí),用胰酶進(jìn)行消化傳代。先吸去培養(yǎng)液,用DPBS清洗,后加入1 mL胰酶,放入培養(yǎng)箱中消化10~15 min,當(dāng)在顯微鏡下發(fā)現(xiàn)細(xì)胞變圓時(shí)加入DMEM-F12(10% FBS)培養(yǎng)液終止消化。隨后移入1.5 mL EP 管中離心,離心后傳到新的培養(yǎng)皿中,放入培養(yǎng)箱,每48 h換一次培養(yǎng)液。

    采用差時(shí)消化的方法進(jìn)行純化。先吸去培養(yǎng)液,用DPBS清洗,加入胰酶,當(dāng)細(xì)胞變圓、漂浮時(shí),加入DMEM-F12(10% FBS)培養(yǎng)液終止消化。棄去液體,再加入新鮮培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng),每48 h換一次培養(yǎng)液??筛鶕?jù)細(xì)胞的生長(zhǎng)情況進(jìn)行多次純化,直到子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞純度較高時(shí)即可。

    1.2.3 牛子宮內(nèi)膜細(xì)胞的凍存與復(fù)蘇

    子宮內(nèi)膜培養(yǎng)中可選擇凍存?zhèn)溆?。凍存過(guò)程的消化過(guò)程同上,離心后加入凍存液,并轉(zhuǎn)入凍存管中。在4℃冰箱中放10 min,-20℃中放20 min,-80℃過(guò)夜,第二天放入液氮罐中長(zhǎng)期保存。

    進(jìn)行細(xì)胞復(fù)蘇時(shí)應(yīng)先將水溫度調(diào)至37℃,將細(xì)胞從液氮罐中取出后在空中輕晃凍存管約10 s,隨后放入水浴鍋中。待液體融化后移入1.5 mL EP管中離心,離心后加入新鮮的DMEM-F12 (10% FBS)培養(yǎng)液,混勻接種到四孔板中。當(dāng)子宮內(nèi)膜細(xì)胞鋪滿約80%時(shí)即可進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。若細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中成纖維細(xì)胞長(zhǎng)得較多時(shí),則要進(jìn)行純化處理。

    1.2.4 不同濃度孕酮、雌激素、以及孕酮與雌激素協(xié)同作用下子宮內(nèi)膜細(xì)胞的收集與保存

    外源性添加孕酮濃度選取10-5、10-6、10-7、10-8、10-9、10-10mg/mL;外源性添加雌激素濃度選取10-8、10-9、10-10、10-11、10-12mg/mL;外源性添加雌、孕激素時(shí)選取10-7mg/mL孕激素和10-10mg/mL雌激素。

    在實(shí)驗(yàn)前,子宮內(nèi)膜細(xì)胞需要無(wú)血清饑餓48 h,再用不含血清且有不同濃度孕酮、不同濃度雌二醇、以及含有10-7mg/mL孕酮和10-10mg/mL雌二醇的DMEM-F12培養(yǎng)24 h。棄去廢液,用DPBS清洗,細(xì)胞消化后移入新的EP管中,-80℃保存待提RNA。

    1.2.5 子宮內(nèi)膜細(xì)胞總RNA的提取及相關(guān)基因表達(dá)的檢測(cè)

    實(shí)驗(yàn)引物由英濰捷基公司合成,引物相關(guān)參數(shù)見(jiàn)表1。子宮內(nèi)膜細(xì)胞總RNA的提取后以20 μL M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系,按照總RNA 1 μg反轉(zhuǎn)錄體系添加所需物質(zhì)合成cDNA,PCR擴(kuò)增后電泳,在凝膠成像系統(tǒng)下觀察,拍照。

    1.3 數(shù)據(jù)分析和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

    用Image J軟件對(duì)膠圖進(jìn)行灰度值分析,并用SPSS 22.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析,P<0.05代表數(shù)據(jù)間差異有顯著性。

    表1 引物相關(guān)參數(shù)Tab.1 Parameters of the primers

    2 結(jié)果

    2.1 正常傳代牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞

    應(yīng)用組織塊培養(yǎng)法對(duì)牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞進(jìn)行原代培養(yǎng)(圖1A)。由于原代培養(yǎng)的子宮細(xì)胞中含有成纖維細(xì)胞,所以需要對(duì)其進(jìn)行純化處理。圖1B中箭頭所指為多次純化后的牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞,如圖可見(jiàn),細(xì)胞形態(tài)較好,可肉眼看見(jiàn)大理石紋的上皮細(xì)胞,而且數(shù)量在不斷增多,可進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

    2.2 不同濃度孕酮誘導(dǎo)牛子宮內(nèi)膜細(xì)胞中整合素αvβ3的差異表達(dá)

    在有外源性孕激素添加時(shí),整合素αvβ3的mRNA表達(dá)量均有不同程度的提高,且均在10-7mg/mL時(shí)達(dá)到最高(圖2,P<0.05)。

    2.3 不同濃度雌激素誘導(dǎo)牛子宮內(nèi)膜細(xì)胞中整合素αvβ3的差異表達(dá)

    隨著外源性雌激素濃度的添加,αv的mRNA表達(dá)量不斷增加,在10-10mg/mL時(shí)表達(dá)量最高(圖3 A和B,P<0.05);β3的表達(dá)量逐漸降低,其中在10-10mg/mL時(shí)表達(dá)量最低(圖3 A和C,P<0.05)。

    2.4 孕酮與雌激素共同誘導(dǎo)牛子宮內(nèi)膜細(xì)胞中整合素αvβ3的差異表達(dá)

    在有外源性10-7mg/mL孕激素和10-10mg/mL雌激素添加時(shí),整合素αv的mRNA表達(dá)量顯著高于對(duì)照組(圖4 A和B,P<0.05);整合素β3的mRNA表達(dá)量亦高于對(duì)照組,但差異無(wú)顯著性(圖4 A和C,P>0.05)。

    注:A:原代牛子宮內(nèi)膜培養(yǎng)第5天;B:純化后的傳代牛子宮內(nèi)膜細(xì)胞。圖1 組織塊培養(yǎng)法獲得的牛子宮內(nèi)膜細(xì)胞(4×10)Note. A. A piece of primary bovine endometrial tissue was cultured for 5 days. B. Purified bovine endometrial cells after passage.Fig.1 Bovine endometrial cells obtained by explant culture (4×10)

    注:A: αv、β3 和β-actin RT-PCR 檢驗(yàn)結(jié)果; B: αv 相對(duì)于β-actin 灰度分析; C: β3 相對(duì)于β-actin 灰度分析。不同字母表示差異有顯著性(P<0.05)。圖2 不同濃度孕激素誘導(dǎo)牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞中 αv、β3、β-actin 的 mRNA 差異表達(dá)Note. A. The mRNA expressions of αv, β3 and β-actin detected by RT-PCR. B. Gray intensity of αv band versus that of β-actin band intensity. C. Gray intensity of β3 band versus that of β-actin band. Different letters indicate significant difference (P<0.05).Fig.2 The mRNA expression of integrin αv, β3 and β-actin in bovine endometrial epithelial cells induced by different concentrations of progesterone

    3 討論

    注:A:αv、β3 和 β-actin RT-PCR 檢驗(yàn)結(jié)果;B:αv相對(duì)于 β-actin 灰度分析;C:β3 相對(duì)于 β-actin 灰度分析。不同字母表示差異顯著(P<0.05)。圖3 不同濃度雌激素誘導(dǎo)牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞中 αv、β3、β-actin 的 mRNA 差異表達(dá)Note.A: The mRNA expressions of αv、β3 and β-actin were tested by RT-PCR. B: Quantification of αv band intensities versus β-actin band intensities. C: Quantification of β3 band intensities versus β-actin band intensities. Different letters mean significant difference (P<0.05).Fig.3 The mRNA expression of integrin αv, β3 and β-actin in bovine endometrial epithelial cells at different concentrations of estrogen

    注:A:αv、β3 和β-actin RT-PCR 檢驗(yàn)結(jié)果,從左至右的各組順序?yàn)?、Ⅰ。其中 Ⅰ是孕激素為 10-7 mg/mL 和雌激素為 10-10 mg/mL 實(shí)驗(yàn)組。B:αv 相對(duì)于β-actin 灰度分析;C:β3 相對(duì)于β-actin 灰度分析。不同字母表示差異有顯著性(P<0.05)。圖4 雌激素及孕激素協(xié)同作用誘導(dǎo)牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞中αv、β3、β-actin的mRNA 的差異表達(dá)Note. A. The mRNA expressions of αv、β3 and β-actin were tested by RT-PCR.The order from left to right is 0, I. I is the experimental group that is progesterone 10-7 mg/mL and estrogen 10-10 mg/mL. B: Gray intensities of αv band versus β-actin band intensities. C: Gray intensities of β3 band versus β-actin band intensities. Different letters indicate significant differences (P<0.05).Fig.4 The mRNA expression of αv, β3 and β-actin in bovine endometrial epithelial cells induced by estrogen plus progesterone

    哺乳動(dòng)物的胚胎植入不僅需要早期胚胎獲得著床的能力,也需要子宮具有接受胚胎的能力,即胚胎必須與處于“容受”狀態(tài)的子宮在時(shí)空上完全同步時(shí),胚胎才能使著床順利、正常妊娠以及分娩。所以子宮內(nèi)膜容受態(tài)的建立是胚胎順利著床的關(guān)鍵因素之一。迄今為止,國(guó)際上針對(duì)動(dòng)物早期妊娠機(jī)理方面的研究已有許多報(bào)道,發(fā)現(xiàn)不同動(dòng)物中參與早期妊娠精確調(diào)節(jié)的因素并不完全相同。目前針對(duì)小鼠、大鼠等典型實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型研究較多[19,21],并陸續(xù)證明雌激素、孕激素、多種因子和酶類(lèi)都參與各自體內(nèi)早期胚胎的精確調(diào)節(jié)[3,20-22]。但是,參與牛、羊等反芻家畜體內(nèi)胚胎精確調(diào)節(jié)的因素與這些實(shí)驗(yàn)動(dòng)物存在很大差別。因此,為了更好的探究激素對(duì)子宮內(nèi)膜容受態(tài)的影響,建立可靠的“體外誘導(dǎo)模型”顯得尤為重要,以期從體外角度進(jìn)一步提高反芻動(dòng)物體外胚胎的移植妊娠率。

    子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞的獲取采用先組織塊培養(yǎng)法后再進(jìn)行消化純化的方案。有研究學(xué)者認(rèn)為用組織塊培養(yǎng)法獲得的細(xì)胞中子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞的數(shù)量較多,需要多次純化才能得到純度較高的子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞,這樣一來(lái)流程就變得比較繁瑣[23]。但也有研究學(xué)者通過(guò)組織塊培養(yǎng)法所獲得的子宮內(nèi)膜原代細(xì)胞,質(zhì)量好效率高,而且操作簡(jiǎn)單不易污染[24]。筆者將子宮內(nèi)膜細(xì)胞經(jīng)過(guò)純化后傳代得到形態(tài)良好且純度較高的子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞,并用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

    整合素αvβ3因?yàn)閰⑴c上皮的蛻膜作用從而對(duì)胚胎的黏附有利,促進(jìn)著床的順利進(jìn)行,被認(rèn)為是“種植窗”開(kāi)放的標(biāo)志物[25]?!胺N植窗”期的子宮內(nèi)膜中,整合素αvβ3受甾體激素的調(diào)控。程琰等[26]研究表明雌激素、孕激素能調(diào)節(jié)整合素αvβ3在人子宮內(nèi)膜中的表達(dá)。對(duì)于反芻動(dòng)物,特別是牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞中整合素αvβ3與甾體類(lèi)激素研究的相關(guān)報(bào)道很少。在本實(shí)驗(yàn)中,外源性加入不同濃度孕激素能使牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞中整合素αvβ3的表達(dá)量升高,而外源性加入不同濃度雌激素均會(huì)抑制β3的表達(dá)。就目前研究而言,胚胎著床前孕激素對(duì)子宮內(nèi)膜中整合素αvβ3的表達(dá)有誘導(dǎo)促進(jìn)作用,而雌激素則有相反作用。宋鳳麗等[27]用雌激素單獨(dú)作用人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞時(shí),整合素β3 mRNA 及蛋白的表達(dá)顯著下降;而孕激素單獨(dú)應(yīng)用對(duì)整合素β3表達(dá)無(wú)明顯影響。由此可見(jiàn),整合素αvβ3的分泌是受雌激素和孕激素影響的。

    以往的研究證實(shí)了在“種植窗”期,孕激素能誘導(dǎo)整合素在子宮內(nèi)膜上的表達(dá),雌激素則抑制其表達(dá),雌、孕激素同時(shí)能對(duì)整合素αvβ3產(chǎn)生周期性表達(dá)。楊海燕等[28]研究表明隨子宮內(nèi)膜分泌期的推進(jìn),整合素αvβ3及其配體OPN的表達(dá)量也逐漸表達(dá)完全。在雌、孕激素協(xié)同組中,外源性加入10-7mg/mL孕激素以及10-10mg/mL雌激素能促進(jìn)整合素αvβ3的表達(dá)量上調(diào)。Raheem KA等[29]用10 ng/mL孕酮和100 pg/mL雌激素同時(shí)作用于綿羊子宮內(nèi)膜上皮,發(fā)現(xiàn)能使MUC-1表達(dá)含量上調(diào),且差異顯著。Apparao KB等[30]研究表明雌激素單獨(dú)作用可抑制整合素αvβ3的配體OPN的表達(dá),但孕、雌激素聯(lián)合使用卻可增強(qiáng)其表達(dá)。這些結(jié)果都為體外誘導(dǎo)體系提高反芻動(dòng)物體外胚胎的移植妊娠率提供了新的參考依據(jù)。

    總而言之,子宮容受性的建立非常繁瑣復(fù)雜,建立過(guò)程中涉及無(wú)數(shù)基因的表達(dá)與調(diào)控。因此,只有明確子宮內(nèi)膜容受性的標(biāo)志物及其表達(dá)規(guī)律,了解其調(diào)控機(jī)制才能更好的解決體外胚胎移植妊娠率普遍偏低的問(wèn)題。本實(shí)驗(yàn)主要集中于在胚胎著床前,研究雌、孕激素對(duì)子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞中整合素αvβ3基因的表達(dá)差異及在子宮內(nèi)膜容受態(tài)中的聯(lián)系。本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果為牛子宮容受態(tài)的研究提供了一定的依據(jù)及體外研究模型,同時(shí)也證實(shí)整合素αvβ3可以作為評(píng)判牛子宮容受態(tài)的一個(gè)標(biāo)記基因。

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